馮世鵬

（海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

miRNA qPCR檢測(cè)方法研究進(jìn)展及其應(yīng)用

馮世鵬

（海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

miRNA是目前國(guó)際研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，而miRNA表達(dá)檢測(cè)是miRNA研究的基礎(chǔ)內(nèi)容。針對(duì)miRNA序列短小的特點(diǎn)，開發(fā)出了多種檢測(cè)方法，其中miRNA qPCR定量檢測(cè)是應(yīng)用最廣泛的方法。就miRNA抽提，miRNA qPCR定量檢測(cè)原理及miRNA qPCR定量檢測(cè)流程包括引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系設(shè)置、內(nèi)參基因篩選等方面進(jìn)行了深入探討，并對(duì)miRNA定量檢測(cè)研究方法的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望，以期為研究者進(jìn)行miRNA qPCR定量檢測(cè)提供參考。

miRNA；stem-loop RT-PCR；poly（A）加尾法RT-PCR；延伸法RT-PCR；數(shù)字PCR

miRNA是真核生物體內(nèi)普遍存在的一類非編碼序列長(zhǎng)度約22個(gè)堿基的單鏈小RNA分子，由特定發(fā)卡結(jié)構(gòu)（Stem-loop）的前體剪切加工而成。成熟的miRNA與相關(guān)蛋白組成沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，miRISC）與靶基因mRNA結(jié)合，降解mRNA或者抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)［1，2］。目前在英國(guó)Sanger中心miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（最新版本21，2014年6月釋放）（http：//www.mirbase.org/）中共有28 645條成熟miRNA記錄，涵蓋物種包括囊泡藻界（Chromalveolata）、后生動(dòng)物亞界（Metazoa）、黏菌門（Mycetozoa）、綠色植物亞界（Viridiplantae）及病毒（Viruses）5大類，其中記錄的成熟miRNA人類（Homo sapiens）2 588個(gè)，小鼠（Mus musculus）1 915個(gè)，秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）434個(gè)，水稻（Oryza sativa）713個(gè)，擬南芥（Arabidopsis thaliana）413個(gè)［3，4］。

MiRNA參與生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和凋亡等多個(gè)進(jìn)程，其發(fā)揮的作用越來(lái)越受到研究者的重視。根據(jù)miRNA序列短小的特點(diǎn)，開發(fā)了多種檢測(cè)方法，如Northern blot雜交法［5］，Primer extension（引物延伸法）［6］，Signal-amplifying ribozymes（核酶法）［7］，Invader assay（侵入探針?lè)ǎ?］，Bead-based assay（磁珠法）［9］，qPCR法［10］，miRAGE（miRNA表達(dá)序列分析法）［11］，深度測(cè)序法［12］等。

以上這些方法的優(yōu)劣及使用情況已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)［13］進(jìn)行了報(bào)道，其中qPCR方法使用最多，本文將對(duì)近年miRNA qPCR方法的研究進(jìn)展進(jìn)行論述，以期對(duì)今后miRNA的qPCR定量檢測(cè)提供參考意見。

1 miRNA抽提方法

目前對(duì)于miRNA的抽提主要有兩類方法。一類是沉淀法，通過(guò)強(qiáng)有機(jī)試劑裂解細(xì)胞釋放RNA，再用乙醇、異丙醇、乙酸鈉、LiCl等試劑進(jìn)行RNA沉淀，常見的裂解液如不同公司的Trizol試劑（含有強(qiáng)有機(jī)試劑異硫氰酸胍等）；另一類是柱吸附法，通過(guò)裂解液裂解細(xì)胞釋放RNA后，用吸附柱分離純化小RNA分子（表1）。

表1 常見樣本miRNA抽提方法匯總表

1.1 細(xì)胞類樣本及動(dòng)物組織樣本miRNA抽提

對(duì)于人、動(dòng)物、植物細(xì)胞，微生物細(xì)胞個(gè)體及人與動(dòng)物組織樣本，常用沉淀法法抽提總RNA，該方法通過(guò)Trizol試劑裂解細(xì)胞釋放RNA，再進(jìn)行總RNA的沉淀，此方法易于操作，所抽提的RNA里面包含miRNA等小RNA分子，并可滿足大多數(shù)情況下miRNA檢測(cè)之用［14，15］；有些吸附柱可同時(shí)吸附所有類型的RNA，利用這種吸附柱也可抽提含miRNA的總RNA分子［16，17］，也有部分吸附柱只能吸附大片段的RNA或者只能吸附小片段的RNA，基于這類吸附柱開發(fā)的試劑盒對(duì)于RNA的抽提則需要將大片段的RNA（＞200 nt）與小片段（＜200 nt）RNA分別提?。?8，19］。有部分實(shí)驗(yàn)需要較高純度的miRNA（如miRNA測(cè)序、miRNA的表達(dá)譜研究等），可在抽提的總RNA基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用吸附柱或凝膠電泳純化分離純化miRNA分子。

對(duì)于血樣、唾液、精液等液體樣本，因其所含細(xì)胞少、水分多等特點(diǎn)需用濃縮型的miRNA抽提試劑［20，21］。Ho等［22］比較了不同公司6款針對(duì)液體樣本的miRNA抽提方法，發(fā)現(xiàn)其抽提效果稍有差異，該結(jié)果可為研究者進(jìn)行商業(yè)化試劑盒選擇時(shí)提供參考。Tzimagiorgis等［23］對(duì)于血漿、血清、唾液、腦髓液等體液樣本游離核酸的來(lái)源、樣本前處理及miRNA抽提方法進(jìn)行了綜合討論，可為液體樣本miRNA抽提提供參考。

