丁斐斐 李長(zhǎng)紅 陳炯 張琪

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211）

香魚精氨酸酶II基因的cDNA克隆及其表達(dá)與鰻弧菌感染的相關(guān)性

丁斐斐 李長(zhǎng)紅 陳炯 張琪

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211）

精氨酸酶II（arginase II，Arg-II）是精氨酸酶的一種，不僅可以參與機(jī)體尿素循環(huán)，還與機(jī)體病理過程密切相關(guān)。通過香魚（Plecoglossus altivelis）單核/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得香魚Arg-II基因全長(zhǎng)cDNA序列，結(jié)果表明，Arg-II基因由4 707個(gè)核苷酸組成，包含一個(gè)大的開放閱讀框，編碼348個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為38.09 kD，等電點(diǎn)為6.15。氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果顯示，香魚Arg-Ⅱ具有典型的Arg-Ⅱ結(jié)構(gòu)特征，與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）Arg-Ⅱ同源性最高，為85.3%；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，魚類Arg-Ⅱ形成一個(gè)大簇，香魚Arg-Ⅱ與虹鱒Arg-Ⅱ進(jìn)行相關(guān)性最高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitive real-time PCR，qRTPCR）結(jié)果顯示，香魚Arg-Ⅱ基因mRNA主要在健康香魚肝、腦、頭腎和單核/巨噬細(xì)胞中表達(dá)；鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染后，香魚肝、腦、頭腎和單核/巨噬細(xì)胞Arg-Ⅱ基因mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)。綜上，香魚Arg-Ⅱ基因的表達(dá)與鰻弧菌感染緊密相關(guān)，揭示其可能在魚類抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

香魚；精氨酸酶II；鰻弧菌；單核/巨噬細(xì)胞；表達(dá)

精氨酸酶（arginase）是在細(xì)菌、酵母、植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中普遍存在的酶。在植物和排氨動(dòng)物中精氨酸酶位于線粒體，而在排尿素動(dòng)物中，精氨酸酶位于細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的精氨酸酶是同功酶，由不同的基因精氨酸酶I（arginase I，Arg-I）和精氨酸酶II（arginase II，Arg-II）編碼［1］。Arg-I和Arg-II的基本功能是在機(jī)體尿素循環(huán)中將L-精氨酸水解成L-鳥氨酸和尿素，但二者在免疫系統(tǒng)中也有表達(dá)，并且在哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，參與炎癥反應(yīng)的各個(gè)階段［2］。在巨噬細(xì)胞中，Arg-I和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）參與L-精氨酸/NO代謝，分別與M1和M2型巨噬細(xì)胞表型有關(guān)，被廣泛用作鑒定M1和M2型巨噬細(xì)胞的分子標(biāo)記［3］。與Arg-I相比，Arg-II在巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答中的功能相關(guān)的研究報(bào)道很少，普遍認(rèn)為它具有與Arg-II相同的功能。然而，越來越多的證據(jù)表明，Arg-I和Arg-II在巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中具有不同的作用。例如，在小鼠中，LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Arg-II mRNA的表達(dá)，但不能誘導(dǎo)Arg-I mRNA的表達(dá)［1］。

目前，Arg-I和Arg-II基因在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［4，5］和鯉魚（Cyprinus carpio）［6］等少數(shù)硬骨魚類中被克隆和鑒定。在虹鱒中，虹鱒幼魚絕食6周后，肝組織精氨酸酶活性明顯增加，并且Arg-II基因mRNA的表達(dá)量也明顯增加，但Arg-I基因mRNA的表達(dá)量無明顯變化，因此，肝組織Arg-II基因mRNA的表達(dá)量增加可能導(dǎo)致精氨酸酶活性增加［4］；而且兩個(gè)虹鱒品系感染腦粘體蟲（Myxobolus cerebralis）后，T和H品系分別在感染后2 h 和8 d時(shí)Arg-II基因mRNA的表達(dá)量均顯著上調(diào)［5］；在鯉魚中，環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine mono phosphate，cAMP）刺激后頭腎來源巨噬細(xì)胞中的精氨酸酶活性顯著增加，而且cAMP刺激能誘導(dǎo)Arg-II基因mRNA的表達(dá)，但Arg-I基因mRNA的表達(dá)也不受影響［6］，揭示魚類Arg-II可能具有與哺乳動(dòng)物Arg-II相似的功能。

