李明霞潘和平閻萍吳曉云王英杰

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；3.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

牦牛GDF9和BMP15基因的克隆、表達(dá)分析及miRNA研究

李明霞1，2，3潘和平1閻萍2，3吳曉云2，3王英杰1，2，3

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；3.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

以牦牛GDF9和BMP15基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用PCR方法分別克隆出GDF9和BMP15的兩個(gè)外顯子片段，RT-PCR方法分析了GDF9和BMP15及靶定miRNA在各組織中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，克隆擴(kuò)增獲得外顯子區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。牦牛GDF9基因外顯子片段長(zhǎng)分別411 bp和1 082 bp，編碼453個(gè)氨基酸；BMP15基因外顯子片段長(zhǎng)分別為323 bp和802 bp，編碼372個(gè)氨基酸。GDF9編碼蛋白是親水蛋白，含有一個(gè)信號(hào)肽和15個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)；BMP15編碼蛋白是親水蛋白，不含信號(hào)肽，有6個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析牦牛GDF9和BMP15基因在不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果表明GDF9在卵巢和子宮中表達(dá)相對(duì)較高，且卵巢表達(dá)顯著高于其他組織，心、腎、胰和脾中無(wú)表達(dá)。BMP15僅在卵巢中表達(dá)。TargetScan預(yù)測(cè)靶定牦牛GDF9和BMP15基因的靶定miRNA，分析GDF9靶基因bta-miR-193a-3p和bta-miR-193b在心、脾、肺、腎和子宮中的表達(dá)量，結(jié)果顯示bta-miR-193a-3p脾中表達(dá)量顯著高于其他組織，但在心、肺和子宮中均不表達(dá)。bta-miR-193b在心和腎中沒(méi)檢測(cè)到表達(dá)，在肺中的表達(dá)量顯著低于脾和子宮中。

牦牛；GDF9；BMP15；miRNA

生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子9（Growth differentiation factor 9，GDF9）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（Bone morphogenetic protein 15，BMP15）都作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）超家族的成員，參與早期卵泡的生長(zhǎng)和分化。1978年TGF-β由Delarco和Todaro在研究病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，它因具有促進(jìn)單層培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化并形成克隆而得名，TGF-β是目前發(fā)現(xiàn)最大的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白家族［1］。其成員以自分泌和旁分泌的形式參與細(xì)胞生物活性的調(diào)節(jié)［2，3］。GDF9最早由Lee以TGF-β家族的保守區(qū)域?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆得到，采用Northern blotting在小鼠卵巢中檢測(cè)到mRNA表達(dá)［4］。而B(niǎo)MP15最早是在綿羊中發(fā)現(xiàn)的，Aaltonen［6］根據(jù)其基因的保守性首次克隆了小鼠的BMP15基因，后期以它為模板相繼得到了人、大鼠及羊的BMP15的序列［5］。Aaltonen在卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BMP15的特異性表達(dá)。研究初期認(rèn)為它們表達(dá)模式相似且僅在動(dòng)物卵巢組織特異性表達(dá)，后期經(jīng)深入研究發(fā)現(xiàn)不同物種表達(dá)定位存在不同。對(duì)牛羊的研究發(fā)現(xiàn)GDF9在睪丸和下丘腦組織中也表達(dá)，同時(shí)對(duì)人的研究顯示在非性腺組織也檢測(cè)到GDF9的表達(dá)。表明GDF9不僅在卵母細(xì)胞的排卵過(guò)程中表達(dá)［7，8］。后期有研究者對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)GDF9在睪丸和下丘腦組織中也表達(dá)，同時(shí)對(duì)人的研究顯示在非性腺組織也檢測(cè)到GDF9的表達(dá)。BMP15也不僅在卵巢中表達(dá)，在人［6］和牛［9］睪丸及小鼠［10］垂體中均檢測(cè)到微量表達(dá)。隨著對(duì)GDF9和BMP15的深入研究表明這些生長(zhǎng)因子可能潛在調(diào)節(jié)垂體和睪丸的功能，參與調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖過(guò)程［11］。