對(duì)于石蠟樣本，因其RNA有不同程度降解，所含石蠟會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)，樣本miRNA抽提前需進(jìn)行去石蠟操作［24，25］，不同公司開發(fā)了針對(duì)石蠟樣本的miRNA抽提試劑盒，其實(shí)際使用使用效果有一定差異，選擇時(shí)需謹(jǐn)慎［26］。

1.2 植物組織樣本miRNA抽提

由于植物的根、莖、葉、花、果不同組織或者不同植物的同一組織中所含的次生代謝產(chǎn)物的種類及含量不一樣，導(dǎo)致植物組織的miRNA抽提方法更加多樣化。對(duì)于模式植物擬南芥、大部分禾本科植物、部分其他科植物的葉片來(lái)說(shuō)，用Trizol進(jìn)行總RNA抽提，其中所包含的miRNA分子可用于大多數(shù)情況下的miRNA表達(dá)檢測(cè)［27-31］。對(duì)于一些特殊植物，如橡膠樹葉片含有較多膠乳成分，香蕉和荔枝等水果樹葉片含多糖等成分，其總RNA及miRNA的抽提需要進(jìn)行去除這些成分的前期處理［32］。

1.3 miRNA質(zhì)控

包含miRNA的總RNA抽提完畢之后需進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，包括RNA完整性、濃度、純度的檢測(cè)。其中RNA的完整性主要用兩種方法檢測(cè)：一是RNA凝膠電泳（PAGE或瓊脂糖凝膠電泳均可），28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，則證明所抽提總RNA完整性較好；二是進(jìn)行RIN值（RNA integrity number）檢測(cè)（如用Agilent 2100進(jìn)行芯片電泳），RIN值大于7則證明樣本所抽提RNA完整性較好。RNA的濃度及純度可用測(cè)吸光度的方法進(jìn)行測(cè)定檢測(cè)260 nm、280 nm和230 nm三個(gè)波長(zhǎng)的吸光值A(chǔ)260、A280和A230，常用A260吸光值與濃度換算關(guān)系是OD值相當(dāng)于RNA濃度44 ng/mL；A260與A280的比值可評(píng)估是否有DNA或者蛋白質(zhì)污染，該比值大于2.0則證明RNA純度較高；A260與A230的比值是看有機(jī)雜質(zhì)殘留，該值越大則認(rèn)為RNA樣本含有機(jī)雜質(zhì)越少［33］。

2 miRNA qRT-PCR檢測(cè)

2.1 miRNA前處理

miRNA由于其自身特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行特異性檢測(cè)面臨一些挑戰(zhàn)。如序列長(zhǎng)度太短，只有22 bp；GC含量不均一；缺少類似polyA的公共序列；存在初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）、前體（pre-miRNA）、成熟miRNA三種形式；miRNA家族成員間序列相差幾個(gè)堿基，甚至只差一個(gè)堿基［14］。因此對(duì)于miRNA的檢測(cè)方法設(shè)計(jì)，從得到的RNA樣本即開始綜合考慮。

獲得含有miRNA的高質(zhì)量RNA樣本后，在第一鏈cDNA合成之前，按照對(duì)該樣本RNA的處理方式分3種類型：一是不做任何處理（圖1-A）；二是使用poly（A）聚合酶（poly（A）polymerase，PAP）在miRNA的3'端連接poly（A）尾（表2，圖1-B）；三是在miRNA的3'端或兩端均添加linker（圖1-C，圖1-D）。

圖1 成熟miRNA的前處理

2.1.1 Poly（A）加尾法 其最顯著的好處在于為所有待檢測(cè)miRNA引入類似mRNA的poly（A）尾，便于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄時(shí)通過(guò)帶poly（T）的反轉(zhuǎn)錄引物一次將所有的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)于用qPCR法進(jìn)行miRNA表達(dá)譜研究來(lái)說(shuō)非常實(shí)用。其缺點(diǎn)是加尾完畢需進(jìn)行RNA純化，無(wú)論是用乙醇沉淀［34］還是通過(guò)吸附柱［35］回收來(lái)純化，均會(huì)損失一部分miRNA表達(dá)信息。另外，PAP酶的反應(yīng)效率也很難達(dá)到100%，這也會(huì)導(dǎo)致一部分miRNA表達(dá)信息的損失，從而導(dǎo)致低表達(dá)的miRNA無(wú)法檢測(cè)，其他可檢測(cè)的miRNA表達(dá)量下降；另外由于不同公司的PAP酶及不同的反應(yīng)條件會(huì)導(dǎo)致poly（A）尾的長(zhǎng)短產(chǎn)生一定的差異，導(dǎo)致qPCR檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)雜峰，在反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮這種情況，并盡力避免。Poly（A）加尾法所需的總RNA量目前文獻(xiàn)報(bào)道在0.5 μg以上，因該方法后續(xù)處理純化的損失，因此建議起始量在條件許可的情況下可適當(dāng)增加（如2 μg），這樣有利于檢測(cè)低表達(dá)的miRNA，同時(shí)加尾處理后的RNA可用于其他miRNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，也不會(huì)浪費(fèi)。

2.1.2 linker連接法 在成熟的miRNA一端或者兩端同時(shí)使用T4 RNA連接酶進(jìn)行l(wèi)inker連接，其優(yōu)點(diǎn)是：直接增加了miRNA的長(zhǎng)度，使引物設(shè)計(jì)時(shí)可選擇引物結(jié)合范圍增大；在3'端引入linker，可用通用引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；若同時(shí)在一端或者兩端引入公共接頭，如需要可設(shè)計(jì)通用引物。其缺點(diǎn)是：受T4 RNA連接酶反應(yīng)效率影響，易導(dǎo)致低豐都表達(dá)的miRNA難以檢測(cè)［36］。

