吳 珊, 俞思羽, 姜 薇, 2, 張立奎, 2, 靳翠麗, 2, 周曉見, 2

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一株海綿附生芽孢桿菌的抗硅藻附著活性成分的分離鑒定

吳 珊1, 俞思羽1, 姜 薇1, 2, 張立奎1, 2, 靳翠麗1, 2, 周曉見1, 2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225127; 2. 揚(yáng)州大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)研究所, 江蘇揚(yáng)州 225127)

為尋找天然抗污損活性化合物, 以抗硅藻附著活性為導(dǎo)向, 采用有機(jī)溶劑萃取、半制備高壓液相色譜對(duì)分離自海綿的芽孢桿菌UST050418-715代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離, 純化抗硅藻附著活性物質(zhì), 并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、核磁共振波譜分析活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)。從菌株UST050418-715代謝產(chǎn)物中分離得到7種具有抗硅藻附著活性的環(huán)二肽類化合物, 分別鑒定為: (1)環(huán)(L-亮氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-)、(2)環(huán)(L-纈氨酸-L-脯氨酸)、(3)環(huán)(D-脯氨酸-L-亮氨酸)、(4)環(huán)(L-脯氨酸-D-亮氨酸)、(5)環(huán)(甘氨酸-L-脯氨酸)、(6)環(huán)(L-苯丙氨酸-順式-8-羥基-D-脯氨酸-)、(7)環(huán)(L-苯丙氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-)。說明海綿附生芽孢桿菌UST050418-715代謝產(chǎn)物中存在大量環(huán)二肽類化合物, 可以幫助宿主海綿實(shí)現(xiàn)對(duì)硅藻附著的化學(xué)防御。

抗硅藻附著; 芽孢桿菌; UST050418-715; 環(huán)二肽

海洋生物污損一直是亟待解決的一個(gè)問題, 在全球范圍內(nèi)給人類造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。海洋污損生物是指棲息、附著及生長(zhǎng)在船舶和各類人工設(shè)施上給海洋開發(fā)活動(dòng)帶來負(fù)效益的動(dòng)物、植物、微生物的總稱[2]。其中, 海洋硅藻是海洋生物污損過程的初始附著生物之一, 具有種類多、數(shù)量大、繁殖快等特點(diǎn), 其在水下固相表面的附著可誘導(dǎo)后期藤壺、貝類以及無脊椎動(dòng)物等大型污損生物的附著生長(zhǎng); 形成復(fù)雜的污損生態(tài)群落, 加速金屬的腐蝕、影響設(shè)備的正常使用, 影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)量和質(zhì)量[3-5]。所以, 抑制海洋硅藻的附著, 可以推遲或阻止大型污損生物的附著, 對(duì)海洋生物污損的防治起著至關(guān)重要的作用。

針對(duì)海洋生物污損, 人們探索多種防污方法, 如防污涂料涂裝法、超聲波振動(dòng)法、氯氣注入法、海水電解法、銅-鎳合金粘貼法、海水間歇加熱法、低表面自由能材料粘貼法等[6]。其中, 防污涂料技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單, 通過化學(xué)防污劑的受控釋放, 阻止海洋生物在物體表面的附著, 是應(yīng)用最廣泛的方法[7]。20世紀(jì)70年代起使用的有機(jī)錫、氧化亞銅及合成的殺蟲劑等防污劑, 是通過毒殺附著生物達(dá)到防污目的。由于這些傳統(tǒng)防污劑對(duì)非目標(biāo)生物也有嚴(yán)重的毒性, 對(duì)海洋生態(tài)造成其不可恢復(fù)的損傷,因而于20世紀(jì)80年代末相繼被禁用或限用[8]。近年來, 隨著天然產(chǎn)物化學(xué)的發(fā)展, 海洋天然防污劑以其無毒的防污作用引起了人們注意[9]。海洋天然防污劑是指從一些海洋生物如紅藻、珊瑚、海綿等生物體中提取的具有防污活性的天然物質(zhì), 目前已報(bào)道的物質(zhì)包括有機(jī)酸、內(nèi)酯、萜類、甾醇類、環(huán)二肽類和吲哚類等; 它們降解速度快, 且不危害海洋生物的生命, 有利于保持生態(tài)平衡[8, 10-11]。因此, 尋找海洋天然防污損化合物已成為獲得高效、無毒、環(huán)境友好型防污劑的重要途徑之一。