miRNA是一類(lèi)非編碼小分子RNA，長(zhǎng)約20 nt，通過(guò)結(jié)合靶mRNA的3' UTR導(dǎo)致其或抑制翻譯，參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后過(guò)程，進(jìn)而參與生命進(jìn)程。有研究表明，miRNA在卵巢及睪丸組織中參與調(diào)控。2007年Ro等［12］小鼠卵巢中克隆得到122個(gè)miRNA，并對(duì)其進(jìn)行半熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)其在卵巢和睪丸組織中均表達(dá)，而后發(fā)現(xiàn)包含miR-ov15和miR-ov9共4個(gè)miRNA在卵巢中特異性表達(dá)。2008年Otsuka［13］發(fā)現(xiàn)Dicer（d/d）小鼠不育，將正常小鼠卵巢移植到此小鼠上可得到后代，將Dicer（d/d）小鼠卵巢移植到正常小鼠中無(wú)懷孕現(xiàn)象，說(shuō)明卵巢發(fā)育是影響繁殖的關(guān)鍵因素。對(duì)Dicer（d/d）小鼠研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p和let-7b影響黃體血管長(zhǎng)度和數(shù)量，將其注射到Dicer（d/d）小鼠中可恢復(fù)黃體血管生成，但不能使胎兒發(fā)育，可能還有其他miRNA共同參與調(diào)節(jié)。Tang等［14］在Dicer基因敲除小鼠卵泡中檢測(cè)到有些mRNA和蛋白質(zhì)高分度表達(dá)，說(shuō)明敲除Dicer基因可減少成熟miRNA產(chǎn)生，可減少靶mRNA的降解和翻譯抑制作用。Byrne［15］研究發(fā)現(xiàn)miR-125a可靶調(diào)節(jié)Ped基因調(diào)控小鼠胚胎發(fā)育。

牦牛作為高寒地區(qū)的特有牛種，主要分布于青海、西藏、四川、甘肅和云南等高寒草原區(qū)［16］。牦牛具有適應(yīng)能力強(qiáng)，耐粗飼，耐寒冷等特點(diǎn)，從而可在含氧量低，牧草季節(jié)短，氣候寒冷的條件下生存繁衍，它也是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的物種，可為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤?、奶、皮及役力等生活生產(chǎn)資料。

牦牛屬于單胎動(dòng)物，一胎一犢且世代間隔較長(zhǎng)的特點(diǎn)極大地限制了牦牛的數(shù)量，以期采用常規(guī)的遺傳選擇法進(jìn)行優(yōu)化提高雙胎率進(jìn)展緩慢。加大與排卵數(shù)相關(guān)主效基因的研究，這是提高繁殖性能最直接且有效的方法。目前關(guān)于GDF9和BMP15影響動(dòng)物繁殖力的研究逐漸增多，但關(guān)于GDF9、BMP15在牦牛生殖過(guò)程中的研究有限。因此，本研究對(duì)牦牛GDF9、BMP15基因外顯子區(qū)克隆并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，旨在為進(jìn)一步開(kāi)展牦牛GDF9、BMP15基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣、細(xì)菌菌株和載體 用于本研究的牦牛樣品采自于甘肅省大通牦牛育種場(chǎng)。用常規(guī)的酚氯仿提取法提取血樣中基因組DNA；利用TRizol法提取各組織中的總RNA；大腸桿菌E.coli DH5α購(gòu)自TIANGEN公司；pGEM-T easy克隆載體購(gòu)自Promega公司。

1.1.2 分子生物學(xué)試劑 DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Taq酶、IPTG和Amp均購(gòu)于TIANGEN公司；TRizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMII購(gòu)自TaKaRa。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已知的牦牛GDF9（NW_005393189）和BMP15（NW_005393997）基因序列分別設(shè)計(jì)克隆引物、表達(dá)引物。根據(jù)TargetScan預(yù)測(cè)得到miRNA設(shè)計(jì)表達(dá)引物，引物（表1）由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

表1 GDF9和BMP15基因引物序列

1.2 方法

1.2.1 牦?？侱NA提取 健康成年牦牛血液組織為材料，使用DNA提取試劑盒提取牦?？侱NA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm 波長(zhǎng)下OD值，檢測(cè)濃度和純度。

1.2.2 RNA的提取 組織樣品采自3頭青海牦牛均為雌性，根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明利用TRizol法提取各組織中的總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，Thermo公司的NanoDrop 2000檢測(cè)其濃度及純度。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明依次進(jìn)行，但miRNA實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)研究所用反轉(zhuǎn)錄引物采用反轉(zhuǎn)錄引物混合液，各取1 μL RT primer加到78 μL ddH2O中均勻混合用作反轉(zhuǎn)錄引物混合液。GDF9和BMP15基因在各組織中的表達(dá)以β-actin為內(nèi)參，擴(kuò)增條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，65℃ 5 s，72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。bta-miR-193a-3p和bta-miR-193b表達(dá)以U6為內(nèi)參基因，擴(kuò)增條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)。