香魚（Plecoglossus altivelis）是東亞地區(qū)中國(guó)、日本和朝鮮等國(guó)特有的一種小型名貴經(jīng)濟(jì)魚類。它體色美、味清香、肉質(zhì)細(xì)膩，在國(guó)際上被譽(yù)為“淡水魚之王”，深受消費(fèi)者青睞。近年來，由于捕撈強(qiáng)度增大、水利設(shè)施建設(shè)以及環(huán)境污染日益嚴(yán)重等原因，野生香魚已瀕臨滅絕。為了滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)尤其是國(guó)際市場(chǎng)對(duì)香魚的需求，香魚人工養(yǎng)殖在中國(guó)大陸也迅速興起。目前，香魚的人工養(yǎng)殖在沿海各省均有開展，主要集中于浙江、福建、江蘇、山東、遼寧等地，養(yǎng)殖的香魚大部分出口日本和歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，效益十分可觀。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，由傳染性疾病引起的養(yǎng)殖香魚大量死亡事件時(shí)有發(fā)生，給中國(guó)沿海地區(qū)的香魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失［7］。因此，有必要從魚類自身免疫調(diào)控入手，對(duì)其抗細(xì)菌感染的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。本研究通過香魚單核/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得香魚Arg-II基因的cDNA序列，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)及進(jìn)化關(guān)系分析，并明確其mRNA的組織表達(dá)特征，隨后檢測(cè)鰻弧菌感染后香魚重要組織及單核/巨噬細(xì)胞中Arg-II基因mRNA的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

健康香魚（20-25 g）購(gòu)自寧波水產(chǎn)大世界，規(guī)格均一、無病無傷。充氣運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)，暫養(yǎng)水溫（20±1）℃，期間不間斷充氣，早晚各換水一次，不投喂餌料。

鰻弧菌分離株ayu-H080701分離自患弧菌病香魚［7］，由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNAiso試劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、SYBR Premix Ex Taq 試劑盒和Ex Taq DNA 聚合酶均購(gòu)自 TaKaRa 公司（日本）。Ficoll購(gòu)自Invitrogen公司（上海），RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FCS）購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)）。引物合成及序列測(cè)定由英維捷基貿(mào)易有限公司合成（上海）。

1.2 方法

1.2.1 香魚Arg-II基因cDNA序列的獲得及序列分析 采用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)香魚頭腎來源的單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從測(cè)序結(jié)果中篩選Arg-II相關(guān)Unigenes，通過特異性引物PCR擴(kuò)增cDNA和測(cè)序驗(yàn)證序列準(zhǔn)確性。同源蛋白序列比對(duì)采用BLASTP 軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/）；信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用SignalP 4.1軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；蛋白分子量大小及等電點(diǎn)測(cè)定采用Compute pI/Mw程序（http：//web.expasy.org/compute_pi/），多重序列比對(duì)采用ClustalW軟件（http：//clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）；系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 5.0軟件［8］；線粒體靶向肽預(yù)測(cè)采用MitoProt軟件（http：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot. html）。氨基酸序列多重比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建所用序列信息詳見表1。

表1 氨基酸序列多重比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建所用序列

1.2.2 樣品采集

1.2.2.1 組織樣品采集 香魚暫養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取5尾，分別取肝、脾、腎、頭腎、腦、心、鰓、肌肉和腸組織立即投入液氮保存，隨后轉(zhuǎn)于-70℃超低溫冰箱保存，收集的組織作為健康香魚樣品。其余香魚分為對(duì)照組和注射組用于鰻弧菌感染實(shí)驗(yàn)，鰻弧菌感染香魚的實(shí)驗(yàn)過程及感染劑量參考楊旦陽(yáng)等［9］的方法，具體步驟如下。注射組香魚以1.0×104CFU/尾的濃度腹腔注射鰻弧菌菌懸液，對(duì)照組香魚注射等體積的無菌生理鹽水，于感染后4、8、12和24 h取肝、脾、腎、頭腎、腦和腸等組織，立即投入液氮中，隨后轉(zhuǎn)于-70℃超低溫冰箱保存。