海洋植物(如紅藻、褐藻等)、海洋動(dòng)物(如珊瑚、海綿等)是海洋天然抗污損物質(zhì)的良好來源, 但由于生長(zhǎng)期長(zhǎng)、規(guī)?；囵B(yǎng)條件高等原因, 難以滿足商業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)需要[12]。相比較而言, 海洋微生物(細(xì)菌、真菌等)容易大規(guī)模培養(yǎng), 生長(zhǎng)周期短, 更具有優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿10, 13-14]。海綿以其復(fù)雜的孔狀結(jié)構(gòu)和濾食系統(tǒng)成為海洋微生物的天然宿主, 其體內(nèi)微生物的密度高達(dá)109個(gè)/mL。越來越多的研究證實(shí), 海綿中分離到的活性物質(zhì), 其真正來源是共附生的海洋微生物[15-16]。而固著生長(zhǎng)的海綿具有化學(xué)防御機(jī)制, 不會(huì)受到污損生物的附著。因此, 海綿共附生微生物在其化學(xué)防御中的作用以及從其共附生微生物中尋找天然防污損化合物, 成為目前研究新熱點(diǎn)[17-20]。Kon-ya等[21]從海綿中分離出的細(xì)菌sp.的培養(yǎng)液中提取出了泛酶-8, 能有效抑制紋藤壺附著。朱建生等[22]從海綿sp.附生菌中提取出了具有抗硅藻附著活性的環(huán)(苯丙氨酸-丙氨酸)和環(huán)(丙氨酸-色氨酸)等環(huán)二肽類化合物。本課題組前期從海綿共附生微生物藻種庫(kù)中篩選到一株抗硅藻附著的芽孢桿菌UST050418-715, 并發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)小新月菱形藻、咖啡雙眉藻、碎片菱形藻等多種硅藻的附著現(xiàn)象都有較為明顯的抑制效果[12, 23]。

本研究以抗硅藻附著活性為導(dǎo)向, 對(duì)該菌株代謝產(chǎn)物中的抗硅藻附著活性組分進(jìn)行分離純化, 并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu), 為海綿共附生芽孢桿菌作為天然抗污損活性物質(zhì)來源做一嘗試。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

試驗(yàn)菌株UST050418-715由香港科技大學(xué)海岸海洋實(shí)驗(yàn)室錢培元教授課題組提供, 從采集于美國(guó)華盛頓州圣璜島附近海域48.55°N, 123.01°W的海綿樣品中分離[12, 23]。該菌株經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定為短小芽孢桿菌()。

培養(yǎng)基配方為: 蛋白胨7.5 g/L, 酵母粉3.0 g/L、NaCl 10.45 g/L、MgCl25.90 g/L、MgSO4·7H2O 3.24 g/L、CaCl21.80 g/L、KCl 0.55 g/L、檸檬酸鐵0.10 g/L, pH為9.5。瓊脂培養(yǎng)基: 在以上配方中加入瓊脂15~20 g/L。

1.2 菌株UST050418-715粗提物的制備

按朱建生等[23](2013)的方法培養(yǎng)和發(fā)酵菌株。在發(fā)酵產(chǎn)物中加入等體積的乙酸乙酯(含5 %丙酮)進(jìn)行震蕩萃取分離, 收集上層有機(jī)相, 萃取三次; 萃取液在37℃水浴下減壓濃縮后, 移入小離心管, 用冷凍離心濃縮儀凍干, 4℃避光保存[23-24]。

1.3 抗硅藻附著活性測(cè)試

測(cè)試硅藻為小新月菱形藻(), 由中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院藻種室提供。硅藻采用f/2培養(yǎng)液[25]。