1.2.4 GDF9和BMP15基因的克隆 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒回收，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收物質(zhì)量。再將回收產(chǎn)物連接pGEM-T easy載體，T4連接酶16℃過(guò)夜連接，以此構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，37℃震蕩培養(yǎng)60 min后，涂布于含有Amp和IPTG等成分的LB 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色陽(yáng)性菌落接種于LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的菌落送至公司測(cè)序。

1.2.5 GDF9和BMP15基因序列的生物信息學(xué)分析

1.2.5.1 理化性質(zhì)分析 采用ExPASy（http：//www. expasy.org/）等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括開(kāi)放閱讀框，氨基酸組成，等電點(diǎn)，疏水性質(zhì)等理化性質(zhì)，信號(hào)肽，跨膜區(qū)，磷酸化位點(diǎn)；運(yùn)用SOPMA（http：//nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/ Expasy/Expasy8.htm）和SWISS-MODEL（http：//www. swissmodel.expasy.org/）軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5.2 進(jìn)化分析 運(yùn)用Clust W軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載GDF9和BMP15基因編碼蛋白的序列，其中包括人（NP_005251.1；NP_005439.2），小鼠（XP_006532283.1；NP_0338-87.1），豬（NP_001001909.1；NP_001005155.1），山羊（NP_001272637.1；NP_001272517.1），狗（XP_ 005626415.1；XP_003640322.1），駱駝（XP_01097-9701.1；XP_010996367.1），黃牛（XP_010805521.1；NP_001026922.1），水牛（XP_006050617.1；XP_00-6059547.1），熊貓（XP_002912947.1；XP_0029305-52.1），狒狒（NP_001162234.1；XP_003917771.1）和牦牛共11個(gè)物種，運(yùn)用MEGA5.10軟件基于鄰位歸并法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

1.2.6 GDF9和BMP15基因靶標(biāo)miRNA預(yù)測(cè) 運(yùn)用TargetScan在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件（http：//www.targetscan. org/），以GDF9和BMP15基因作為靶基因，參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)，預(yù)測(cè)靶定此基因的miRNA。

2 結(jié)果

2.1 牦牛GDF9和BMP15基因的序列分析

以大通牦牛血液總DNA為模板擴(kuò)增GDF9基因兩個(gè)外顯子區(qū)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖1）顯示，得到兩條清晰的條帶，大小分別是500 bp和1 265 bp，與預(yù)期目的條帶相符，測(cè)序后得到長(zhǎng)度分別為411 bp（位于1-411 bp處）和1 082 bp（位于410-1 491 bp處）的兩條核苷酸序列，拼接后得到完整外顯子區(qū)序列（圖2）。運(yùn)用在線(xiàn)BLAST比對(duì)測(cè)序得到序列與公布的GDF9 mRNA序列只有1個(gè)堿基（位于112位）的差異，相似性達(dá)99%，具有較高的同源性，初步認(rèn)為得到序列是牦牛GDF9外顯子區(qū)序列。

圖1 牦牛GDF9和BMP15基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

圖2 牦牛GDF9基因編碼蛋白序列

以大通牦牛血液總DNA為模板擴(kuò)增BMP15基因外顯子區(qū)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖1）顯示，得到兩條清晰大小分別是450 bp和1 055 bp的片段，結(jié)果與預(yù)期相似，測(cè)序得到長(zhǎng)度分別為323 bp（位于1-323 bp處）和802 bp（位于321-1 122 bp處）的兩條核苷酸序列，拼接后得到外顯子區(qū)序列如圖3。運(yùn)用在線(xiàn)BLAST比對(duì)得到序列與公布的BMP15 mRNA序列相似性高達(dá)100%，初步認(rèn)為得到序列是牦牛BMP15外顯子區(qū)序列。

