孔維文李云龍王敬琦劉婷婷陳南金一何曉青

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083；2 北京市植物保護站，北京 100029）

黃瓜細菌性角斑病PMA-qPCR檢測方法的建立和應(yīng)用

孔維文1李云龍2王敬琦1劉婷婷1陳南1金一1何曉青1

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083；2 北京市植物保護站，北京 100029）

黃瓜細菌性角斑病為黃瓜常見的一種細菌病害，其致病菌為丁香假單胞菌黃瓜致病型。目前該病在全球范圍內(nèi)已經(jīng)造成嚴重的經(jīng)濟損失。針對于PMA染料能夠區(qū)分細胞死活的特性將其與熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合。（1）通過比對分析GenBank中該菌種不同株的gap1基因序列，找出gap1基因的保守區(qū)并根據(jù)保守區(qū)基因序列設(shè)計了一對特異性引物Dxf1和Dxr1，以其他5種非丁香假單胞菌基因組為模板進行實時定量PCR擴增，只有丁香假單胞菌有擴增曲線，證明引物非常特異。（2）以gap1基因為目的基因構(gòu)建其克隆載體，將克隆載體導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，使其大量復(fù)制。再將質(zhì)粒提取，以提取的質(zhì)粒作為標準品，根據(jù)其濃度將其稀釋為5×101-5×1077個梯度繪制標準曲線，獲得的擴增效率為96.6%，并做組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)，變異系數(shù)均在2%內(nèi)，證明標準曲線重復(fù)性良好。（3）將構(gòu)建好的方法用于實際樣品的檢測，得到的Ct值為27.99，根據(jù)標準曲線所得的起始模板與Ct值之間的線性關(guān)系公式，檢測到100 mg患病葉片中含有的菌體為7.69×102拷貝。研究表明，該方法可以快速鑒定并檢測實際樣品中的活的致病菌的數(shù)量，為黃瓜細菌性角斑病的防控提供技術(shù)支持。

黃瓜細菌性角斑病；PMA-qPCR；丁香假單胞菌；檢測；有活力菌體

黃瓜細菌性角斑病是世界范圍內(nèi)的黃瓜的主要病害之一，是為黃瓜由丁香假單胞菌黃瓜致病型（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）引起，是一種重要的細菌性病害，于 20 世紀初首次被Carsener等［1］報道。20世紀80年代，日本、加拿大和美國等地因為細菌性角斑病遭受了嚴重的經(jīng)濟損失［2-4］。我國在20世紀50年代時對黃瓜細菌性角斑病也有初步報道，但由于病害并不嚴重，所以沒有引起廣泛重視，直到80年代，該病害在華北、東北和內(nèi)蒙古等黃瓜的主要產(chǎn)區(qū)逐漸肆虐，已成為黃瓜種植中的嚴重災(zāi)害，才引起了人們的重視。該病散布快，傳播范圍廣，如果黃瓜遭遇此病害，嚴重時可導(dǎo)致絕產(chǎn)，造成嚴重經(jīng)濟損失［5，6］。近幾年來，該病已散布到全國的黃瓜保護地。此外，丁香假單胞菌的寄主非常廣泛，1988年，孫福在等［7］證明該病原菌除了可侵染黃瓜外，還可以侵染葫蘆、西葫蘆和絲瓜等葫蘆科植物。

傳統(tǒng)的檢測方法如生理生化指標鑒定，細菌的分離培養(yǎng)等都是依靠表型來鑒定致病菌，耗時長，靈敏度很低，并且不準確［8］。ELISA等血清學(xué)鑒定致病菌，快速而靈敏，近來也有過一些報道［9］。但丁香假單胞菌有50多個致病型［10］，因此對抗體的篩選也增加了很多困難，綜上原因，構(gòu)建一個重復(fù)性好，靈敏度高的致病菌的分子檢測方法對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中預(yù)防和控制該疾病有著很重要的意義。普通的qPCR雖然能夠?qū)Σ≡M行定量，但不能區(qū)分病原菌的死活［11，12］。有研究表明病菌在死亡后數(shù)天甚至數(shù)周內(nèi)DNA都能夠保持完整［13］，因此如何區(qū)分病原菌的死活就成為分子檢測手段的巨大挑戰(zhàn)。疊氮溴化丙錠（PMA）是一種能與DNA高度親和的熒光染料，它能穿過受損細胞膜內(nèi)，在可見光的照射下能與其DNA共價交聯(lián)，從而達到阻礙受損細胞中的DNA進行PCR擴增的作用［14，15］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中針對于患病植株有很多處理方法的建立可以成為判斷各處理方法有效性的一種手段［16］。因此將PMA染料與實時定量PCR結(jié)合可以準確、快速的鑒定致病菌并準確對活菌數(shù)進行定量。

