喻放楊忠華范漢東左振宇

（1.武漢科技大學(xué)，武漢430081；2.杭州師范大學(xué)衰老研究所，杭州 310036）

人IL-24基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)純化

喻放1楊忠華1范漢東2左振宇1

（1.武漢科技大學(xué)，武漢430081；2.杭州師范大學(xué)衰老研究所，杭州 310036）

構(gòu)建人白細(xì)胞介素24（IL-24）原核表達(dá)載體并利用ELP-Intein系統(tǒng)表達(dá)純化可溶性的IL-24蛋白。通過PCR擴(kuò)增不含信號(hào)肽的人IL-24基因，將IL-24基因插入pET-ELP-Intein質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-ELP-Intein-IL-24。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BLR（DE3），20℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。利用ELP蛋白在不同溫度下發(fā)生相變的特點(diǎn)和Intein蛋白的自切割反應(yīng)純化可溶性IL-24蛋白，將純化得到的IL-24蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測IL-24蛋白的生物學(xué)活性。成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-ELP-Intein-IL-24，第一次通過原核表達(dá)方法表達(dá)并純化出了可溶性的IL-24蛋白。Western blot檢測顯示目的蛋白能與IL-24抗體特異性結(jié)合，表明純化出的蛋白確實(shí)為IL-24蛋白。細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)證明IL-24蛋白能顯著地誘導(dǎo)hepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

白細(xì)胞介素24；質(zhì)粒構(gòu)建；原核表達(dá)；蛋白純化

白細(xì)胞介素24（IL-24）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤細(xì)胞抑制因子。IL-24基因最初是在1995 年由美國哥倫比亞大學(xué)的Jiang等［1］生物學(xué)家通過差示雜交的方法從人類黑色素瘤細(xì)胞中克隆得到的。因它可以誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞分化，故又名為黑色素瘤分化相關(guān)基因-7（mda-7）［2］。人mda-7基因?yàn)閱慰截惢?，包?個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，與IL-10家族的IL-10、IL-20等共同定位于人一號(hào)染色體的lq32，其cDNA全長為1 718 bp，mRNA長約2 kb，編碼由206個(gè)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量約為23.8 kD的蛋白質(zhì)［3-5］。IL-24蛋白N端含有一個(gè)包含49個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，此信號(hào)肽與蛋白的分泌和切割密切相關(guān)［6］。IL-24蛋白能抑制包括肝癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的生長，具有廣譜的抗腫瘤效應(yīng)，且對(duì)正常細(xì)胞的生長沒有影響［7，8］。IL-24是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種既具有腫瘤抑制特性又能刺激免疫功能的細(xì)胞因子，其II期臨床研究證實(shí)IL-24蛋白的有效性與安全性［9］。因此IL-24在腫瘤的臨床治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究擬構(gòu)建人不包含信號(hào)肽的IL-24基因的原核表達(dá)載體，通過Banki等［10］建立的ELP-Intein表達(dá)純化系統(tǒng)進(jìn)行IL-24蛋白的原核表達(dá)和純化，為IL-24在腫瘤臨床治療的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli DH5α、E.coli BLR（DE3）、hepG2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；原核表達(dá)載體pET-ELP-Intein為杭州師范大學(xué)李建峰老師贈(zèng)送；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BsrG I和HindⅢ、T4 DNA ligase購自NEB公司、DNA Marker、蛋白Marker、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自TaKaRa公司；兔抗IL-24抗體和熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自AxyGEN公司；氨芐青霉素、IPTG、Tris-HCl、十二烷基硫酸鈉（SDS）、30%丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、疊氮化鈉、考馬斯亮藍(lán)R-250等試劑購自Solarbio公司；引物合成服務(wù)由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司完成；基因測序服務(wù)由上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中不含信號(hào)肽的人IL-24基因序列，設(shè)計(jì)引物IL-24-F：5'-GCGTGTACAATGGGGGCCCAGGGCCAAGAGTTTCACT 3'（劃線部分為BsrG I酶切位點(diǎn)，前面3個(gè)為保護(hù)堿基），IL-24-R：5'-CCCAAGCTTTCAGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC-3'（劃線部分為Hind III酶切位點(diǎn)，前面3個(gè)為保護(hù)堿基），以肝癌細(xì)胞hepG2的cDNA為模板，擴(kuò)增不含信號(hào)肽的人IL-24基因（480 bp）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切下膠上的目的條帶后使用DNA回收試劑盒回收純化。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-ELP-Intein-IL-24的構(gòu)建 將回收的PCR產(chǎn)物和pET-ELP-Intein質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BsrG I和Hind III雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，利用T4 DNA連接酶將雙酶切后的IL-24基因和pET-ELPIntein質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素抗性的LB平板中篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑出單克隆接種LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒用BsrG I和Hind III雙酶切鑒定，鑒定正確后送至上海美吉生物公司進(jìn)行性DNA測序。