將離心后的硅藻經(jīng)人工海水洗滌, 調(diào)整密度后和待測(cè)樣品在24孔板上混合, 使樣品的最終測(cè)試濃度均為100mg/mL。經(jīng)24 h光照培養(yǎng)后, 注入人工海水洗滌。最后, 于顯微鏡下觀察孔底附著的硅藻數(shù)量。具體測(cè)試方法按照靳翠麗(2015)方法進(jìn)行[23]。

抑制率計(jì)算公式:

1.4 抗硅藻活性物質(zhì)的分離純化

將UST050418-715菌株進(jìn)行批量發(fā)酵, 共120 L, 萃取、蒸餾得到13 g粗提物。將其溶于甲醇進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速2000??r/min)去除無機(jī)鹽, 取上清液蒸干得到粗提物10.5 g。在蒸干的粗提物中加入100 mL 的純水, 用玻璃棒攪拌, 并用超聲在30℃下溶解。用等體積的石油醚萃取3次, 收集石油醚相; 再用等體積的二氯甲烷萃取3次, 收集二氯甲烷相; 之后用等體積的乙酸乙酯萃取3次, 收集乙酸乙酯相; 最后用等體積的正丁醇萃取3次, 分別收集正丁醇相和水相, 將以上收集到的五相用旋蒸儀濃縮蒸干, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

活性物質(zhì)的半制備HPLC分離純化使用LabTech半制備HPLC, 色譜柱: C18(250 mm × 10 mm, 5 μm); 流速: 2 mL/min; UV檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng): 210 nm。樣品用甲醇溶解, 14 000 r/min離心5 min, 取上清液進(jìn)樣。選取一定比例的甲醇水為流動(dòng)相, 根據(jù)出峰的保留時(shí)間收集流出液。

1.5 抗硅藻活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析

GC-MS分析采用Thermo ITQ900系統(tǒng), 配制的GC運(yùn)行條件: 色譜柱為DB-VRX毛細(xì)管柱(60.0 m × 250 μm × 1.40 μm), 載氣為高純He, 進(jìn)樣口溫度280℃, 10︰1分流進(jìn)樣模式, 進(jìn)樣量1 μL, 柱流速1 mL/min, 程序升溫, 起始溫度40℃, 保持3 min, 以10℃/min升到300℃, 保持5 min。MS運(yùn)行條件: EI離子源, 離子源溫度為250℃, 質(zhì)量掃描范圍為50~650 amu。

將5 mg左右真空干燥后的樣品, 溶于0.5 mL氘代DMSO中, 裝入核磁共振, 利用Bruker AVANCE 600核磁共振波譜儀在600 MHz下共振測(cè)量, 得到1H-NMR譜。利用Anton Paar MCP300 旋光儀測(cè)得化合物比旋光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑萃取結(jié)果

按照極性從小到大的順序用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四種有機(jī)溶劑對(duì)菌株UST050418- 715粗提物進(jìn)行萃取, 得到石油醚相(Fr-1)、二氯甲烷相(Fr-2)、乙酸乙酯相(Fr-3)、正丁醇相(Fr-4)和水相(Fr-5)。

測(cè)定初分離各相的抗硅藻附著活性, 結(jié)果見圖1。由圖1可見, 5個(gè)組分對(duì)硅藻的附著均有抑制作用, 相對(duì)于極性中等和偏大的Fr-3、Fr-4和Fr-5, 極性偏小的Fr-1和Fr-2硅藻抑制活性更好, 說明活性主要集中在中偏小極性區(qū)。從質(zhì)量分布來看, 二氯甲烷相Fr-2(質(zhì)量占比41.7%)最大, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他相, 而其他各相質(zhì)量占比差異較小。因中等極性的片段分離難度小, 本研究選取抗硅藻附著活性最好和質(zhì)量占比最大的二氯甲烷相Fr-2和極性中等的乙酸乙酯相Fr-3進(jìn)行下一步的分離。