2.2 第一鏈cDNA合成

2.2.1 Poly（A）加尾法 對(duì)于通過(guò)poly（A）加尾處理過(guò)的RNA樣本來(lái)說(shuō)，根據(jù)待檢測(cè)的miRNA數(shù)量，取適量RNA加入帶poly（T）的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反應(yīng)即可（表2）。該反轉(zhuǎn)錄引物常用這種形式表示adapter（T）nVN，從5'端開始依次可分為3部分（圖2-C）：（1）adapter部分，用于引入通用反向引物位點(diǎn)，文獻(xiàn)報(bào)道其長(zhǎng)度范圍集中在32-75 nt，其結(jié)構(gòu)為線性或者發(fā)卡狀。為了進(jìn)一步引入通用taqman探針結(jié)合位點(diǎn)，或者后續(xù)實(shí)驗(yàn)有其他應(yīng)用如構(gòu)建文庫(kù)，該部分可設(shè)計(jì)為較長(zhǎng)的片段，并設(shè)計(jì)成發(fā)卡結(jié)構(gòu)也增加其穩(wěn)定性［37，38］。（2）poly（T）n部分，于miRNA的poly（A）尾互補(bǔ)配對(duì)，長(zhǎng)度在12-25 nt之間（表2）。由于PCR反應(yīng)過(guò)程中需擴(kuò)增該片段，為避免擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)聚合酶打滑現(xiàn)象，同時(shí)較長(zhǎng)的引物片段會(huì)增加引物合成的困難，建議這部分的序列設(shè)計(jì)盡量不要太長(zhǎng)。（3）VN部分，V代表A、G和C三者之一，N代表A、T、G和 C四者之一（表2），這一部分的作用是與miRNA互補(bǔ)配對(duì)，錨定反轉(zhuǎn)錄時(shí)的起始位置，避免由于poly（A）尾長(zhǎng)短的差異導(dǎo)致qPCR時(shí)出現(xiàn)雜峰（圖2-C）。這部分的長(zhǎng)度有1nt［38］，2nt［24，35］，5-7 nt［39］，其中2 nt使用最多，該部分長(zhǎng)度小于或等于2 nt的屬于通用引物，包含由3種（1 nt情況）或者12種（2 nt情況）引物的混合物，其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物理論上可以檢測(cè)所有的miRNA；大于2 nt的屬于特異引物，主要用于進(jìn)行特定miRNA的檢測(cè)，提高qPCR檢測(cè)的特異性［39］。

圖2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)流程圖

2.2.2 Stem-loop 引物反轉(zhuǎn)錄或線性引物反轉(zhuǎn)錄 對(duì)于未經(jīng)加尾處理的RNA樣本來(lái)說(shuō)，需加入miRNA的特異引物進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄（圖2-A，2-B），若需同時(shí)檢測(cè)多個(gè)miRNA，則必須將這些miRNA的特異引物混合后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。miRNA特異引物一般包括2部分，從5'端開始依次是：（1）延長(zhǎng)部分，該部分的作用是引入反向引物結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)可分為線性和stem-loop發(fā)卡結(jié)構(gòu)兩種。線性結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物可通過(guò)引物的聯(lián)合設(shè)計(jì)取得較理想的檢測(cè)效果，如qPCR正向引物L(fēng)NA修飾［40］；或通過(guò)RT反轉(zhuǎn)錄引物與反向引物的協(xié)同設(shè)計(jì)，使miRNA有特異的RT引物及qPCR反向引物等［41］。發(fā)卡結(jié)構(gòu)可看成是在線性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的改進(jìn)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)于線性結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，在反轉(zhuǎn)錄時(shí)可提高反轉(zhuǎn)錄引物與miRNA結(jié)合的穩(wěn)定性，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的位阻效應(yīng)可避免反轉(zhuǎn)錄引物與前體miRNA的結(jié)合，從而提高miRNA檢測(cè)的靈敏度和特異性［10］。在發(fā)卡結(jié)構(gòu)引物中還可引入dU堿基，在反轉(zhuǎn)錄完畢后加入鳥嘧啶DNA糖基化酶（uracil-DNA glycosylase，UDG），在dU堿基處將DNA斷裂為兩段，這樣可去除反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中剩余的RT引物，而已經(jīng)轉(zhuǎn)錄完畢的cDNA在dU處斷裂后余下的片段也可作為qPCR反應(yīng)的模板，這樣進(jìn)一步提高qPCR檢測(cè)的特異性［42］。（2）與miRNA互補(bǔ)配對(duì)部分，這部分與miRNA檢測(cè)特異性密切相關(guān)。這部分的長(zhǎng)度集中在6-8 nt，Lao等［43］測(cè)試這部分長(zhǎng)度對(duì)于RT引物與miRNA結(jié)合效率的影響，從5-10 nt，在8 nt之前，隨著長(zhǎng)度的增加，RT引物結(jié)合效率顯著增加；在8 nt之后則增加不明顯。Jung等［44］測(cè)試獲得了類似的結(jié)果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列與miRNA結(jié)合位點(diǎn)間的gap越大，RT引物與miRNA結(jié)合的效率越差。