1.2.3 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序正確的重組質(zhì)粒pET-ELP-Intein-IL-24轉(zhuǎn)化至E.coli BLR（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素抗性的LB平板中篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑出單克隆接種LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒用BsrG I和Hind III雙酶切鑒定。將鑒定正確的單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100將培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5左右，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，20℃，150 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。離心收集菌體，超聲破碎，菌液破碎后將上清和沉淀中的蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.4 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的純化 菌液超聲破碎后，收集上清，加入等體積的0.8 mol/L（NH4）2SO4溶液（降低融合蛋白的Tt），輕輕混勻，放入37℃恒溫水浴鍋靜置20 min，使融合蛋白發(fā)生相變反應(yīng)（此時(shí)由于溶液溫度高于Tt，融合蛋白是以固體形式存在于沉淀中，但雜蛋白卻不會(huì)發(fā)生相變反應(yīng)，所以雜蛋白會(huì)隨著上清一起被除去）；37℃，16 000×g離心10 min，棄上清；用預(yù)冷的PBS緩沖液重新懸浮含有融合蛋白的沉淀，使融合蛋白重新溶解（此時(shí)由于溶液溫度低于Tt，融合蛋白會(huì)重新變?yōu)榭扇跔顟B(tài)，溶解在PBS緩沖液中）；4℃，16 000×g離心10 min，棄沉淀，將上清收集在干凈的EP管中；重復(fù)上述步驟進(jìn)行第2輪相變反應(yīng)，提高融合蛋白的純度。純化后的蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的自切割反應(yīng) Intein蛋白在25℃左右，pH6.5的條件下能在巰基化合物的作用下發(fā)生自我切割反應(yīng)，將Intein蛋白N端或C端的目的蛋白切割下來。

按0.585 g/L EDTA、8.368 g/L Bis-Tris、1%巰基乙醇溶解于PBS緩沖液中，調(diào)整pH值至6.5，配制成Intein自切割緩沖液。將溶解于Intein自切割緩沖液的融合蛋白置于25℃水浴中，進(jìn)行Intein蛋白自我切割反應(yīng)，以釋放目的蛋白。15 h后自動(dòng)切割過程結(jié)束，向溶液中加入等體積的0.8 mol/L（NH4）2SO4溶液，37℃水浴靜置20 min，使ELPIntein標(biāo)簽發(fā)生相變。切割下的ELP-Intein標(biāo)簽和未切割完全的融合蛋白將轉(zhuǎn)變?yōu)槌恋?，失去?biāo)簽的目的蛋白則保持可溶狀態(tài)存在于上清中。切割下來的目的蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.6 IL-24蛋白的Western blot鑒定 取適量切割下來的IL-24蛋白，100℃加熱變性處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)，然后將目的蛋白條帶點(diǎn)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用抗體封閉液室溫振蕩封閉1 h后，依次加入兔抗IL-24抗體和熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，在紅外熒光掃描成像儀觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 IL-24蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞hepG2凋亡的檢測 于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將hepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代4次至對(duì)數(shù)生長期，將原核表達(dá)的IL-24蛋白過濾除菌后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，使終濃度為20 mg/L，另外一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中不加IL-24蛋白作為對(duì)照組，置于37℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別收集并洗滌實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，將細(xì)胞用Sigma凋亡檢測試劑盒內(nèi)的1×Binding Buffer均勻懸?。晃?00 μL細(xì)胞懸浮液于1.5 mL EP管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI輕輕混勻后于4℃避光反應(yīng)15 min；用200目濾膜過細(xì)胞懸液，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 IL-24基因擴(kuò)增