2.2 二氯甲烷相(Fr-2)的半制備HPLC分離

對(duì)中小極性片段二氯甲烷相Fr-2, 進(jìn)行半制備HPLC的分離純化。其分離、純化流程圖如圖2所示。

通過半制備HPLC對(duì)Fr-2(二氯甲烷相)進(jìn)行分離(MeOH-H2O=40%), 得到組分Fr-2.1~Fr-2.8, 其半制備高壓液相制備分離的保留時(shí)間截點(diǎn)圖見圖3。Fr-2.3、Fr-2.5從液相譜圖上看都是單峰且峰面積占比較大, 因此在出峰時(shí)將其從半峰高到峰頂?shù)牟糠謫为?dú)接出, 就能得到相對(duì)較純的組分, 分別標(biāo)記為Fr-2.3*、Fr-2.5*。在24孔板下測(cè)定Fr-2(二氯甲烷相)經(jīng)半制備HPLC分離得到的Fr-2.1~Fr-2.8各組分的抗硅藻附著活性, 結(jié)果如圖4所示。

其中制備得到較純的組分Fr-2.3*(抑制率12.7%)、Fr-2.5*(抑制率-10%), 都沒有表現(xiàn)出顯著活性。而Fr-2.4(抑制率57%)、Fr-2.6(抑制率65.5%)、Fr-2.7(抑制率61.5%)、Fr-2.8(抑制率66.5%)都對(duì)硅藻表現(xiàn)出一定的抑制作用, 但是從其液相圖譜上看都不是單一組分, 因此對(duì)Fr-2.4、Fr-2.6、Fr-2.7進(jìn)行進(jìn)一步的半制備HPLC分離(MeOH-H2O=30%), Fr-2.8由于極性太小, 分離比較費(fèi)時(shí), 直接對(duì)其嘗試結(jié)構(gòu)分析。

對(duì)Fr-2.4組分進(jìn)行半制備HPLC分離, 得到6個(gè)組分分別記為Fr-2.4.1~Fr-2.4.6, 測(cè)定各組分抗硅藻附著活性, 發(fā)現(xiàn)Fr-2.4.1和Fr-2.4.5的活性相對(duì)較好, 抑制率分別為67%和39%。從半制備液相譜圖上看Fr-2.4.2、Fr-2.4.4、Fr-2.4.6均為單峰, Fr-2.4.3和Fr-2.4.5在半制備液相譜圖上看均有兩個(gè)峰, 成分相對(duì)簡(jiǎn)單。

對(duì)Fr-2.6組分進(jìn)行半制備HPLC分離, 得到6個(gè)組分分別記為Fr-2.6.1~Fr-2.6.6, 測(cè)定各組分抗硅藻附著活性, 發(fā)現(xiàn)Fr-2.6.2對(duì)硅藻有顯著的抑制活性, 抑制率達(dá)98%, Fr-2.6.1也有一定的抑藻活性, 抑制率為58.6%。其余組分沒有表現(xiàn)出明顯的抑制活性。從半制備液相譜圖上看, Fr-2.6.3組分較純呈單峰, Fr-2.6.4和Fr-2.6.5相對(duì)較純, 都有一個(gè)峰面積較大的主峰。活性最好的Fr-2.6.2液相譜圖并不是單峰, 有四個(gè)較大的峰, 進(jìn)一步分離純化(MeOH-H2O=30%)得到4個(gè)組分記為Fr-2.6.2.1~Fr-2.6.2.4, 從其液相譜圖看來只有Fr-2.6.2.4的組分比較單一?；钚云浯蔚腇r-2.6.1, 從液相譜圖上看, 有三個(gè)較大的峰。

對(duì)Fr-2.7組分進(jìn)行半制備HPLC分離, 得到3個(gè)組分分別記為Fr-2.7.1、Fr-2.7.2和Fr-2.7.3, 測(cè)定各組分抗硅藻附著活性, 發(fā)現(xiàn)Fr-2.7.2的活性相對(duì)較好, 抑制率為58%, 另外兩個(gè)組分沒有表現(xiàn)出明顯的抑藻活性。從半制備液相譜圖上看, Fr-2.7.1和Fr-2.7.3組分較純, 都呈單峰。而有一定抑藻活性的Fr-2.7.2其液相譜圖并不是單峰。

對(duì)以上經(jīng)液相完成初步純化的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2.3 乙酸乙酯相Fr-3的半制備HPLC分離