gap1基因是甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因，作為參與新陳代謝的基因，丁香假單胞菌的gap1基因具有高度的保守性，因此gap1基因可以用于檢測該致病菌。本研究將GenBank中丁香假單胞菌黃瓜致病型的gap1基因序列進行比對，根據(jù)其保守區(qū)設(shè)計特異性引物，構(gòu)建針對于gap1基因的PMA-qPCR檢測方法。并將該方法應(yīng)用于實際樣品的檢測，旨為快速鑒定、測取單位患病葉片中活菌含量提供一種檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及實際樣本 丁香假單胞菌黃瓜致病型菌株（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）；水稻白葉枯病病原菌（Xanthomonas oryzae）；番茄潰瘍病病原菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis）；黑腐病病原菌（Xanthomonas campestris）；青枯病病原菌（Ralstonia solanacearum），黃瓜緣枯病致病菌（Pseudomonas marginalis pv. marginalis）和大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；患細菌性角斑病黃瓜葉片（采自房山區(qū)）。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 PMA 染料（Biotium，美國），RNase-free ddH20（TIANGEN，北京），ExTaq DNA 聚合酶（TaKaRa，大連），100 mmol/L dNTP（TIAN-GEN，北京），Marker I，50×TAE Buffer，質(zhì)粒提取試劑盒，pGM-T載體構(gòu)建試劑盒，細菌基因組提取試劑盒，DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒，TRIZOL試劑（TIANGEN，北京）Goldview（Biodee，北京）。SuperReal PreMix Plus（TIANGEN，北京）Qubit核酸/蛋白定量儀（Invitrogen，美國），H2O3程控金屬?。℅ingkoBio，北京），電泳儀（Bio-Rad，美國），凝膠成像儀（Bio-Rad，美國），MX3000P 熒光定量PCR 儀（Stratagene，美國）。

1.2 方法

1.2.1 丁香假單胞菌黃瓜致病型gap1基因片段的擴增 取Pseudomonas syringae pv. lachrymans甘油保存液10 μL于液體LB培養(yǎng)基中在28℃過夜培養(yǎng)，取5 mL菌液提取基因組，以提取的基因組為模板進行PCR擴增，用primer5根據(jù)GenBank上Pseudomonas syringae pv. lachrymans gap1基因保守區(qū)設(shè)計引物 Xf1 Xf2，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為 2 μL模板，10×PCR buffer 5 μL 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Ex Taq酶 0.5 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O補足至50μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，51℃ 45 s，72℃ 2 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收擴增產(chǎn)物保存并測序（北京瑞博興科）。與GenBank上Pseudomonas syringae pv. lachrymans gap1基因 91%同源，可知此菌為丁香假單胞菌黃瓜治病型中的其中一種。

1.2.2 熒光定量PCR引物設(shè)計和特異性驗證 熒光定量PCR引物的長度要求為80-200 bp間最好，最長不能超過300 bp，根據(jù)primer5根據(jù)上一步擴增并回收的636 bp產(chǎn)物序列進行引物設(shè)計，得到擴增產(chǎn)物為126 bp的一對引物Dxr1和Dxf1，序列見表1。為驗證引物特異性，以丁香假單胞菌黃瓜致病型基因組為模板進行熒光定量PCR驗證，常見的植物病原細菌，包括水稻白葉枯病病原菌；番茄潰瘍病病原菌；黑腐病病原菌；青枯病病原菌，黃瓜緣枯病致病菌和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌兩種模式細菌基因組為對照。qPCR體系為SuperReal PreMix Plus 12.5 μL引物各0.4 μL模板 2 μL加水補足至25 μL。擴增程序為：95℃ 10 min；95℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃1 min，共40個循環(huán)。