1.2.2.2 香魚頭腎來源的單核/巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng) 將香魚麻醉，用無菌注射器從尾靜脈取血，然后快速取出頭腎，用無菌剪刀將頭腎剪碎置尼龍網(wǎng)內(nèi)，加入適量含2% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，用10 mL注射器活塞頭輕柔研磨頭腎組織，使頭腎細(xì)胞通過尼龍網(wǎng)進(jìn)入離心管中；采用Ficoll密度梯度離心法離心，棄上清，用含2% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，最后將細(xì)胞重懸于含2% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液鋪于直徑為35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，24℃過夜培養(yǎng)，PBS洗去非黏附細(xì)胞，然后向培養(yǎng)基中加入10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基。用姬姆薩染色后顯微鏡下觀察，確定95%的黏附細(xì)胞是單核/巨噬細(xì)胞。

1.2.2.3 鰻弧菌感染香魚單核/巨噬細(xì)胞 用PBS將鰻弧菌稀釋至合適濃度，按照感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為20∶1的比例接種至香魚單核/巨噬細(xì)胞中，對(duì)照組加入等體積的PBS，于感染后4、8、12和24 h時(shí)小心吸走培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后加入1 mL RNAiso試劑，室溫孵育5 min以裂解細(xì)胞，收集裂解液作為香魚單核/巨噬細(xì)胞樣品，保存于-70℃超低溫冰箱備用。

1.2.2.4 香魚Arg-II基因 mRNA的組織表達(dá)特征采用qRT-PCR測(cè)定健康香魚不同組織中Arg-II基因 mRNA的表達(dá)特征。參考黃左安等［10］的方法進(jìn)行總RNA抽提、第一鏈cDNA合成和qRT-PCR分析。根據(jù)香魚ArgⅡ基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)qRTPCR的檢測(cè)引物，預(yù)期擴(kuò)增片段為158 bp（表2）。以香魚β-actin基因作為內(nèi)參，預(yù)期的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為231 bp。以香魚各組織第一鏈cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，25 μL的擴(kuò)增體系包括：ddH2O 10 μL、SYBR Premix Ex Taq（2×）緩沖液12.5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA模板0.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在北京博奧生物芯片有限公司生產(chǎn)的晶芯RT-Cycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：94℃ 180 s（預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)）；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s（擴(kuò)增段，共40個(gè)循環(huán)）；94℃ 30 s，72℃ 60 s，95℃ 30 s（熔解段，1個(gè)循環(huán)）。qRT-PCR檢測(cè)時(shí)每個(gè)樣品重復(fù)3次，包括目的基因（Arg-II）和內(nèi)參基因（β-actin）。利用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-ΔΔCt對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，分析Arg-II基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量［11］。

1.2.3 感染鰻弧菌對(duì)香魚重要組織和單核/巨噬細(xì)胞Arg-II基因mRNA表達(dá)的影響 以鰻弧菌感染香魚的肝、脾、腎、頭腎、腦和腸等組織以及鰻弧菌體外感染的香魚單核/巨噬細(xì)胞cDNA為模板，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Arg-II基因mRNA的表達(dá)變化?？俁NA抽提、第一鏈cDNA合成和qRT-PCR分析見1.2.3。

表2 qRT-PCR所用引物

2 結(jié)果

2.1 香魚Arg-II基因cDNA序列分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和特異引物PCR擴(kuò)增測(cè)序揭示，香魚Arg-II基因cDNA序列長(zhǎng)4 707個(gè)核苷酸（Gen-Bank登錄號(hào)：KR018612），包含一個(gè)1 047 bp的大開放閱讀框架，推測(cè)編碼一個(gè)由348個(gè)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量為38.09 kD的蛋白，等電點(diǎn)為6.15，N-末端無信號(hào)肽序列。氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果（圖1）顯示，香魚Arg-II具有典型的Arg-II結(jié)構(gòu)特征，N-末端含由41個(gè)氨基酸組成的線粒體靶向肽，分子內(nèi)含4段精氨酸家族的特征性序列。