對(duì)中極性片段乙酸乙酯相Fr-3, 進(jìn)行半制備HPLC的分離純化。其分離、純化流程圖見圖5。

*. 表示片段中較純的部分

*. indicates the purer portionof the fragment

通過半制備HPLC對(duì)Fr-3(乙酸乙酯相)進(jìn)行制備分離(MeOH-H2O=40%), 得到組分Fr-3.1~ Fr-3.7, 其半制備高壓液相制備分離的保留時(shí)間截點(diǎn)圖見圖6。Fr-3.2、Fr-3.5、Fr-3.7從液相譜圖上看都是單峰且峰面積占比較大, 因此在出峰時(shí)將其從半峰高到峰頂?shù)牟糠謫为?dú)接出, 就能得到相對(duì)較純的組分, 分別標(biāo)記為Fr-3.2*、Fr-3.5*、Fr-3.7*。

在24孔板下測(cè)定Fr-3(乙酸乙酯相)經(jīng)半制備HPLC分離得到的Fr-3.1 ~ Fr-3.7各組分的抗硅藻附著活性, 結(jié)果如圖7所示。

其中制備得到較純的組分Fr-3.2*、Fr-3.5*、Fr-3.6、Fr-3.7*中, Fr-3.7*(抑制率11.0%)活性很差, Fr-3.2*和Fr-3.5*抑制率分別為46.3%和30.7%, 但活性在重復(fù)測(cè)試中的穩(wěn)定性不高。Fr-3.3(抑制率44.8%)是10個(gè)組分中活性相對(duì)最好且活性表現(xiàn)最穩(wěn)定的組分, 因此對(duì)Fr-3.3進(jìn)行進(jìn)一步的半制備HPLC分離。

Fr-3.3的極性較大, 用10%的甲醇水對(duì)其進(jìn)行半制備HPLC純化, 得到組分Fr-3.3.1~Fr-3.3.8, 測(cè)定各組分抗硅藻附著活性, 其中Fr-3.3.8的硅藻抑制活性最好, 抑制率高達(dá)90%, 液相譜圖上看組分單一, 且由于組分質(zhì)量較少, 沒有進(jìn)行更進(jìn)一步的分離工作。

對(duì)以上經(jīng)液相完成初步純化的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2.4 抗硅藻活性化合物結(jié)構(gòu)的分析鑒定

通過GC-MS對(duì)前面獲得的共計(jì)34個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定, 說明其中共有12個(gè)樣品純度較高, 包括: Fr-2.1(101mg)、Fr-2.3*(244mg)、Fr-2.4.2(7.8mg)、Fr-2.4.3(5.7mg)、Fr-3.2*(62mg)、Fr-3.5*(295mg)、Fr-3.6(89mg)、Fr-3.7*(116mg)、Fr-2.6.5(16mg)、Fr-2.7.1(27mg)、Fr-2.7.2(3.7mg)、Fr-2.6.2.4(4mg)。12個(gè)組分的GC-MS分析結(jié)果見表1, 其中Fr-2.3*未測(cè)出結(jié)果, Fr-2.4.2、Fr-3.5*、Fr-3.6和Fr-3.7*未定出分子式。Fr-2.4.3、Fr-2.6.2.4、Fr-2.6.5、Fr-2.7.1、Fr-2.7.2的GC-MS測(cè)定結(jié)果分子質(zhì)量都為210, Fr-2.4.2、Fr-3.5*的GC-MS測(cè)定結(jié)果分子量都為226, Fr-3.6和Fr-3.7*的GC-MS測(cè)定結(jié)果分子質(zhì)量都為260, 推測(cè)它們可能是有不同的同分異構(gòu)體。其他活性較好組分, 如Fr-2.8、Fr-2.6.2.1、Fr-2.6.2.2、Fr-2.6.2.3、Fr-3.3.5, 由其GC-MS譜圖來看成分純度不高, 難以推測(cè)其所含活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)。

表1 12個(gè)組分的GC-MS分析結(jié)果

注: “—”代表未測(cè)出結(jié)果

根據(jù)GC-MS的初步分析, 選取上述12個(gè)較純的樣品進(jìn)行1H-NMR波譜分析。樣品性狀和1H NMR分析結(jié)果如下:

Fr-2.3*、Fr-2.4.2、Fr-3.5*為白色粉末;- 102.3 (1.0, MeOH); 分子式: C11H18N2O3;1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH0.87 (3H, d,=6.5 Hz, H-13), 0.85 (3H, d,=6.5 Hz, H-12), 1.35 (1H, m, H-10b), 1.78(1H, m, H-10a), 1.87-1.93 (2H, overlap, H-7b, H-11), 2.03 (1H, m, H-7a), 3.23 (1H, d,=12.3 Hz, H-9a), 3.48 (1H, dd,=4.3, 12.3 Hz, H-9b), 3.49 (1H, m, H-6), 4.04 (1H, t,=6.0 Hz, H-3), 4.38 (1H, m, H-8), 5.08 (1H, brs, OH), 7.98 (1H, brs, 4-NH)。參照Liu H等2010年的文獻(xiàn), 確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(L-亮氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-) [cyclo (L-leu-trans-8-hydroxy-L-pro)] (見圖8-化合物1)[15, 26]。

Fr-2.6.5為無色針晶; 分子式: C11H18N2O2;+ 89.2 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH0.89 (3H, d,=6.6 Hz, H-12), 0.91 (3H, d,=6.6 Hz, H-13), 1.45 (1H, m, H-10a), 1.56 (1H, m, H-11), 1.77-1.82 (4H, overlap, H-7a, H-8, H-10b), 2.14 (1H, m, H-7b), 3.33 (1H, m, H-9a), 3.34 (1H, m, H-9b), 3.60 (1H, m, H-3), 4.16 (1H, dd,=6.4, 1.5 Hz, H-6), 8.33 (1H, d,=3.2 Hz, 4-NH)。參照Adamczeski M等1999年以及朱建生2013年的文獻(xiàn), 確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(D-脯氨酸-L-亮氨酸) [cyclo (D-pro-L-leu)](見圖8-化合物3)[15, 27, 29]。

Fr-2.7.1為無色針晶; 分子式: C11H18N2O2;– 81.5 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH0.87 (6H, overlap, H-12, H-13), 1.35 (1H, m, H-11), 1.76-1.87 (6H, overlap, H-7, H-8, H-10), 3.38 (2H, m, H-9), 4.00 (1H, m, H-3), 4.18 (1H, m, H-6), 7.98 (1H, brs, 4-NH)。將1H NMR數(shù)據(jù)與朱建生2013年以及劉濤等2009年的文獻(xiàn)對(duì)照, 確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(L-脯氨酸-D-亮氨酸)[cyclo (L-pro-D-leu)] (見圖8-化合物4)[15, 29-30]。

Fr-3.2*為無色塊晶; 分子式: C7H10N2O2;– 98.2 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH1.78-1.87 (3H, overlap, H-7a, H-8), 2.13 (1H, m, H-7b), 3.33 (1H, m, H-9b), 3.41 (1H, m, H-9a), 3.51 (1H, dd,=4.5, 16.2 Hz, H-3a), 3.99 (1H, d,=16.2 Hz, H-3b), 4.12 (1H, dd,=6.0, 8.0 Hz, H-6), 8.05 (1H, brs, 4-NH)。將1H NMR數(shù)據(jù)與Liu H等2010年的文獻(xiàn)對(duì)照完全一致, 但是旋光值完全相反, 因而結(jié)構(gòu)確定為環(huán)(甘氨酸-D-脯氨酸)的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體, 為環(huán)(甘氨酸-L-脯氨酸) [cyclo (gly-L-pro)] (見圖8-化合物5)[15, 26]。

Fr-3.6呈無色油狀; 分子式: C14H16N2O3;+ 31.0 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH1.84 (1H, m, H-7a), 2.11 (1H, m, H-7b), 2.92 (1H, dd,=3.5, 15.0 Hz, H-10a), 3.02 (1H, dd,=5.0, 15.0 Hz, H-10b), 3.14 (2H, m, H-9), 3.45 (1H, dd,=3.5, 5.0 Hz, H-3), 3.97 (1H, m, H-6), 4.11 (1H, m, H-8), 5.00 (1H, brs, 5-OH), 7.26-7.30 (5H, overlap, H-11, 12, 13, 14, 15, 16), 8.13 (1H, brs, 4-NH)。參照朱建生2013年以及Shigemori 等1998年的文獻(xiàn), 確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(L-苯丙氨酸-順式-8-羥基-D-脯氨酸-)[cyclo (L- phe-cis-8-hydroxy-D-pro)](見圖8-化合物6)[15, 29, 31]。