表1 引物序列

1.2.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒 使用pGM-T載體與636 bp的PCR產(chǎn)物連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞。進行藍白斑篩選，挑單個白斑于20 mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒（天根質(zhì)粒提取試劑盒）進行PCR鑒定和測序鑒定。

1.2.4 Real-time PCR 標準曲線的建立 用Qubit測得質(zhì)粒濃度，根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)計算公式算出質(zhì)?？截悢?shù)，公式為（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA length× 660）= copies/μL。將標準質(zhì)粒稀釋成5×101-5×1077個體度在MX3000P 熒光定量 PCR儀上進行擴增，條件體系參見1.2.2。總反應(yīng)結(jié)束后自動獲得標準曲線和熔解曲線。

1.2.5 黃瓜細菌性角斑病實際樣本的檢測

1.2.5.1 PMA-qPCR的技術(shù)原理 PMA-qPCR技術(shù)以細胞膜的完整性作為評判細菌死活的標準，主要是由于當(dāng)細胞的細胞膜不完整時，PMA能夠進入細胞與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，而細胞膜完整時PMA則會被阻隔在細胞外面，當(dāng)強光照射時，與DNA結(jié)合的PMA會形成疊氮基團使之結(jié)合的更緊密，從而阻止其之后的qPCR擴增，而未與DNA結(jié)合的PMA在強光照射下會與水反應(yīng)而被消除，所以細胞膜完整的細胞，也就是活菌內(nèi)的DNA可以擴增，而細胞膜不完整的死亡細菌內(nèi)的DNA則不會擴增［17］。根據(jù)PMA的技術(shù)原理可知PMA染料是在DNA提取時起作用。

1.2.5.2 PMA的預(yù)處理及DNA的提取 根據(jù)李聰聰?shù)龋?8］的方法，將PMA用20%DMSO配制成1 μg/μL的工作液，-20℃避光保存。稱取患細菌性角斑病的黃瓜葉片100 mg迅速放進研缽用液氮研磨，將粉末轉(zhuǎn)移至2 mL的EP管中。向EP管內(nèi)加995 μL PBS，渦旋震蕩。將EP管用鋁箔紙包住，向EP管中加5 μL PMA工作液，使PMA的終濃度為5 μg/mL。將加完P(guān)MA染料的EP管放入搖床150 r/min震蕩5 min后，將所有管置于冰上，距離500 W氯素?zé)粝抡丈? min，期間隔30 s轉(zhuǎn)動EP管，使其照射均勻［19］。PMA處理后將EP管10 000 r/min離心5 min，將液體吸干保留固體，再用Trizol法提取DNA。

1.2.5.3 樣品DNA的QPCR檢測 將上步提取的DNA為模板，條件體系參照1.2.2，使用MX3000P熒光定量 PCR 儀進行實時熒光定量PCR檢測，將測得的Ct值代入標準曲線公式中算出樣本中丁香假單胞菌的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 丁香假單胞菌黃瓜治病型gap1基因的擴增

將產(chǎn)物回收測序后得到的片段長度為636 bp，與GenBank上Pseudomonas syringae pv lachrymans gap1基因 91%同源，可知此菌為丁香假單胞菌黃瓜致病型中的其中一種。

2.2 熒光定量引物的特異性驗證

經(jīng)過熒光定量PCR擴增后，只有丁香假單胞菌黃瓜致病型有擴增，Ct值為14.66，其他的植物病原細菌，黃瓜病原細菌，模式細菌都沒有Ct值（表2）。證明該引物可以區(qū)分黃瓜細菌性角斑病致病菌和其他病原細菌。