如圖1所示，以肝癌細(xì)胞hepG2的cDNA為模板進(jìn)行IL-24基因的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，能得到一條480 bp左右的條帶，與目的基因大小相符。

圖1 IL-24基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒pET-ELP-Intein-IL-24的構(gòu)建與鑒定

如圖2所示，將重組質(zhì)粒pET-ELP-Intein-IL-24用BsrG I和Hind III雙酶切后，獲得一條480 bp左右的條帶，此條帶大小與IL-24基因大小相符。將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果表明連入pET-ELP-Intein質(zhì)粒中的IL-24基因與GenBank中IL-24基因的堿基序列完全一致，說明重組質(zhì)粒pET-ELP-Intein-IL-24構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒PET-ELP-Intein-IL-24雙酶切鑒定

2.3 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組PET-ELP-Intein-IL-24質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌株BLR（DE3）中并篩選出陽性重組子，重組菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5左右，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，20℃，150 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。離心收集菌體，超聲破碎，對(duì)上清和沉淀分別進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測。如圖3所示，上清中明顯有一條50 kD左右的蛋白條帶，與ELPIntein-IL-24融合蛋白的大小相符，沉淀中在50 kD處的條帶并不明顯，沒有轉(zhuǎn)化pET-ELP-Intein-IL-24質(zhì)粒的BLR（DE3）菌株表達(dá)產(chǎn)物在50 kD處也無明顯條帶。說明ELP-Intein-IL-24融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功，且表達(dá)出的融合蛋白是可溶的。

圖3 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的SDS-PAGE電泳檢測

2.4 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的純化

如圖4所示，加入（NH4）2SO4溶液降低ELPIntein-IL-24融合蛋白的Tt后，經(jīng)過兩輪相變反應(yīng)，能去除絕大多數(shù)雜蛋白，得到高純度的ELP-Intein-IL-24融合蛋白。

圖4 ELP-Intein-IL-24融合蛋白純化后的SDS-PAGE電泳檢測

2.5 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的自切割反應(yīng)

如圖5所示，ELP-Intein-IL-24融合蛋白25℃下在自切割緩沖液中進(jìn)行自切割反應(yīng)20 h后，能成功切割掉ELP-Intein標(biāo)簽，得到18 kD左右大小的蛋白，與人IL-24蛋白大小相符。

圖5 自切割后的IL-24蛋白SDS-PAGE電泳檢測

2.6 IL-24蛋白的Western blot鑒定

將去掉標(biāo)簽的IL-24蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)（圖6），在熒光成像儀下觀察到在18 kD處明顯有一條帶，說明此蛋白為IL-24蛋白。

圖6 IL-24蛋白的Western blot鑒定

2.7 IL-24蛋白誘導(dǎo)hepG2細(xì)胞凋亡的檢測

圖7和圖8分別為細(xì)胞凋亡的流式檢測結(jié)果，將流式數(shù)據(jù)制作成表格，如表1所示。培養(yǎng)24 h后，不加IL-24蛋白處理的對(duì)照組中hepG2細(xì)胞的中凋亡率只有17.90%，加入IL-24蛋白處理后，hepG2細(xì)胞的凋亡率明顯升高，達(dá)到了57.75%，說明原核表達(dá)的IL-24蛋白具有明顯的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞hepG2凋亡的生物學(xué)活性。