Fr-3.7*呈無色油狀; 分子式: C14H16N2O3;–35.9 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH1.52 (1H, m, H-7a), 1.94 (1H, m, H-7b), 3.02 (1H, dd,=5.0, 15.0 Hz, H-10a), 3.06 (1H, dd,=5.4, 15.0 Hz, H-10b), 3.07 (1H, dd,=3.8, 12.0 Hz, H-9a), 3.13 (1H, overlap, H-9b), 4.19 (1H, t,=5.2, H-3), 4.31 (1H, dd,=6.2, 11.2 Hz, H-6), 4.39 (1H, m, H-8), 5.10 (1H, brs, OH), 7.19-7.29 (5H, overlap, H-12, 13, 14, 15, 16), 7.95 (1H, brs, 4-NH)。參照Liu 等2010年以及朱建生2013年的文獻(xiàn), 確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(L-苯丙氨酸-反式- 8-羥基-L-脯氨酸-) [cyclo (L-phe-trans-8-hydroxy-L- pro)](見圖8-化合物7)[15, 26, 29]。

Fr-2.1、Fr-2.6.2.4、Fr-2.7.2樣品不純, 無法根據(jù)1H-NMR解析出結(jié)構(gòu)。

綜上, 通過半制備HPLC對(duì)海綿附生芽孢桿菌UST050418-715代謝產(chǎn)物中具有抗硅藻附著活性的組分進(jìn)行活性導(dǎo)向的分離純化, 并采用GC-MS和1H-NMR對(duì)分離得到的較純活性組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析, 得到7種環(huán)二肽類化合物, 分別鑒定為:

(1) Fr-2.3*、Fr-2.4.2和Fr-3.5*的主要成分為同種物質(zhì), 均為環(huán)(L-亮氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-) [cyclo(L-leu-trans-8-hydroxy-L-pro)], 其抑制率最高達(dá)30.7%±5.0%;

(2) Fr-2.4.3的平面結(jié)構(gòu)為環(huán)(L-纈氨酸-L-脯氨酸)[cyclo (L-val-L-pro)], 其抑制率為28.0%±10.4%;

(3) Fr-2.6.5為環(huán)(D-脯氨酸-L-亮氨酸)[cyclo (D-pro-L-leu)], 其抑制率為28.0%±12.6%;

(4) Fr-2.7.1為環(huán)(L-脯氨酸-D-亮氨酸)[cyclo (L-pro-D-leu)], 其抑制率為18.0%±2.8%;

(5) Fr-3.2*為環(huán)(甘氨酸-L-脯氨酸)[cyclo (gly- L-pro)] , 其抑制率為46.3%±10.8%;

(6) Fr-3.6為環(huán)(L-苯丙氨酸-順式-8-羥基-D-脯氨酸-)[cyclo (L-phe-cis-8-hydroxy-D-pro)], 其抑制率為28.7%±11.3%;

(7) Fr-3.7*為環(huán)(L-苯丙氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-)[cyclo (L-phe-trans-8-hydroxy-L-pro)], 其抑制率為11%±5.5%。

3 討論

海洋生物污損一直是困擾人類的棘手難題, 現(xiàn)行的防污措施都只是臨時(shí)的, 沒有從根本上解決問題。開發(fā)高效、無毒、環(huán)境友好的活性化合物, 是目前國(guó)內(nèi)外都比較看好的解決途徑。從海洋微生物中尋找這種環(huán)境友好的天然抗污損化合物是切實(shí)可行的, 我國(guó)在海洋微生物資源的開發(fā)方面, 起步較晚, 因此有很大的潛力和發(fā)展空間。