表2 miRNA qRT-PCR方法匯總表

2.2.3 Linker引物反轉(zhuǎn)錄 在miRNA的3'端連上linker后，由于引入了通用的反轉(zhuǎn)錄引物接合位點(diǎn)，可直接使用通用反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（圖2-D）；也可設(shè)計(jì)成miRNA特異的反轉(zhuǎn)錄引物。若設(shè)計(jì)為通用反轉(zhuǎn)錄引物，一般分為2部分，從5'端依次是延長(zhǎng)部分，進(jìn)一步引入通用qPCR反向引物位點(diǎn)；與linker配對(duì)部分，實(shí)現(xiàn)加尾后的miRNA反轉(zhuǎn)錄。若設(shè)計(jì)為miRNA特異的反轉(zhuǎn)錄引物，則設(shè)計(jì)時(shí)會(huì)進(jìn)一步延伸若干堿基與miRNA配對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)特定miRNA的反轉(zhuǎn)錄［36］。

2.2.4 反轉(zhuǎn)錄引物濃度設(shè)定 在引物濃度方面，進(jìn)行特定miRNA檢測(cè)時(shí)的RT引物濃度集中在50 nmol/L范圍；如果要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)miRNA，則將這些miRNA相應(yīng)的RT引物混合，每條引物均為50 nmol/L；帶poly（T）的引物濃度序列明顯高于其他非poly（T）的引物濃度（500 nmol/L以上）（表2）。

2.3 qPCR反應(yīng)

miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，均經(jīng)過(guò)適當(dāng)延長(zhǎng)，已經(jīng)可以進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，其檢測(cè)方法有染料法（如Sybr green染料）（圖3-A）和探針?lè)ǎㄈ鏣aqman探針）（圖3-B）。qPCR的引物根據(jù)其特點(diǎn)可分為以下幾種類型。

2.3.1 染料法 （1）特異正向引物（forward primer，F(xiàn)P）和通用反向引物（reverse primer，RP）。特異正向引物從5'端開始依次分為延長(zhǎng)部分以及與miRNA序列一致部分兩部分：延長(zhǎng)部分，序列為人為設(shè)計(jì)，可進(jìn)行LNA修飾，主要用于調(diào)節(jié)引物的GC含量、Tm值、長(zhǎng)度等，使其與下游引物相匹配；與miRNA序列一致部分是提供miRNA檢測(cè)特異性的最重要部分，對(duì)于部分polyA加尾法來(lái)說(shuō)，miRNA檢測(cè)特異性直接決定于這一個(gè)部分的特異結(jié)合情況。通用反向引物來(lái)自與反轉(zhuǎn)錄引物的延長(zhǎng)部分，所有的miRNA反轉(zhuǎn)錄引物這部分均設(shè)計(jì)相同的序列，導(dǎo)致可以采用通用反向引物［34，35］。（2）特異正向引物及特異反向引物。其中特異正向引物與前一種情況相同。特異反向引物來(lái)源于針對(duì)特定的miRNA設(shè)計(jì)的特異反轉(zhuǎn)錄引物，這些特異反轉(zhuǎn)錄引物除了與miRNA互補(bǔ)配對(duì)部分提供特異性外，針對(duì)不同的miRNA，其反轉(zhuǎn)錄引物延伸部分也不完全一樣，而qPCR反向引物必須根據(jù)反轉(zhuǎn)錄引物的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，最終導(dǎo)致各個(gè)miRNA有不同的特異反向引物［41］；或者是使用半嵌套引物，反向引物有部分序列與miRNA互補(bǔ)配對(duì)，也導(dǎo)致不同的miRNA有特異的反向引物［42］。（3）通用正向引物、通用反向引物。這是由于在PCR體系中除了正反向引物外，還加入了另一條引物，該引物從5'端開始依次分兩部分：延伸部分，提供了通用正向引物序列；與miRNA序列一致部分，提供了引物檢測(cè)的特異性；通用反向引物由反轉(zhuǎn)錄引物序列提供［46］。

2.3.2 探針?lè)?（1）特異正向引物、通用反向引物、特異探針。其中特異探針是由于探針設(shè)計(jì)的位置有一部分與miRNA序列匹配，導(dǎo)致不同的miRNA需用特異探針，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的特異性［10］。（2）特異正向引物、通用反向引物、通用探針。其中探針的位置設(shè)計(jì)在反轉(zhuǎn)錄引物的延伸部分，由于不同miRNA其延伸部分相同或者至少探針結(jié)合位置序列相同，因此可使用通用探針［37-39，44，45］。

圖3 miRNA qPCR反應(yīng)

2.3.3 qPCR反應(yīng)體系 （1）引物濃度確定。qPCR正反向引物的使用濃度集中在0.1-1 μmol/L之間（表2），其中尤以0.1-0.2 μmol/L濃度使用較多，增加正反向引物的濃度，可提高檢測(cè)靈敏度，但同時(shí)也可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增現(xiàn)象的產(chǎn)生，因此引物濃度需經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，一般起始濃度建議0.2 μmol/L。探針的濃度集中在0.1-0.5 μmol/L之間，其濃度也需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，起始濃度建議0.1 μmol/L。（2）循環(huán)數(shù)設(shè)定。qPCR循環(huán)數(shù)集中在35 x-45 x之間（表2），循環(huán)數(shù)的增加也會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，一般進(jìn)行qPCR定量檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)循環(huán)數(shù)在18-25之間，則數(shù)據(jù)分析結(jié)果比較可信，因此建議miRNA qPCR時(shí)的循環(huán)數(shù)設(shè)置在35x即可。（3）qPCR方法選擇。在miRNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)的眾多方法之中，何種是最好的尚無(wú)定論，從檢測(cè)特異性及實(shí)驗(yàn)花費(fèi)來(lái)說(shuō)有相同的趨勢(shì)：特異探針?lè)ā萃ㄓ锰结樂(lè)ā軸ybr green染料法，在實(shí)際操作中應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況綜合考慮。Adhikari等［47］比較poly（A）加尾法和stem-loop RT-PCR方法對(duì)于植物的miRNA檢測(cè)效果，認(rèn)為由于植物miRNA的甲基化，導(dǎo)致stem-loop RT-PCR檢測(cè)方法比polyA加尾法更準(zhǔn)確可信。Jung等［44］比較stem-loop RT-PCR時(shí)用通用探針獲得的qPCR檢測(cè)特異性和靈敏度與特異探針一致，但是通用探針可大幅降低實(shí)驗(yàn)消耗費(fèi)用。Varkonyi-Gasic等［45］比較認(rèn)為stem-loop RT-PCR方法使用通用探針?lè)z測(cè)的特異性要優(yōu)于Sybr green染料法。整體來(lái)說(shuō)，poly（A）加尾法，操作過(guò)程較繁瑣，但是由于引入通用poly（A）尾，可使用通用反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，適合進(jìn)行miRNA qPCR表達(dá)譜組學(xué)研究；stem-loop RT-PCR方法檢測(cè)靈敏度高，比較適合進(jìn)行少數(shù)miRNA的特異檢測(cè)。如需同時(shí)檢測(cè)多個(gè)miRNA，可將這些miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物混合反轉(zhuǎn)錄，但混合后可能會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增［43］，因此在miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物混合前最好通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定這些引物混合的適用性。