序列分析表明，香魚Arg-II與其它魚類Arg-II氨基酸序列同一性為81.6%-85.3%，其中與虹鱒Arg-II氨基酸序列同一性最高，達(dá)85.3%；與哺乳動(dòng)物、鳥類及兩棲動(dòng)物Arg-II的氨基酸序列同一性僅為51.2%-63.3%。系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）分析揭示，哺乳動(dòng)物、鳥類、兩棲類和魚類的Arg-II分別成簇，香魚Arg-II位于魚類Arg-II這一個(gè)大簇，且與虹鱒Arg-II進(jìn)化關(guān)系最近。

2.2 健康香魚Arg-II基因mRNA的組織表達(dá)特征

取健康香魚心、肝、脾、體腎、頭腎、鰓、腦、腸和肌肉等進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，香魚Arg-II基因擴(kuò)增產(chǎn)物為158 bp，內(nèi)參β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物為231 bp。結(jié)果（圖3）表明，健康香魚Arg-II基因mRNA主要在肝、腦和單核/巨噬細(xì)胞中表達(dá)，其次是頭腎、腸、體腎和脾，其他組織中微弱表達(dá)。

2.3 香魚Arg-II基因mRNA的表達(dá)與鰻弧菌感染的相關(guān)性

根據(jù)Arg-II基因在健康香魚組織中的表達(dá)特征，選取鰻弧菌感染的香魚肝、腦和頭腎組織，以及鰻弧菌感染的體外培養(yǎng)的頭腎來源單核/巨噬細(xì)胞，進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果（圖4）表明，香魚肝組織中Arg-II基因mRNA表達(dá)量在感染4 h時(shí)開始增加，8 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的5.2倍，12 h時(shí)略有降低，24 h時(shí)回復(fù)至對(duì)照組水平；頭腎組織中Arg-II基因mRNA表達(dá)量在感染8 h和12 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.97倍和2.38倍；腦組織中Arg-II基因mRNA的表達(dá)量在感染4 h時(shí)開始增加，12 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.79倍，隨后降低，24 h時(shí)與對(duì)照組無明顯差異；香魚頭腎來源單核/巨噬細(xì)胞在鰻弧菌感染后，Arg-II基因mRNA的表達(dá)量逐漸增加，12 h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照組的3.1倍，24 h略有降低，但仍顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的2.6倍。

3 討論

本研究通過香魚單核/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了Arg-II基因的全長(zhǎng)cDNA序列。序列分析表明，預(yù)測(cè)的香魚Arg-II蛋白氨基酸序列與其他物種Arg-II的結(jié)構(gòu)相似，N-末端包含一個(gè)線粒體靶向肽。Arg-II是線粒體蛋白，需要通過N-末端線粒體靶向肽進(jìn)入線粒體基質(zhì)。MitoProt軟件分析表明，硬骨魚類、兩棲類與哺乳動(dòng)物Arg-II N-末端線粒體靶向肽的長(zhǎng)度和序列上差異明顯，但有兩個(gè)共同特征，精氨酸、丙氨酸和絲氨酸等陽(yáng)離子氨基酸殘基含量豐富，天冬氨酸和谷氨酸等陰離子氨基酸殘基含量稀少［4］。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，魚類Arg-II獨(dú)立成簇，香魚與虹鱒Arg-II進(jìn)化相關(guān)性最高。組織差異特征分析表明，Arg-II基因在健康香魚各組織中分布廣泛，其中肝、腦和單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)量最高，這與虹鱒、鯉魚中的研究結(jié)果較為一致［4，6］。

圖1 香魚與其他物種Arg-II全長(zhǎng)氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果

圖2 基于Neighbor-Joining法構(gòu)建香魚和其他物種全長(zhǎng)Arg-II氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 健康香魚Arg-II基因mRNA的組織表達(dá)特征

