劉曉斌　李　民　侯明山　藺鵬楨　繆星宇　楊　軍陜西省人民醫(yī)：神經(jīng)外科，陜西西安710061

神經(jīng)節(jié)苷脂和神經(jīng)生長(zhǎng)因子在大鼠不同嚴(yán)重程度腦損傷治療中的協(xié)同作用

劉曉斌李民侯明山藺鵬楨繆星宇楊軍
陜西省人民醫(yī)：神經(jīng)外科，陜西西安710061

目的觀察神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）對(duì)患有不同嚴(yán)重程度腦損傷大鼠的治療作用，以探討GM1與NGF可能存在的協(xié)同作用以及兩者治療效果的差異性。方法140只10周健康的雄性SD大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型A組、模型B組、模型C組，使用電子顱腦損傷儀（eCCI）制備模型A/B/C，打擊深度均為3mm，打擊速度分別為3、4、5m/s。其中模型A/B/C組再分以空白組、GM1治療組、NGF治療組和GM1+NGF治療組。給藥后分別在24、48、72 h用ELISA方法檢測(cè)血清中S100B和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的含量。結(jié)果損傷發(fā)生后第24小時(shí)各組S100B和NSE含量均達(dá)到最高點(diǎn)，隨后呈下降趨勢(shì)；同一模型不同治療組內(nèi)，GM1+NGF治療組下降趨勢(shì)最顯著（P＜0.05）；不同模型間，中度腦損傷模型的GM1+NGF治療組下降最為顯著（P＜0.05）。結(jié)論GM1和NGF聯(lián)合使用治療比單獨(dú)使用GM1或者NGF效果要好，兩者存在協(xié)同作用；而且GM1和NGF聯(lián)合使用治療對(duì)于中度腦損傷情況效果最佳。

GM 1；NGF；顱腦損傷；協(xié)同作用

［Avsteact］Ov jective To observe the therapeutic effect of ganglioside（GM1）and nerve growth factor（NGF）on the severity of brain injury in rats，and to explore the synergy and the difference of therapeutic effect between GM1 and NGF.M ethods A total of 140 10 weeks healthy male rats were randomly divided into 5 groups：normal group，sham group，model A group，model B group and model C group，then the traumatic brain injury model were prepared by electric Cortical Contusion Impactor（eCCI），the hit depth was 3 mm，the hit speed ofmodel A/B/C was 3 m/s，4 m/s and 5 m/s respectively.Then the model A/B/C was divided into 4 groups：blank group，GM1 group，NGF group and GM1+NGF group respectively.ELISA method was used to detect serum S100B and NSE concentration after treatment at24 h，48 h and 72 h respectively.Results S100B and NSE levels in each group had reached the highest point at 24 h after injury，and then decreased.Different treatment groups within the same model，GM1+NGF treatment group decreased themost significantly（P＜0.05））；between differentmodels，GM1+NG treatment group inmoderate brain injury model decreased themost significantly（P＜0.05）.Conclusion The therapeutic effect of GM1+NGF treatment group is better than GM1 or NGF，two drugs have synergistic brain protection，and the best therapeutic effect of GM1+NGF is to moderate brain injurymodel.

［Key woeds］GM1；NGF；Traumatic brain injury；Synergymechanism

顱腦損傷是臨床上常見(jiàn)、多發(fā)的神經(jīng)外科疾病，其發(fā)生率高居損傷中的第二位，我國(guó)每年死于創(chuàng)傷疾病的數(shù)十萬(wàn)中有一半來(lái)源于致命的顱腦損傷［1］。近年來(lái)，一些腦組織損傷特異性生化標(biāo)志物，如膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、髓鞘堿性蛋白（MBP）、S100B蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）等得到了臨床醫(yī)生和研究人員越來(lái)越多的關(guān)注，其中尤以S100B蛋白和NSE蛋白最為顯著，兩者作為特異性標(biāo)志物，在一定程度上可以反映出顱腦損傷的程度［2-3］。神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）和鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）是目前神經(jīng)外科臨床治療顱腦損傷的常用藥物，其中GM1有助于受損腦神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)元的功能恢復(fù)［4］，對(duì)腦損傷后繼發(fā)神經(jīng)的退化有保護(hù)作用［5］；而NGF對(duì)受傷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)和修復(fù)作用，其可以加速神經(jīng)纖維的再生和減輕繼發(fā)性損傷［6］。也有研究證明，GM1和NGF間具有復(fù)雜的生物學(xué)作用，可以明顯促進(jìn)神經(jīng)的再生行為［7］。本研究對(duì)不同程度顱腦損傷大鼠給予GM1和NGF治療，通過(guò)檢測(cè)S100B、NSE的變化，探討GM1和NGF對(duì)不同程度顱腦損傷的治療效果，以及探討GM1與NGF之間是否存在協(xié)同作用。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物材料及試劑、儀器