表2 黃瓜細菌性角斑病菌的特異性擴增結(jié)果

2.3 標準曲線的建立

重組質(zhì)粒經(jīng)測序表明插入的gap1基因片段與預(yù)期的片段序列100%同源。稀釋的5×101-5×1077個梯度的質(zhì)粒經(jīng)實時定量PCR擴增后自動生成基線、閾值和熔解曲線。以質(zhì)粒的拷貝數(shù)為橫坐標，反應(yīng)的Ct值為縱坐標，繪制丁香假單胞菌gap1基因檢測的標準曲線，可得初始模板數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系公式，為Ct=-3.407×log 拷貝數(shù)+ 37.78，擴增效率為96.6%（圖1）。根據(jù)樣本的Ct值通過此公式可以計算出對應(yīng)的初始拷貝數(shù)。另外熔解曲線為單一峰，Tm值為88.2℃（圖2），證明引物特異性極好，無引物二聚體和非特異性擴增。

圖1 gap1基因標準曲線

圖2 gap1基因熔解曲線

2.4 重復(fù)性分析

選擇102、104、106三個梯度的質(zhì)粒進行組內(nèi)和組間的重復(fù)性分析，結(jié)果（表3和表4）顯示，組內(nèi)變異系數(shù)均小于1%。組間變異系數(shù)均小于2%。

表3 gap1基因Real-time PCR組內(nèi)重復(fù)試驗

表4 gap1基因Real-time PCR組內(nèi)重復(fù)試驗

2.5 實際樣本的定量

將實驗建立的PMA-qPCR方法應(yīng)用于檢測將黃瓜細菌性角斑病葉片，PMA預(yù)處理后提取基因組實時熒光定量PCR進行檢測（圖3），測得實際樣品的Ct值為27.99，將實驗測出的Ct值帶入模板數(shù)與Ct之間的線性關(guān)系公式得出gap1基因的拷貝數(shù)為7.69×102。

3 討論

實時熒光定量PCR主要有兩種方法，Taqman探針法和SYBR Green熒光染料法［20］，后者能與所有雙鏈DNA結(jié)合，因此對DNA模板沒有選擇性，因此，采用SYBR Green熒光染料法時對引物的特異性要求高，應(yīng)避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)，非特異性擴增，引物二聚體生成。Taqman法雖然針對特定的DNA模板，但合成探針費用較高。本研究根據(jù)丁香假單胞菌黃瓜致病型gap1基因設(shè)計的引物熔解曲線Tm值單一，因此適用于SYBR Green熒光染料法，可以省去Taqman探針合成的費用。

圖3 實際樣品和標準品擴增曲線

黃瓜細菌性角斑病與黃瓜霜霉病的早期性狀十分相似，單憑患病表征難以判定，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中容易導(dǎo)致霜霉病和細菌性角斑病的混淆，引起誤診，造成很嚴重的經(jīng)濟損失。近來也不乏有許多針對于黃瓜細菌性角斑病的分子檢測的研究，王哲等［21］針對丁香假單胞菌的gap1基因設(shè)計一對特異性引物，對不同來源的12株丁香假單胞菌進行PCR擴增，均擴增出179 bp的條帶，其他參試菌株都沒有擴增出條帶，該方法的靈敏度為7. 5×103CFU/mL，利用該方法可從接種后的黃瓜葉片中檢測到特異條帶。王平等［22］針對丁香假單胞菌的ITS序列設(shè)計特異性引物，擴增出473 bp的條帶，利用該方法可直接對黃瓜葉片汁液進行病原菌檢測，并且可在接種后病癥發(fā)生前72 h內(nèi)檢測到病原。此外，F(xiàn)ogliano等［8］也建立了血清學(xué)的檢測方法，在每克鮮植株中可以檢測出近 0.1 mg 的 syringpeptins。這些方法都可以快速地檢測丁香假單胞菌，但靈敏度不夠。用于檢測該致病菌的熒光定量PCR檢測方法也未見報道。本研究構(gòu)建的實時熒光定量的方法不僅可以快速鑒定致病菌，還能準確的對其進行定量，可以檢測5×101copies/μL。