在哺乳動(dòng)物中，Arg-II不僅參與機(jī)體尿素循環(huán)，還與機(jī)體病理過程密切相關(guān)。早期的研究表明，Arg-II基因是抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的肝X（liver X receptor）受體的直接靶標(biāo)，因此，它最初被認(rèn)為具有抗炎功能［12，13］。與哺乳動(dòng)物相比，硬骨魚類Arg-II的研究報(bào)道相對(duì)較少，已有的研究揭示，Arg-II可能與魚類免疫反應(yīng)密切相關(guān)。例如，在虹鱒中，虹腦粘體蟲感染后，品系T和H在感染后2 h和8 d時(shí)Arg-II基因mRNA表達(dá)量均顯著增加，分別增加了4倍和2.7倍［5］；在鯉魚中，cAMP處理后，頭腎來源巨噬細(xì)胞精氨酸酶活性顯著增加，Arg-II基因表達(dá)量在6 h達(dá)到最大，約為對(duì)照組的16倍［6］。本研究中，鰻弧菌腹腔注射香魚后，Arg-II mRNA表達(dá)在頭腎和單核/巨噬細(xì)胞中顯著上調(diào)，這與上述研究結(jié)果較為一致。同時(shí)，香魚肝和腦中Arg-II基因表達(dá)量也在鰻弧菌感染后顯著上調(diào)，揭示Arg-II與魚類病原感染引起的免疫應(yīng)答密切相關(guān)，可能通過激活巨噬細(xì)胞旁路激活途徑參與免疫反應(yīng)，但具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

香魚Arg-II基因cDNA序列與虹鱒Arg-II序列最相似。健康香魚中，Arg-II mRNA主要在肝、腦和單核/巨噬細(xì)胞中表達(dá)；鰻弧菌感染后，Arg-II mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，揭示Arg-II與香魚抗病原感染的免疫反應(yīng)緊密相關(guān)。

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圖4 鰻弧菌感染對(duì)香魚重要組織及單核/巨噬細(xì)胞Arg-II基因mRNA表達(dá)的影響

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（責(zé)任編輯 李楠）

cDNA Cloning of Arginase II Gene in Ayu（Plecoglossus altivelis）and the Correlation Between Its Expression and Vibrio anguillarum Infection

DING Fei-fei LI Chang-hong CHEN Jiong ZHANG Qi
（Biochemistry and Molecular Biology Laboratory，School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）

Arginase II（Arg-II）is one kind of arginases. Not only can it participates in the urea cycle， but also has close correlation with pathological process. Here， we determined the whole cDNA sequence of Arg-II gene of ayu（Plecoglossus altivelis）by de-novo transcriptome sequencing of ayu monocytes/macrophages. The results showed that the cDNA sequence of the Arg-II was 4707 nucleotides， containing a large open reading frame that encoded a protein of 348 amino acids with a deduced molecular mass of 38.09 kD and a theoretical isoelectric point（pI）of 6.15. Multiple sequence alignment of complete amino acid sequences showed that ayu Arg-II had the typical characters of Arg-II in animals. Sequence comparison showed that ayu Arg-II shared the highest amino acid sequence identity（85.3%）with that of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）. Phylogenetic tree analysis also confirmed that fish Arg-II formed a cluster， and ayu Arg-II was most closely related to that of rainbow trout. Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）analysis showed that the mRNA of ayu Arg-II mainly had the expression in liver， brain， head kidney and monocytes/macrophages. Upon Vibrio anguillarum infection， the mRNA expression of gene Arg-II significantly up-regulated in the liver， brain， head kidney and monocytes/macrophages. In summary， our present study revealed a tight relationship between the ayu Arg-II expression and V. anguillarum infection， suggesting that ayu Arg-II plays an important role in fish immune response against bacterial infection. This study provides a theoretical basis for studying the functions of fish Arg-II， and its molecular mechanism in regulating fish immune response to pathogens.

Plecoglossus altivelis；arginase II；Vibrio anguillarum；monocytes/macrophage；expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.014

2015-03-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31402333），浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ13C190002），高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20133305120008）

丁斐斐，女，研究方向：魚類分子免疫學(xué)；E-mail：dingfeifei14@163.com

李長(zhǎng)紅，女，研究方向：魚類分子免疫學(xué)；E-mail：lichanghong0716@163.com