選取生長(zhǎng)至10周左右，健康成年雄性SD大鼠共140只，體重240～260 g（源自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：SYXK（陜）2012-003）。

戊巴比妥鈉（Sigma，USA），硫酸慶大霉素（西南藥業(yè)），神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）（廈門(mén)北大之路生物工程公司），鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）（齊魯制藥），電子顱腦損傷儀（eCCI），NSE ELISA試劑盒（R&D Systems，USA）、S100BELISA試劑盒（R&D Systems，USA）。

1.2eCCI造模及模型的分級(jí)

140只SD大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型A組、模型B組、模型C組，其中正常組和假手術(shù)組各10只大鼠，造模組各40只大鼠。利用美國(guó)VCU大學(xué)設(shè)計(jì)的電子顱腦損傷儀（eCCI）制備TBI動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)前12 h大鼠禁食，但不禁水。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，均為無(wú)菌操作。造模組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥（50 mg/kg）進(jìn)行麻醉處理，將大鼠俯臥固定在腦立體定向儀上。無(wú)菌條件下，在大鼠腦中線切開(kāi)頭皮，然后剝離骨膜，暴露出右頂骨。于冠狀縫后3 mm，矢狀縫中線旁2.5 mm處，用微型磨鉆打一個(gè)直徑為2 mm的骨孔，暴露硬腦膜，并保持硬膜完整。然后將大鼠移至eCCI打擊操作臺(tái)，分別設(shè)置合適的打擊參數(shù)（模型A組，擊打速度為3m/s，擊打深度為3mm；模型B組，擊打速度4m/s，擊打深度3mm；模型C組，擊打速度5 m/s，擊打深度3 mm）［8］，撞擊硬膜使腦組織瞬間形變。用硫酸慶大霉素處理切口，并用骨蠟封閉骨孔，然后縫合頭皮切口。當(dāng)觀察到大鼠恢復(fù)自主呼吸后放回籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于操作不當(dāng)，共造成死亡大鼠5只，均在造模后1 h內(nèi)發(fā)生死亡，通過(guò)補(bǔ)充新的大鼠并制作相應(yīng)的TBI模型以保證了各組模型鼠數(shù)量。造模結(jié)束后分別在第24、48、72小時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為檢測(cè)，并通過(guò)國(guó)際公認(rèn)的改良型大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分系統(tǒng)（mNSS）分別從平衡、反射、感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)四個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)大鼠的神經(jīng)功能，評(píng)分范圍0～18分，得分0分為正常，1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為中度損傷［9］。正常組大鼠不做任何處理，假手術(shù)組大鼠只做開(kāi)顱和縫合處理，不做打擊處理。

1.3給藥分組

模型A/B/C組分別再分為4個(gè)組，分別為空白組、GM1治療組、NGF治療組和GM1+NGF治療組，每組10只SD大鼠。根據(jù)GM1和NGF用藥執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，GM1治療組給藥模式為GM1 20mg/（kg·d）+生理鹽水10mL/（kg·d），其中GM1濃度為2mg/mL；NGF治療組給藥模式為NGF 2 000 U/（kg·d）+生理鹽水10mL/（kg·d），其中NGF濃度為200U/mL；GM1+NGF治療組GM1 20 mg/（kg·d）+NGF 2 000 U/（kg·d）；空白組給予注射等量的生理鹽水。各組均在大鼠造模結(jié)束后，放回籠中單獨(dú)飼養(yǎng)前以腹腔注射法給藥，每日一次，連續(xù)給藥3 d。

1.4ELISA法測(cè)定蛋白表達(dá)水平

正常組、假手術(shù)組和各處理組分別于造模后第24、48、72小時(shí)采集眼眶的靜脈血各1mL，4000 r/min離心處理后去血清，-20℃保存供ELISA法檢測(cè)S100B和NSE含量。按照NSE ELISA試劑盒（R&D Systems，USA）、S100BELISA試劑盒（R&D Systems，USA）的方法分別測(cè)定各樣品血清中NSE和S100B的含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠腦損傷建模與分級(jí)