圖3 牦牛BMP15基因編碼蛋白質(zhì)序列

2.2 牦牛GDF9和BMP15蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 牦牛GDF9和BMP15基因編碼蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)序列分析 運(yùn)用在線(xiàn)ExPASy 軟件（http：//www. expasy.org/）分析牦牛GDF9基因編碼蛋白理化性質(zhì)，此蛋白分子量為51.947 6 kD，理論等電點(diǎn)pI=8.99。含有20種氨基酸，其中Leu以11.3%最多且遠(yuǎn)高于其他氨基酸，Trp以1.5%最少。通過(guò)ORF Finder軟件對(duì)所得序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析，得到長(zhǎng)為1 362 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼453個(gè)氨基酸，編碼蛋白為親水性蛋白。SignalP 4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽表明，該基因編碼蛋白質(zhì)含有一個(gè)信號(hào)肽，切割位點(diǎn)位于25和26位氨基酸之間。TMHMM預(yù)測(cè)無(wú)跨膜區(qū)，非跨膜蛋白。GDF9基因編碼蛋白15個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)。

運(yùn)用在線(xiàn)ExPASy 軟件分析牦牛BMP15基因編碼蛋白理化性質(zhì)，此蛋白分子量為40.838 9 kD，理論等電點(diǎn)pI=9.62。含有20種氨基酸，其中Leu以11.7%最多遠(yuǎn)高于其他氨基酸，Cys和Met以1.7%最少。有長(zhǎng)為1 119 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼372個(gè)氨基酸。無(wú)信號(hào)肽、跨膜區(qū)，為非跨膜蛋白。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，BMP15基因編碼蛋白共有6個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)。

圖4 牦牛GDF9基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.2.2 牦牛GDF9和BMP15基因編碼蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)序列分析 運(yùn)用SOPMA在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)GDF9二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果（圖4）顯示，該基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占據(jù)最多，而β轉(zhuǎn)角最少，其中α螺旋區(qū)為138個(gè)氨基酸，延伸鏈為76個(gè)氨基酸，β轉(zhuǎn)角為23個(gè)氨基酸，無(wú)規(guī)則卷曲為216個(gè)氨基酸，分別占30.36%、16.78%、5.08%和47.68%。利用SwissModel進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)牦牛GDF9基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 牦牛GDF9基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用SOPMA在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)BMP15二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果（圖6）顯示，該基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與GDF9相似，其中α螺旋區(qū)為99個(gè)氨基酸占27.65%，延伸鏈為67個(gè)氨基酸占18.72%，β轉(zhuǎn)角為29個(gè)氨基酸占8.10%，無(wú)規(guī)則卷曲為163個(gè)氨基酸占45.53%。同源建模預(yù)測(cè)牦牛BMP15基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖7所示。

圖6 牦牛BMP15基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖7 牦牛BMP15基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.3 牦牛GDF9和BMP15基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析 運(yùn)用MEGA5.10軟件基于NJ法分別構(gòu)建GDF9和BMP15基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果（圖8，圖9）表明，牦牛GDF9和BMP15基因均與黃牛親緣關(guān)系最近，與水牛次之。

圖8 牦牛GDF9基因編碼蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（NJ法）

2.3 牦牛GDF9和BMP15組織表達(dá)分析

采用RT-PCR技術(shù)分別對(duì)心、腎、肝、肌肉、胰、脾、卵巢和子宮等八種組織進(jìn)行差異表達(dá)分析（圖10）。以GDF9在肌肉中的表達(dá)量為內(nèi)對(duì)照，GDF9在卵巢和子宮中表達(dá)相對(duì)較高，在胰和脾中不表達(dá)，BMP15僅在卵巢中表達(dá)。

圖9 牦牛BMP15基因編碼蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（NJ法）

圖10 牦牛GDF9（A）和BMP15（B）基因在各組織表達(dá)量

2.4 牦牛GDF9和BMP15靶定miRNA的預(yù)測(cè)篩選與表達(dá)分析

運(yùn)用TargetScan在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)，GDF9共預(yù)測(cè)得到28個(gè)miRNA，BMP15無(wú)結(jié)果。本研究選擇屬于microRNA-193家族的bta-miR-193a-3p和bta-miR-193b進(jìn)行研究，采用RT-PCR技術(shù)分別對(duì)篩選得到的兩個(gè)miRNA在心、脾、肺、腎和子宮5種組織進(jìn)行差異表達(dá)分析，以bta-miR-193a-3p在脾中的表達(dá)量為內(nèi)對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖11。bta-miR-193a-3p整體表達(dá)量低于bta-miR-193b，但脾中表達(dá)量相對(duì)較高，且顯著高于其他組織，在心、肺和子宮中均不表達(dá)。bta-miR-193b在心和腎中未檢測(cè)到表達(dá)，在肺中的表達(dá)量顯著低于脾和子宮中。