將PMA與qPCR聯(lián)合應(yīng)用可以對有活性的致病菌準確定量。PMA-qPCR方法聯(lián)合應(yīng)用此前也有很多文獻［23-26］報道過，但基本都是應(yīng)用于水體中致病菌的檢測，很少應(yīng)用于植物中病原體的檢測。長期以來，農(nóng)業(yè)上也有很多種預(yù)防和處理黃瓜細菌性角斑病的方法［27，28］，但由于細菌有活的不可培養(yǎng)這一狀態(tài)［29］，所以常規(guī)的平板技術(shù)法并不能準確的驗證這些處理技術(shù)的殺菌效果，結(jié)合本研究的PMA-qPCR方法，可以對實際樣本中活菌的數(shù)量進行準確的定量，篩選出最有效的殺菌技術(shù)，為黃瓜細菌性角斑病的防治提供有力的保證。

4 結(jié)論

本研究將PMA與qPCR技術(shù)結(jié)合，設(shè)計了一對特異性引物Dxf1、Dxr1，可以對活的黃瓜細菌性角斑病致病菌進行準確定量，qPCR體系為SuperReal PreMix Plus 12.5 μL引物各0.4 μL模板 2 μL加水補足至25 μL。程序為：95℃ 10 min；95℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環(huán)。靈敏度為5× 101copies/μL。此外，以黃瓜細菌性角斑病病原菌為實驗組，其他植物細菌性病原菌和模式細菌為對照組，進行熒光定量PCR擴增，驗證引物特異性。結(jié)果表明只有黃瓜細菌性角斑病致病菌有擴增。證明該引物可以特異檢測黃瓜細菌性角斑病病原菌。

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The Establishment of PMA-qPCR for Detecting Bacterial Angular Leaf Spot on Cucumber and Its Preliminary Application

KONG Wei-wen1LI Yun-long2WANG Jing-qi1LIU Ting-ting1CHEN Nan1JIN Yi1HE Xiao-qing1
（1. College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. Beijing Plant Protection Station，Beijing 100029）

Bacterial angular leaf spot on cucumber is a common bacterial disease for cucumber， and its causative pathogen is Pseudomonas syringae pv. lachrymans. Currently this disease has caused a worldwide serious economic loss. Duo to the feature of PMA dyes that may distinguish whether the bacterial cells are alive or dead， PMA-qPCR was established by combining it with fluorescence quantitative PCR（qPCR）technology. （1）We compared the sequences of gene gap1 in different strains of the bacteria in GenBank， and found out the conservative area of gene gap1， and designed a pair of specific primers Dxf1 and Dxr1 for this bacterium according to the sequences of conservative area of gene gap1. Then we applied the qPCR method to do amplification using the genome of 5 non-Pseudomonas syringae pv. Lachrymans as template， and only P. syringae pv. lachrymans showed the positive result， proving that primers had specificity. （2）We used the gene gap1 as the target gene to construct a clone vector that was inserted into the competent cells of Escherichia coli. Then the E. coli cells were cultured to have a lot of copies. Using the extracted plasmids as the standard sample， and it was diluted to seven gradients of 5×101-5×107and then drew a standard curve. The amplification efficiency obtained from the standard curve was 96.6%， and the coefficients of variation both within groups and between groups were less than 2%， showing a fine repeatability of the standard curve. （3）We applied the PMA-qPCR method to detect the actual samples and gained a Ct value of 27.99. Based the linear correlation between initial template from the standard curve and Ct values， we measured 7.69×102copies viable cells per 100 mg sick leaves. This study showed that PMA-qPCR method could quickly identify and quantify the number of living bacteria in actual samples， and provided a technical support for the prevention and control of bacterial angular leaf spot on cucumber.

bacterial angular leaf spot on cucumber；PMA-qPCR；Pseudomonas syringae；detection；viable cell

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.009

2015-04-30

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（51108029），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目（TD2012-03），北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項目（2013D002006000001）

孔維文，碩士研究生，研究方向：植物病原體互作；E-mail：kongweiwen90@126.com

何曉青，博士，副教授，研究方向：環(huán)境中微生物學(xué)；E-mail：lenahe@bjfu.edu.cn