正常組和假手術(shù)組在傷后72 h內(nèi)的觀察中mNSS評(píng)分均為0分，模型A組在造模后72 h內(nèi)mNSS評(píng)分平均值為（4.98±0.35）分，為輕度損傷；模型B組在造模后72 h內(nèi)mNSS評(píng)分平均值為（9.27±0.24）分，為中度損傷；模型C組在造模后72 h內(nèi)mNSS評(píng)分平均值為（14.41±0.43）分，為重度損傷。且3個(gè)模型組之間的mNSS評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　模型SD大鼠m NSS評(píng)分及分組（x±s）

2.2不同治療組S100B蛋白含量變化分析

模型A/B/C中各空白組大鼠血清中S100B蛋白濃度相較于正常組和假手術(shù)組都有明顯升高，而各給藥組大鼠血清中S100B蛋白濃度在造模后第24小時(shí)達(dá)到峰值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。GM1治療組和NGF治療組大鼠血清中的S100B蛋白濃度與空白組相較下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而兩組之間的大鼠血清中S100B蛋白濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GM1+NGF治療組大鼠血清中NSE蛋白濃度分別與GM1治療組和NGF治療組相比較，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1　各模型給藥后各組大鼠血清中S100B蛋白含量變化曲線分析

表2　給藥后各組大鼠血清中S100B蛋白含量測(cè)定（n=10，ng/L，x±s）

2.3不同治療組NSE蛋白含量變化分析

模型A/B/C中各空白組大鼠血清中NSE蛋白濃度相較于正常組和假手術(shù)組都有明顯升高，而各給藥組大鼠血清中NSE蛋白濃度在造模后第24小時(shí)達(dá)到峰值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。GM1治療組和NGF治療組大鼠血清中的NSE蛋白濃度與空白組相較下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而兩組之間的大鼠血清中NSE蛋白濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GM1+NGF治療組大鼠血清中S100B蛋白濃度分別與GM1治療組和NGF治療組比較，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

圖2　各模型給藥后各組大鼠血清中NSE蛋白含量變化曲線分析

表3　給藥后各組大鼠血清中NSE蛋白含量測(cè)定（n=10，ng/L，x±s）

2.4GM 1和NGF在不同模型中協(xié)同效應(yīng)分析

進(jìn)一步分析各模型GM1+NGF治療組S100B蛋白和NSE蛋白的下降趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，相較于模型A組（輕度損傷）和模型C組（重度損傷），GM1+NGF治療組的S100B蛋白含量下降趨勢(shì)在模型B組（中度損傷）最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在第48小時(shí)差別最大。而NSE蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于模型A組和模型C組，GM1+NGF治療組在模型B組顯示出良好的治療效果，在第1天就具有顯著的下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在后續(xù)2 d內(nèi)下降趨勢(shì)逐漸加強(qiáng)。見(jiàn)表4。

3　討論

顱腦損傷作為臨床上常見(jiàn)、多發(fā)的神經(jīng)外科疾病，其發(fā)生率高居損傷中的第二位，占全身?yè)p傷的10%～15%，我國(guó)每年死于創(chuàng)傷疾病的數(shù)十萬(wàn)中有一半來(lái)源于致命的顱腦損傷。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，顱腦損傷疾病在我國(guó)的發(fā)生率有上升的趨勢(shì)。此外，顱腦損傷有很高的致殘率和死亡率，這給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)［1］。

表4　不同模型中GM 1+NGF治療組S100B和NSE下降趨勢(shì)分析（%，x±s）

近年來(lái)，一些腦組織損傷特異性生化標(biāo)志物，如GFAP、MBP、S100B蛋白和NSE等得到了臨床醫(yī)生和研究人員越來(lái)越多的關(guān)注，其中尤以S100B蛋白和NSE蛋白最為顯著［2-3］。S100B蛋白存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺細(xì)胞中，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞完整性的特異標(biāo)志物［10］。當(dāng)顱腦受到損傷后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞遭到破壞，進(jìn)而S100B蛋白會(huì)由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中滲入到腦脊液，然后通過(guò)已受到損傷的血腦屏障進(jìn)入到外周血中［11］。因此，血清中的S100B蛋白濃度可以反映出星形膠質(zhì)細(xì)胞的受損程度［12］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損患者，其腦脊液和血清中的S100B蛋白濃度會(huì)升高［13］。NSE主要存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，其可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，被認(rèn)為是檢測(cè)腦損傷和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)［14］。顱腦受損傷，神經(jīng)元死亡，NSE被釋放到細(xì)胞間隙，進(jìn)而破壞血腦屏障進(jìn)入血液［15-16］。因此，當(dāng)腦組織損傷程度越嚴(yán)重，受損的神經(jīng)元會(huì)越多，血腦屏障受損也越高，而進(jìn)入血液的NSE蛋白水平也越高［17］，所以血液中的NSE蛋白濃度在一定程度上可以反映出顱腦損傷的程度［18］。