圖7 對(duì)照組細(xì)胞凋亡檢測

圖8 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡檢測

表1 各樣品中正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞所占比例

3 討論

IL-24具有明顯的抗腫瘤效果，在惡性腫瘤的臨床治療方面具有極大的應(yīng)用前景。人體內(nèi)IL-24的表達(dá)主要集中在具有免疫功能的一些細(xì)胞，如外周血單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和正常的黑色素瘤細(xì)胞［11-13］。IL-24的對(duì)腫瘤的抑制作用不依賴于p21和p53等抑癌基因的活性來實(shí)現(xiàn)［14］。此外，IL-24還可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管的形成以及提高惡性腫瘤對(duì)化療和放療的敏感性［15-17］。Pan等［18］將腺病毒介導(dǎo)的IL-24基因（Ad-IL-24）導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ad-IL-24可以通過顯著上調(diào)Bax、Caspase和下調(diào)VEGF、CD34和bcl-2的表達(dá)來誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且對(duì)正常細(xì)胞沒有明顯影響。

傳統(tǒng)的原核表達(dá)方法雖然能表達(dá)IL-24蛋白，但產(chǎn)物往往是存在于包涵體之中［19］，要經(jīng)過包涵體溶解、變性、復(fù)性等過程后才能進(jìn)行IL-24蛋白的層析柱純化［20］。然而經(jīng)過變復(fù)性的蛋白很難保持原有的生物學(xué)活性，而且用層析柱進(jìn)行蛋白純化不僅操作繁瑣，而且成本高。本研究使用ELP-Intein系統(tǒng)進(jìn)行IL-24蛋白的原核表達(dá)，利用類彈性蛋白ELP在不同溫度下的可逆相變特性和內(nèi)含肽Intein的自切割反應(yīng)進(jìn)行IL-24蛋白的純化［21］。成功表達(dá)并純化出了可溶且有抗腫瘤生物學(xué)活性的IL-24蛋白，為進(jìn)一步研究IL-24蛋白的功能及其在腫瘤臨床治療上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-ELP-Intein-IL-24，利用ELP-Intein表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化了具有生物學(xué)活性的IL-24蛋白，通過原核表達(dá)獲得了可溶并具有生物學(xué)活性的IL-24蛋白。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Construction of Prokaryotic Expression Vector for Human Gene IL-24 and Expression and Purification of Its Protein

YU Fang1YANG Zhong-hua1FAN Han-dong2ZUO Zhen-yu1
（1. Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081；2. Institute of Aging Research of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036）

This work aims to construct a prokaryotic expression vector for human gene IL-24， and express and purify soluble IL-24 protein via ELP-Intein system. The human gene IL-24 without signal peptide was amplified by PCR and cloned into vector pET-ELP-Intein， and the recombinant expression vector pET-ELP-Intein-IL-24 was constructed. The recombinant plasmid was transformed to Escherichia coli BLR（DE3），and the expression was induced at 20℃ by IPTG. The soluble IL-24 protein was purified based on the transformation of ELP protein at different temperatures and the self-cleavage reaction of Intein protein. The purified protein was identified by Western blot. The bioactivity of IL-24 protein was measured by Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit. The recombinant expression vector pET-ELP-Intein-IL-24 was successfully constructed， and the soluble IL-24 protein was expressed for the first time by prokaryotic vector and purified. Western blot analysis showed the target protein specifically bound with IL-24 antibody， which proved that the purified protein was indeed IL-24 protein. Apoptosis detection experiment confirmed that IL-24 protein significantly induced the apoptosis of hepG2 cells.

IL-24；recombinant plasmid construction；prokaryotic expression；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.011

2015-04-22

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014CFB802）

喻放，男，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：358311135@qq.com

左振宇，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：zuozhenyu@wust.edu.cn范漢東，男，博士，教授，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：fanhandong@whu.edu.cn