2.3.4 其他qPCR檢測(cè)方法 （1）一步法qRT-PCR。Yan等［48］嘗試用一步法進(jìn)行miRNA的qPCR檢測(cè)，該方法的原理是用一條反轉(zhuǎn)錄引物RT1將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用另一條引物RT2與cDNA模板結(jié)合并通過(guò)聚合酶延伸相互補(bǔ)齊，最后用P1與P2引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，其中P1是RT1引入的結(jié)合位點(diǎn)，P2是RT2引入的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于不同的miRNA其RT1與RT2引物均有部分與miRNA對(duì)應(yīng)，因此這2條引物是特異的；P1與P2可根據(jù)需求使其變?yōu)橥ㄓ靡锘蛘適iRNA特異引物。該方法的優(yōu)點(diǎn)是一步完成qPCR檢測(cè)，減少操作步驟；其最大的缺點(diǎn)是4條引物在一起，可能導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。（2）鉗形探針?lè)āuang等［49］開發(fā)了一種鉗形探針?lè)椒ǎ≒rince probe）進(jìn)行miRNA二步法qPCR檢測(cè)，其原理是用長(zhǎng)鏈鉗形探針與miRNA配對(duì)，由于鉗形探針的5'端與3'端部分與miRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，并且第一個(gè)堿基與最后一個(gè)堿基重疊同時(shí)利用反轉(zhuǎn)錄酶的活性特定，在40℃時(shí)5'端與miRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，捕獲miRNA；溫度降低至25℃時(shí)，3'端與miRNA部分互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)miRNA的反轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即可用于qPCR擴(kuò)增。該方法的靈敏度與特異性與stem-loop方法類似，但是其最大的優(yōu)點(diǎn)在于可區(qū)分成熟miRNA及其前體。（3）數(shù)字PCR技術(shù)。數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR）是一項(xiàng)新的技術(shù)，目前已應(yīng)用于進(jìn)行miRNA的絕對(duì)定量檢測(cè)［50-52］，該方法分4步完成，第一步將定量PCR技術(shù)的所使用的引物、探針或者染料（如Taqman探針或者EvaGreen染料）、特殊的數(shù)字PCR反應(yīng)液混合均勻；第二步使用特殊的儀器及反應(yīng)板制備微滴，10 000微滴以上，每一個(gè)微滴相當(dāng)于一個(gè)單獨(dú)PCR反應(yīng)；第三步將制備好含微滴的樣本轉(zhuǎn)入普通96孔PCR板并進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增；第四步將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用特殊儀器進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的絕對(duì)定量。該技術(shù)最大的特點(diǎn)是儀器和試劑的改進(jìn)導(dǎo)致可進(jìn)行微量樣本的絕對(duì)定量檢測(cè)；其最大的缺點(diǎn)是須使用特殊的儀器、試劑、耗材，運(yùn)行成本昂貴。

3 內(nèi)參基因選擇

目前公認(rèn)的理想內(nèi)參基因需要符合以下幾個(gè)條件：在不同組織及不同生理?xiàng)l件下表達(dá)穩(wěn)定；表達(dá)量較高，易于檢測(cè)；與目標(biāo)基因有相似的性質(zhì)，如目標(biāo)基因與內(nèi)參基因均為蛋白編碼基因或均為非編碼RNA等。其中第一條最重要也最難達(dá)到，不同物種不同生理?xiàng)l件下使用的內(nèi)參基因各不相同（表3），即使被廣泛使用的內(nèi)參基因Actin和GAPDH，在一定條件下，其表達(dá)會(huì)發(fā)生改變或受到其他基因的調(diào)控［69］。因此，對(duì)特定條件下的內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖龇?，但要求每一位研究者?duì)所使用的內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定也不現(xiàn)實(shí)。理論上不存在完全理想的內(nèi)參基因，只能尋找相對(duì)表達(dá)穩(wěn)定的基因，對(duì)于新鮮的組織及細(xì)胞樣本，用于miRNA檢測(cè)的常見內(nèi)參基因是U6及5S；對(duì)于血樣，常見的內(nèi)參基因是miR-16，借助外源加入其他物種的miRNA作內(nèi)參，或者聯(lián)合使用多種內(nèi)參基因（表3）。