圖11 bta-miR-193a-3p（A）和bta-miR-193b（B）牦牛各組織中表達(dá)量

3 討論

近年來(lái)，對(duì)于GDF9和BMP15基因的研究備受關(guān)注，已有研究證明GDF9和BMP15影響羊繁殖力，其中GDF9通過(guò)旁分泌的方式影響卵泡的生長(zhǎng)分化，而B(niǎo)MP15則是主要借助卵泡發(fā)育過(guò)程中抑制FSH受體在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，它們之間同源性較高且結(jié)構(gòu)相似，功能上表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了牦牛GDF9和BMP15基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。通過(guò)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知GDF9的α螺旋占30.36%、延伸鏈16.78%、β轉(zhuǎn)角5.08%，無(wú)規(guī)則卷曲47.68%，BMP15的α螺旋占27.65%，延伸鏈18.72%，β轉(zhuǎn)角8.10%，無(wú)規(guī)則卷曲45.53%，從而形成高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)揮其特定功能，均完成了三維建模。它們分別作為T(mén)GF-β家族中GDF 和BMP亞家族成員參與細(xì)胞生物活性的調(diào)節(jié)，因其一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)相似于家族成員，其功能也具有相似性。有研究表明轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性決定翻譯起始效率，穩(wěn)定性越高表達(dá)率越低［17］。而對(duì)綿羊的研究發(fā)現(xiàn)GDF9突變形成突變雜合體，使其表達(dá)量降低致使卵巢排卵數(shù)增加引起多胎現(xiàn)象［18］。原因之一可能是牦牛二級(jí)結(jié)構(gòu)不如綿羊穩(wěn)定使其多胎現(xiàn)象少于綿羊。但牦牛GDF9和BMP15基因編碼蛋白質(zhì)真正的生物學(xué)功能有待于進(jìn)一步研究。利用編碼氨基酸序列同其他10個(gè)物種進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從物種之間的進(jìn)化關(guān)系可看出牦牛GDF9和BMP15基因編碼蛋白與黃牛最為接近，符合動(dòng)物之間的分類(lèi)地位。

GDF9和BMP15表達(dá)模式相似，研究初認(rèn)為兩者僅在卵巢中表達(dá)，經(jīng)過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)不同物種之間有所區(qū)別。Fitzpatrick［19］在對(duì)大鼠和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)GDF9僅在卵巢、睪丸和下丘腦中表達(dá)，子宮中未檢測(cè)到表達(dá)，而后期在對(duì)人的研究中發(fā)現(xiàn)，在性腺和非性腺組織，如垂體、子宮和骨髓中也檢測(cè)到GDF9的表達(dá)。Elis［20］發(fā)現(xiàn)雞BMP15在卵巢和其他組織中均有表達(dá)。Clelland［21］對(duì)斑馬魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)，BMP15在卵巢和睪丸中高表達(dá)，而在心臟、肝臟、肌肉、腸道和腦組織中也表達(dá)。本研究檢測(cè)牦牛GDF9和BMP15在各組織中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GDF9基因不僅在卵巢和子宮中表達(dá)，在肝臟和肌肉中也檢測(cè)到表達(dá)，而B(niǎo)MP15僅在卵巢中表達(dá)；但GDF9和BMP15均主要在性腺組織中高表達(dá)。

miRNA在卵泡生成、排卵、卵母細(xì)胞成熟和黃體功能等方面起到重要作用［13］。目前對(duì)于miRNA影響繁殖力的研究主要集中于對(duì)卵巢周期排卵影響。Fiedle等［22］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)hCG處理前后的顆粒細(xì)胞，有13個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中miR-132和miR-212經(jīng)處理后表達(dá)量明顯上調(diào)，后經(jīng)研究確定miR-132和miR-212可通過(guò)結(jié)合寡核苷酸阻礙cAMP介導(dǎo)的成熟miRNA表達(dá)與功能。2010年Yao［23］曾用TFG-β1處理小鼠腔前顆粒細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)miR-224表達(dá)量明顯上調(diào)，后經(jīng)TFG-β超家族Ⅰ型受體抑制劑阻斷效應(yīng)物Smad2/3磷酸化處理后，發(fā)現(xiàn)上調(diào)作用減弱，表明TFG-β1/Smads通路可調(diào)節(jié)miR-224的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-224可通過(guò)靶定Smad4增加顆粒細(xì)胞增生和細(xì)胞雌二醇釋放，而內(nèi)源性miR-224的抑制能夠阻礙由TFG-β1介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞增生。Yao［24］研究發(fā)現(xiàn)孕酮分泌過(guò)程中，經(jīng)FSH處理12 h后，miR-29a和miR-30d表達(dá)量明顯下降，處理48 h后表達(dá)量又顯著增加。有研究表明micro-193家族成員miR-193b可通過(guò)靶定GRB7蛋白，侵襲人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系HEC-1B，抑制GRB7蛋白表達(dá)從而參與子宮內(nèi)部調(diào)節(jié)［25］。通過(guò)對(duì)micro-193家族的btamiR-193a-3p和bta-miR-193b進(jìn)行表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)子宮作為影響產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵因素之一，bta-miR-193a-3p在子宮中無(wú)表達(dá)，在脾和腎中表達(dá)量相對(duì)較高，而bta-miR-193b在子宮中表達(dá)量較高，推測(cè)bta-miR-193b可能總用于靶定GDF9基因，為調(diào)控牦牛多胎性的miRNA。