GM1和NGF是目前神經(jīng)外科臨床治療顱腦損傷的常用藥物，其中GM1有助于受損腦神經(jīng)元的功能恢復(fù)，對(duì)腦損傷后繼發(fā)神經(jīng)的退化有保護(hù)作用［19］；而NGF對(duì)受傷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)和修復(fù)作用，其可以加速神經(jīng)纖維的再生和減輕繼發(fā)性損傷［20］。也有研究證明，GM1和NGF間具有復(fù)雜的生物學(xué)作用，可以明顯促進(jìn)神經(jīng)的再生行為［7］。Kubota等［21］和張引成等［22］發(fā)現(xiàn)GM1能夠介導(dǎo)NGF促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生的作用，并具有很好的效果；Duchemin等［23］研究證實(shí)GM1可以上調(diào)SD大鼠腦內(nèi)NGF mRNAme的表達(dá)量；Cuello等［24］研究認(rèn)為外源性GM1可能是通過(guò)一種Ca2+依賴性信號(hào)通道來(lái)發(fā)揮對(duì)NGF生物學(xué)作用的增強(qiáng)效果。

本次研究利用電子顱腦損傷儀（eCCI）制備患有不同程度TBI的SD大鼠模型，對(duì)不同程度顱腦損傷大鼠給予GM1和NGF治療。結(jié)果顯示，各模型A/B/C中GM1治療組大鼠的S100B蛋白和NSE蛋白的濃度相較于為給予任何藥物治療的組別大鼠在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明GM1能夠有效降低S100B蛋白和NSE蛋白的表達(dá)，促進(jìn)受損腦神經(jīng)細(xì)胞的功能恢復(fù)，進(jìn)而對(duì)顱腦產(chǎn)生保護(hù)作用。同樣，在各模型A/B/C中NGF治療組大鼠的S100B蛋白和NSE蛋白的濃度相較于為給予任何藥物治療的組別大鼠在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明NGF對(duì)受傷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有保護(hù)和修復(fù)作用，其可以有效降低S100B蛋白和NSE蛋白的表達(dá)，并加速神經(jīng)纖維的再生和減輕繼發(fā)性損傷，促進(jìn)受損神經(jīng)元的恢復(fù)。此外，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，GM1與NGF均可以有效降低S100B蛋白和NSE蛋白的表達(dá)，且兩個(gè)治療組的S100B蛋白和NSE蛋白濃度無(wú)顯著性差異，這說(shuō)明兩者對(duì)顱腦產(chǎn)生的保護(hù)作用無(wú)明顯差異。

對(duì)于GM1+NGF治療組的研究結(jié)果顯示，使用GM1+NGF治療組大鼠的血清中S100B蛋白和NSE蛋白濃度相較于與GM1組或NGF組均有下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，相較于模型A（輕度損傷）和模型C（重度損傷），模型B（中度損傷）GM1+NGF治療組大鼠的血清中S100B蛋白和NSE蛋白濃度下降幅度更大，且具有顯著差異性。這表明，聯(lián)合使用GM1和NGF治療，兩者間產(chǎn)生了協(xié)同保護(hù)作用，能夠更大幅度地降低受損神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞S100B蛋白和受損神經(jīng)元細(xì)胞NSE蛋白的表達(dá)，促進(jìn)受損腦組織的功能恢復(fù)，進(jìn)而更好地對(duì)顱腦起到保護(hù)作用。

綜上所述，本研究表明GM1和NGF均可有效降低急性顱腦損傷SD大鼠血清中的S100B蛋白和NSE蛋白含量，且GM1和NGF聯(lián)合使用治療具有協(xié)同增強(qiáng)的作用，這種增強(qiáng)作用對(duì)于中度顱腦損傷SD大鼠的治療最為明顯，這為今后GM1和NGF的研究以及臨床應(yīng)用提供了一定的參考和借鑒意義。

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Syneegy vetween GM 1 and NGF on the seveeity of veain injuey in eats

LIU Xiaobin LIMin HOU Mingshan LIN Pengzhen MIAO Xingyu YANG Jun

Department of Neurosurgery，Shaanxi Provincial People＇s Hospital，Shaanxi Province，Xi＇an 710061，China

R651.1

A

1674-4721（2016）08（c）-0045-06

2016-04-20本文編輯：趙魯楓）

劉曉斌（1977.7-），男，碩士；研究方向：顱腦損傷。