4 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)目前所使用的miRNA qPCR定量檢測(cè)方法進(jìn)行了總結(jié)，從RNA抽提，miRNA qPCR方法選擇，miRNA qPCR流程中的引物設(shè)計(jì)、模板濃度、引物濃度、循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件設(shè)置，內(nèi)參基因選擇等各方面進(jìn)行了探討，并指出了在一般條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)的相應(yīng)參數(shù)。miRNA qPCR技術(shù)今后的發(fā)展方向?qū)⑹菧?zhǔn)確、易操作、所涉及到的試劑性價(jià)比高，如在不損失檢測(cè)靈敏度與特異性的條件下盡可能采用通用引物或者通用探針，在樣本量珍貴稀少時(shí)仍可準(zhǔn)確檢測(cè)等。未來(lái)對(duì)于miRNA定量檢測(cè)的要求將會(huì)越發(fā)嚴(yán)格，包括樣本制備、抽提RNA質(zhì)控、內(nèi)參選擇、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性方面將會(huì)有越來(lái)越高的要求，這樣一方面可以保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，并提高不同研究者的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可比性；另一方面對(duì)研究者的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)操作等方面提出了較高的要求，需要盡快適應(yīng)。

表3 實(shí)驗(yàn)所篩選的內(nèi)參基因匯總

［1］ Rana TM. Illuminating the silence：understanding the structure and function of small RNAs［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2007， 8 （1）：23-36.

［2］ Schwarz DS， Zamore PD. Why do miRNAs live in the miRNP？［J］. Genes Dev， 2002， 16 （9）：1025-1031.

［3］ Kozomara A， Griffiths-Jones S. miRBase：annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data［J］. Nucleic Acids Res， 2014， 42：D68-D73.

［4］ Griffiths-Jones S， Saini HK， Van Dongen S， Enright AJ. miRBase：tools for microRNA genomics［J］. Nucleic Acids Res， 2008， 36：D154-D158.

［5］ Lee RC， Feinbaum R， Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］. Cell， 1993， 75（5）：843-854.

［6］ Zeng Y， Cullen BR. Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells［J］. RNA， 2003， 9（1）：112-123.

［7］ Hartig JS， Grune I， Najafi-Shoushtari SH， et al. Sequence-specific detection of MicroRNAs by signal-amplifying ribozymes［J］. J Am Chem Soc， 2004， 126（3）：722-723.

［8］ Allawi HT， Dahlberg JE， Olson S， et al. Quantitation of microRNAs using a modified Invader assay［J］. RNA， 2004， 10（7）：1153-1161.

［9］ Babak T， Zhang W， Morris Q， et al. Probing microRNAs with microarrays：Tissue specificity and functional inference［J］. RNA， 2004， 10（11）：1813-1819.

［10］ Chen C， Ridzon DA， Broomer J， et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR［J］. Nucleic Acids Res， 2005，33（20）：e179.

［11］ Cummins JM， He Y， Leary RJ， et al. The colorectal microRNAome［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103（10）：3687-3692.

［12］ Kozomara A， Griffiths-Jones S. miRBase：annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data［J］. Nucleic Acids Res， 2014， 42：D68-D73.

［13］ Benes V， Castoldi M. Expression profiling of microRNA using realtime quantitative PCR， how to use it and what is available［J］. Methods， 2010， 50（4）：244-249.

［14］ Ding LF， Jiang Z， Chen QY， et al. A functional variant at miR-520a binding site in PIK3CA alters susceptibility to colorectal cancer in a Chinese Han population［J］. Biomed Res Int， 2015， clx.doi. org/10.1155/2015/373252.

［15］ Chen R， Jiang N， Jiang Q， et al. Exploring microRNA-like small RNAs in the filamentous fungus Fusarium oxysporum［J］. PLoS One， 2014， 9（8）：e104956.

［16］ Halper B， Hofmann M， Oesen S， et al. Influence of age and physical fitness on miRNA-21， tgF-β and its receptors in leukocytes of healthy women［J］. Exec Intell Rev， 2015， 21：154-163.

［17］ Tominaga N， Kosaka N， Ono M， et al. Brain metastatic cancer cells release microRNA-181c-containing extracellular vesicles capable of destructing blood-brain barrier［J］. Nat Commun， 2015， 6：6716. doi：10. 1038/ncomms7716. .

［18］ Poudel S， Aryal N， Lu CF. Identification of microRNAs and transcript targets in Camelina sativa by deep sequencing and computational methods［J］. PLoS One， 2015， 10（3）：e0121542.

［19］ Cerdá-Olmedo G， Mena-Durán AV， Monsalve V， et al. Identification of a microRNA signature for the diagnosis of Fibromyalgia［J］. PLoS One， 2015， 10（3）：e0121903.

［20］ Lo YMD， Tsui NBY， Chiu RWK， et al. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection［J］. Nat Med， 2007， 13（2）：218-223.

［21］ Sarrion I， Milian L， Juan G， et al. Role of Circulating miRNAs as biomarkers in idiopathic pulmonary arterial hypertension：possible relevance of miR-23a［J］. Oxid Med Cell Longev， 2015， 2015：792846.

［22］ Ho YK， Xu WT， Too HP. Direct quantification of mRNA and miRNA from cell lysates using reverse transcription real time PCR：a multidimensional analysis of the performance of reagents and workflows［J］. PLoS One， 2013， 8（9）：e72463.

［23］ Tzimagiorgis G， Michailidou EZ， Kritis A， et al. Recovering circulating extracellular or cell-free RNA from bodily fluids［J］. Cancer Epidemiol， 2011， 35（6）：580-589.