4 結(jié)論

牦牛GDF9基因克隆得到兩個(gè)片段長(zhǎng)分別411 bp和1 082 bp，共編碼453個(gè)氨基酸；BMP15基因克隆得到片段長(zhǎng)分別為323 bp和802 bp，共編碼372個(gè)氨基酸，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明牦牛GDF9和BMP15均和黃牛親緣關(guān)系最近，結(jié)果符合理論。

GDF9在卵巢和子宮中表達(dá)相對(duì)較高，BMP15僅在卵巢中表達(dá)。預(yù)測(cè)GDF9和BMP15的靶定miRNA，對(duì)micro-193家族的bta-miR-193a-3p和btamiR-193b進(jìn)行表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)bta-miR-193a-3p整體表達(dá)量低于bta-miR-193b，但脾中表達(dá)量相對(duì)較高，顯著高于其他組織。bta-miR-193b在心和腎中未檢測(cè)到表達(dá)，在肺中的表達(dá)量顯著低于脾和子宮中。推測(cè)bta-miR-193b可能作用于靶定GDF9基因，參與牦牛多胎性的調(diào)控。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Expression Analysis and miRNA Study of Gene GDF9 and BMP15 in Yak

LI Ming-xia1，2，3PAN He-ping1YAN Ping2，3WU Xiao-yun2，3WANG Ying-jie1，2，3
（1. College of Life Science and Engineering of Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730070；2. Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050；3. Key Laboratory of Yak Breeding Engineering，Lanzhou 730050）

Gene GDF9（growth differentiation factor 9）and BMP15（bone morphogenetic protein 15）of yak were used as research subject；then 2 exon fragments of GDF9 and BMP15 were cloned by PCR， and the expressions of GDF9 and BMP15 as well as targeted miRNA were analyzed by RT-PCR. The results were as follows. The cloned and amplified exon fragments were analyzed by bioinformatics；the exons of yak gene GDF9 were 411 bp and 1 082 bp， encoding 453 amino acids；the lengths of exons in yak gene BMP15 were 323 bp and 802 bp separately， encoding 372 amino acids. The protein encoded by GDF9 was hydrophilic， containing one signal peptide and 15 potential phosphorylation sites；the protein encoded by BMP15 was also hydrophilic， and owing no signal peptide and 6 potential phosphorylation sites. The expressions of GDF9 and BMP15 in different tissues were examined by RT-PCR. The results showed that GDF9 expressed relatively high in ovary and uterus， and higher in ovary than others tissues， and no expression in heart， kidney， pancreas， and spleen；BMP15 was only detected in ovary. With TargetScan， the target miRNA of yak gene GDF9 and BMP15 were predicted and the expressions of target gene bta-miR-193a-3p and bta-miR-193b of GDF9 in heart， spleen， lung， kidney and uterus were analyzed. miRNAs genes were examined with RT-PCR；the results indicated that bta-miR-193a-3p in the spleen expressed significantly higher than in others tissues， and no expression in heart， lung and uterus；bta-miR-193b expressed lower in lung than spleen and uterus， and no expression was detected in heart and kidney.

Yak；GDF9；BMP15；miRNA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.013

2015-07-23

西北民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（ycx14166），甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2011-23）

李明霞，女，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖；E-mail：1031082498@qq.com

潘和平，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物遺傳育種；E-mail：panheping62@163.com