海綿其獨(dú)特的化學(xué)防御機(jī)制一般認(rèn)為與其共附生微生物相關(guān), 海綿附生微生物可產(chǎn)生具有顯著抗污損活性的次生代謝產(chǎn)物。本研究所采用的試驗(yàn)菌株UST050418-715, 為海綿附生芽孢桿菌, 在前期研究中, 發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種硅藻的附著都有較為明顯的抑制作用。本文以抗硅藻附著活性作為追蹤指標(biāo), 利用溶劑萃取和半制備HPLC相結(jié)合的手段, 從該活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物中分離活性化合物。并通過結(jié)構(gòu)鑒定, 得到7種環(huán)二肽類化合物, 對(duì)硅藻附著均有一定的抑制作用。這一結(jié)果和朱建生等從海綿附著菌中分離到多個(gè)具有抗硅藻活性的環(huán)二肽的報(bào)道相似[22]。說明環(huán)二肽在海綿附生微生物幫助宿主進(jìn)行化學(xué)防御的過程中起重要作用。同時(shí), 實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn), 活性隨著分離純化的深入有一定程度的丟失, 說明可能化合物間存在一定的協(xié)同效應(yīng)。

環(huán)二肽類化合物廣泛存在于自然界中, 報(bào)道的活性不僅有抗污損, 還有抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)激素、抑制群體感應(yīng)等廣泛的生物活性[32-33]。另外, 環(huán)二肽類化合物多樣性極高, 混合樣品間的協(xié)同效應(yīng)存在的可能性也較大。因此將其作為海洋天然產(chǎn)物防污劑用于海洋生物防污具有較高的可能性和選擇性[32, 34-35]。

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Isolation and identification of active compounds inhibiting diatom settlements using sponge-associatedsp.

WU Shan1, YU Si-yu1, JIANG Wei1, 2, ZHANG Li-kui1, 2, JIN Cui-li1, 2, ZHOU Xiao-jian1, 2

(1. College of Environmental Science & Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China; 2. Marine Science & Technology Institute, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)Received：Oct. 10, 2015

antidiatom settlement;sp. ; UST050418-715; cyclic dipeptides

In order to search for natural antifouling compounds, the compounds inhibiting diatom settlements were purified from the metabolites of a sponge-associatedsp. UST050418-715 via purification of organic solvent extraction and semipreparative high-performance liquid chromatography (HPLC) using antidiatom- settlement assays. The structures of active compounds were analyzed via gas chromatography–mass spectroscopy (GC–MS) and1H nuclear magnetic resonance (NMR). Consequently, seven active cyclic dipeptides in addition to dozens of fractions were isolated and purified. The seven cyclic dipeptides were identified as (1) cyclo (L-leu-trans-8- hydroxy-L-pro), (2) cyclo (L-val-L-pro), (3) cyclo (D-pro-L-leu), (4) cyclo (L-pro-D-leu), (5) cyclo (gly-L-pro), (6)cyclo (L-phe-cis-8-hydroxy-D-pro), and (7) cyclo (L-phe-trans-8-hydroxy-L-pro). The results of this study indicate that multiple cyclic dipeptides exist in the metabolites of sponge-associatedsp. UST050418-715 and contribute to the host’s chemical defense.

P735

A

1000-3096(2016)07-0023-10

10.11759/hykx20151010003

2015-10-10;

2015-11-16;

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41306131, 41106113, 41271521); 教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目資助項(xiàng)目(211065); 江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2012267, BK20130440); 江蘇省教育廳高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(13KJB180029, 15KJB170020)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 41306131, No. 41106113 and No. 41271521; Key Project of Chinese Ministry of Education, No. 211065; Natural Science Foundation Grant of Jiangsu Province, China, No. BK2012267 and No. BK20130440; Natural Science Foundation for College and University of Jiangsu Province, No. 13KJB180029 and No.15KJB170020]

吳珊, 山西晉中人, 碩士研究生, 研究方向: 環(huán)境科學(xué), E-mail: 15298466716@163.com;周曉見,通信作者, 博士, 教授, E-mail: zhouxiaojian@yzu.edu.cn

(本文編輯: 康亦兼)