［24］ Wakabayashi K， Mori F， Kakita A， et al. Analysis of microRNA from archived formalin-fixed paraffin-embedded specimens of amyotrophic lateral sclerosis［J］. Acta Neuropathol Commun，2014， 2（1）：173.

［25］ Pan LJ， Huang SN， He RQ， et al. Decreased expression and clinical significance of miR-148a in hepatocellular carcinoma tissues［J］. Eur J Med Res， 2014， 19（1）：68.

［26］ Doleshal M， Magotra AA， Choudhury B， et al. Evaluation and validation of total RNA extraction methods for microRNA expression analyses in formalin-fixed， paraffin-embedded tissues［J］. J Mol Diagn， 2008， 10（3）：203-211.

［27］ Reiche M， Li YJ， Li JY et al. Inhibiting plant microRNA activity：molecular SPONGEs， target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs［J］. Plant Biotechnol J，2015， 13（7）：915-926.

［28］ Yin FQ， Qin C， Gao J， et al. Genome-wide identification and analysis of drought-responsive genes and microRNAs in tobacco［J］. Int J Mol Sci， 2015， 16（3）：5714-5740.

［29］ Wang YL， Zhao ZL， Deng MJ， et al. Identification and functional analysis of microRNAs and their targets in Platanus acerifolia under lead（Pb）stress［J］. Int J Mol Sci， 2015， 16（4）：7098-7111.

［30］ Zhou J， Cheng Y， Yin M， et al. Identification of Novel miRNAs and miRNA expression profiling in wheat hybrid necrosis［J］. PLoS One， 2015， 10（2）：e0117507.

［31］ Yu R， Wang Y， Xu L et al. Transcriptome profiling of root micro-RNAs reveals novel insights into taproot thickening in radish（Raphanus sativus L. ）［J］， BMC Plant Biol， 2015， 15（1）：30.

［32］ Peng J， Xia ZH， Chen L， et al. Rapid and efficient isolation of high-quality small RNAs from recalcitrant plant species rich in polyphenols and polysaccharides［J］. PLoS One， 2014， 9（5）：e95687.

［33］ Becker C， Hammerle-Fickinger A， Riedmaier I， et al. mRNA and microRNA quality control for RT-qPCR analysis［J］. Methods，2010， 50（4）：237-243.

［34］ Shi R， Chiang VL. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR［J］. Biotechniques， 2005， 39（4）：519-524.

［35］ Ro S， Park C， Jin JL， et al. A PCR-based method for detection and quantification of small RNAs［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 351（3）：756-763.

［36］ Mishim T， Mizuguchi Y， Kawahigashi Y， et al. RT-PCR-based analysis of microRNA（miR-1 and -124）expression in mouse CNS［J］. Brain Res， 2007， 1131（1）：37-43.

［37］ Reichenstein I， Aizenberg N， Goshen M， et al. A novel qPCR assay for viral encoded microRNAs［J］. J Virol Methods， 2010， 163（2）：323-328.

［38］ Luo X， Zhang J， Wang HJ， et al. PolyA RT-PCR-based quantification of microRNA by using universal TaqMan probe［J］. BiotechnolLett， 2012， 34（4）：627-633.

［39］ Kang K， Zhang XY， Liu HT， et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using SPoly（T）， a specific oligo（dT）reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity［J］. PLoS One， 2012， 7（11）：e48536.

［40］ Raymond CK， Roberts BS， Garrett-engele P， et al. Simple，quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring or microRNAs and short-interfering RNAs［J］. RNA， 2005， 11（11）：1737-1744.

［41］ Wang XW. A PCR-based platform for microRNA expression profiling studies［J］. RNA， 2009， 15（4）：716-723.

［42］ Wan GQ， Lim QE， Too HP. High-performance quantification of mature microRNAs by real-time RT-PCR using deoxyuridineincorporated oligonucleotides and hemi-nested primers［J］. RNA， 2010， 16（7）：1436-1445.

［43］ Lao KQ， Xu NL， Yeung V， et al. Multiplexing RT-PCR for the detectio n of multiple miRNA species in small samples［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 343（1）：85-89.

［44］ Jung U， Jiang XO， Kaufmann SHE， et al. A universal TaqManbased RT-PCR protocol for cost-efficient detection of small noncoding RNA［J］. RNA， 2013， 19（12）：1864-1873.

［45］ Varkonyi-Gasic E， Wu RM， Wood M， et al. Protocol：a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs［J］. Plant Methods， 2007， 3：12.

［46］ Sharbati-Tehrani S， Kutz-Lohroff B， Bergbauer R， et al. miR-Q：a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample［J］. BMC Mol Biol， 2008， 9：34.

［47］ Adhikari S， Turner M， Subramanian S. Hairpin priming is better suited than in vitro Polyadenylation to generate cDNA for plant miRNA qPCR［J］. Mol Plant， 2013， 6（1）：229-231.

［48］ Yan JL， Zhang N， Qi C， et al. One-step real time RT-PCR for detection of microRNAs［J］. Talanta， 2013， 110：190-195.

［49］ Huang TH， Yang J， Liu GP， et al. Quantification of mature micro-RNAs using pincer probes and real-time PCR amplification［J］. PLoS One， 2015， 10（3）：e0120160.

［50］ Faragó N， Kocsis áK， Lovas S， et al. Digital PCR to determine the number of transcripts from single neurons after patch-clamp recording［J］. Biotechniques， 2013， 54（6）：327-336.

［51］ Miotto E， Saccenti E， Lupini L， et al. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR：comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2014， 23（12）：2638-2642.

［52］ Li N， Ma J， Guarnera MA， et al. Digital PCR quantification of miRNAs in sputum for diagnosis of lung cancer［J］. J Cancer Res Clin Oncol， 2014， 140（1）：145-150.

［53］ Davoren PA， McNeill RE， Lowery AJ， et al. Identification of suitable endogenous control genes for microRNA gene expression analysis in human breast cancer［J］. BMC Mol Biol， 2008， 9：76.

［54］ Ratert N， Meyer HA， Jung M， et al. Reference miRNAs for miRNAom e Analysis of urothelial carcinomas［J］. PLoS One，2012， 7（6）：e39309.

［55］ Wotschofsky Z， Meyer HA， Jung M， et al. Reference genes for the relative quantification of microRNAs in renal cell carcinomas and their metastases［J］. Anal Biochem， 2011， 417（2）：233-241.

［56］ Sanders I， Holdenrieder S， Walgenbach-Brünagel G， et al. Evaluation of reference genes for the analysis of serumn miRNA in patients with prostate cancer， bladder cancer and renal cell carcinoma［J］. Int J Urol， 2012， 19（11）：1017-1025.

［57］ Song JN， Bai ZG， Han W， et al. Identification of suitable reference genes for qPCR analysis of serum microRNA in gastric cancer patients［J］. Dig Dis Sci， 2012， 57（4）：897-904.

［58］ Zheng G， Wang H， Zhang X， et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients［J］. PLoS One， 2013， 8（12）：e83025.

［59］ Li Y， Zhang LQ， Liu F et al. Identification of endogenous controls for analyzing serum exosomal miRNA in patients with hepatitis B or hepatocellular carcinoma［J］. Dis Markers， 2015， 893594 doi：10.1155/20151893594.

［60］ Zhu HT， Dong QZ， Wang G， et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients［J］. Mol Biotechnol， 2012， 50（1）：49-56.

［61］ Jurcevic S， Olsson B， Klinga-Levan K. Validation of suitable endogenous control genes for quantitative PCR analysis of microRNA gene expression in a rat model of endometrial cancer［J］. Cancer Cell Int， 2013， 13（1）：45.

［62］ Tea M， Michael MZ， Brereton HM， et al. Stability of small non-coding RNA reference gene expression in the rat retina during exposure to cyclic hyperoxia［J］. Mol Vis， 2013， 19：501-508.

［63］ Wang Y， Tang NP， Hui TT， et al. Identifi cation of endogenous reference genes for RT-qPCR analysis of plasma microRNAs levels in rats with acetaminophen-induced hepatotoxicity［J］. J Appl Toxicol， 2013， 33（11）：1330-1336.

［64］ Giu Y， Li M， Zhang K， et al. Identification of suitable endogenous control microRNA genes in normal pig tissues［J］. Anim Sci J，2011， 82（6）：722-728.

［65］ Wessels JM， Edwards AK， Zettler C， et al. Selection and validation of reference genes for miRNA expression studies during porcine pregnancy［J］. PLoS One， 2011， 6（12）：e28940.

［66］ Li J， Wei HX， Li Y， et al. Identification of a suitable endogenous control gene in porcine blastocysts for use in quantitative PCR analysis of microRNAs［J］. Sci China Life Sci， 2012， 55（2）：126-131.

［67］ Li D， Liu H， Li Y， et al. Identification of suitable endogenous control genes for quantitative RT-PCRanalysis of miRNA in bovine solid tissues［J］. Mol Biol Rep， 2014， 41（10）：6475-6480.

［68］ Johansen I， Andreassen R. Validation of miRNA genes suitable as reference genes in qPCR analyses of miRNA gene expression in Atlantic salmon（Salmo salar）［J］. BMC Res Notes， 2014， 7：945.

［69］ Kou SJ， Wu XM， Liu Z， et al. Selection and validation of suitable reference genes for miRNA expression normalization by quantitative RT-PCR in citrus somatic embryogenic and adult tissues［J］. Plant Cell Rep， 2012， 31（12）：2151-2163.

［70］ Lin YL， Lai ZX. Evaluation of suitable reference genes for normaliza tion of microRNA expression by real time reverse transcription PCR analysis during longan somatic embryogenesis［J］. Plant Physiol Biochem， 2013， 66：20-25.

［71］ Ferdous J， Li Y， Reid N， et al. Identification of reference genes for quantitative expression analysis of microRNAs and mRNAs in barley under various stress conditions［J］. PLoS One， 2015， 10（3）：e0118503.

［72］ Sikand K， Singh J， Ebron JS， et al. Housekeeping gene selection advisory：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）and b -Actin are targets of miR-644a［J］. PLoS One， 2012， 7（10）：e47510.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advance on miRNA qPCR Methods and Its Application

FENG Shi-peng
（Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource，College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）

miRNA is one of the hottest research fields in the world. The detection of miRNA expression is the fundamental content in miRNA research. Due to the feature of miRNAs being short and small， varied methods were developed， and quantitative miRNA qPCR is the most widely used one. This paper reviews the developments of miRNA extraction method， quantitative detection principle of miRNA qPCR，primer design， the reaction condition， and reference gene selection. The developments of miRNA qPCR methods in the future are also discussed. All of these may provide a reference for researchers in the field when they detect miRNA by qPCR method.

miRNA；stem-loop RT-PCR；poly（A）tailing RT-PCR；extension RT-PCR；digital PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.008

2015-04-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460178），海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（314042），海南省教育廳項(xiàng)目（HNKY2014-16），海南大學(xué)科研啟動(dòng)項(xiàng)目（kyqd1306）

馮世鵬，男，博士，講師，研究方向：miRNA功能與作用機(jī)制；E-mail：feng_shipeng@hainu.edu.cn