尚　丹　李美紅　許　馨　曹山虎　孫紹光1.北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站，河北石家莊050000；2.山東省招遠市人民醫(yī)：藥劑科，山東招遠265400；.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學：生物化學與分子生物學教研室，河北石家莊050017

m iR-342-3p抑制SM 22α啟動子的轉錄活性

尚丹1*李美紅2*許馨3曹山虎3孫紹光3
1.北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站，河北石家莊050000；2.山東省招遠市人民醫(yī)：藥劑科，山東招遠265400；3.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學：生物化學與分子生物學教研室，河北石家莊050017

目的探究miR-342-3p是否通過作用于SM22α啟動子，從轉錄水平調控SM22α的表達。方法通過軟件RNAhybrid分析發(fā)現，大鼠SM22α啟動子中存在一個miR-342-3p的識別位點。將miR-342-3pmimics與報告基因載體pGL3-SM22α-Promoter共轉染293A細胞，通過檢測熒光素酶活性來分析miR-342-3p對SM22α啟動子轉錄活性的影響。將miR-342-3p mimics轉染血管平滑肌細胞，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測SM22α mRNA和蛋白質水平，分析miR-342-3p對血管平滑肌細胞中SM22α表達的影響。結果與miR-control相比，miR-342-3p能夠使SM22α啟動子轉錄活性降低（0.54±0.03）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與miR-control相比，miR-342-3p能夠使血管平滑肌細胞中SM22αmRNA水平降低（0.45±0.04）倍，SM22α蛋白質水平下降（0.41± 0.05）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論miR-342-3p通過抑制SM22α啟動子活性，從轉錄水平降低SM22α的表達，為miRNA調控血管平滑肌細胞表型轉化研究提供了新角度。

microRNA；miR-342-3p；SM 22α；啟動子

［Avsteact］Ov jective To explore whethermiR-342-3p could repress the expression of SM22αat the transcriptional level by targeting its promoter.M ethods Therewas a potential binding site ofmiR-342-3p in the SM22αpromoter analyzed by using RNAhybrid software.293A cells were co-transfected with miR-342-3p mimics and pGL3-SM22α-Promoter reporter gene vectors，luciferase activity was detected to analyze whether the SM22αpromoter activity is repressed bymiR-342-3p.Vascular smoothmuscle cellswere transfected withmiR-342-3p mimics，SM22αmRNA and protein levelswere detected by using qRT-PCR and Western blot，to explore the influence ofmiR-342-3p on the expression of SM22αin vascular smooth muscle cells.Results Compared with miR-control，SM22αpromoter transcriptional activity was reduced（0.54±0.03）folds bymiR-342-3p，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The SM22αmRNA in vascular smooth muscle cellswas decreased（0.45±0.04）folds，and the SM22αprotein levelwas decreased（0.41±0.05）folds bymiR-342-3p，compared withmiR-control，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.Conclusion miR-342-3p represses the expression of SM22αat the transcriptional level by targeting its promoter，which provides a novel perspective for the study ofmiRNA in vascular smooth muscle cell phenotypic switch regulation.

［Key woeds］microRNA；miR-342-3p；SM22α；Promoter

microRNA（miRNA）是一類內源性的、長約22個核苷酸的調控性非編碼RNA。miRNA的主要作用模式是通過堿基不完全互補配對的方式介導RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）與胞質中靶mRNA的3'UTR結合，從轉錄后水平抑制靶基因的翻譯［1］。值得關注的是，成熟miRNA不但分布在細胞質中，還廣泛分布在細胞核內，并且很多miRNA在核內的濃度遠高于在胞質中的濃度［2-3］。研究證實，胞核中的miRNA通過與基因啟動子結合，從轉錄水平調控靶基因的表達。例如，miR-320通過與POLR3D基因啟動子結合，抑制其轉錄［4］；miR-373與E-cadherin啟動子結合在轉錄水平誘導基因的表達［5］；miR-744和miR-1184均可與cyclin B1啟動子結合并誘導其轉錄上調，參與腫瘤的發(fā)生［6］；miR-130a與水通道蛋白AQS4 M1基因啟動子結合抑制其轉錄水平，參與調控細胞液體平衡［7］。

目前，關于miRNA能否從轉水水平參與調控血管平滑肌細胞表型轉化完全未知。SM22α（smooth muscle 22）是一種重要的分化型血管平滑肌細胞的表型標志物，參與調控血管平滑肌細胞的增殖和表型轉化，在動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管重塑性疾病中發(fā)揮重要作用［8-9］。本研究發(fā)現，大鼠SM22α啟動子中存在一個miR-342-3p識別位點，經報告基因分析等實驗證明，miR-342-3p能夠抑制SM22α啟動子轉錄活性，從轉錄水平下調SM22α的表達，進而可能參與調控血管平滑肌細胞表型轉化。本研究為miRNA調控血管平滑肌細胞表型轉化的機制研究提供了新角度。

員資料與方法

1.1主要儀器與試劑

實時定量PCR儀型號為ABI7300，凝膠成像儀為Li-COR公司Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，管式冷光儀為Berthold Technologies公司Flash&Glow LB955。質粒提取純化試劑盒、質粒pGL3和pRL-TK、雙熒光素酶報告基因測試試劑盒購自Promega公司；脂質體Lipofectamine 3000、Trizol、逆轉錄和實時定量PCR檢測試劑盒等購自Life Science公司；miRNA mimics購自上海吉瑪制藥技術有限公司；抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；大鼠血管平滑肌細胞株（A7R5）和293A細胞購自美國ATCC公司；胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；重組質粒pGL3-SM22α-Promoter［10］為河北醫(yī)科大學：生物化學與分子生物學教研室構建保存。

1.2細胞培養(yǎng)

大鼠血管平滑肌細胞株（A7R5）和293A均使用含有10%胎牛血清和雙抗的高糖DMEM，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3miRNA的轉染

將A7R5細胞接種到T25細胞培養(yǎng)瓶，細胞密度達到80%時進行轉染。用脂質體Lipofectamine 3000轉染試劑，每瓶加入15μL脂質體溶于100μL無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液中，混勻，室溫靜置5min。每瓶加入40 nmol/LmiRNA溶于100μL無血清無抗生素高糖DMEM培養(yǎng)液中，混勻，室溫靜置5 min。將上述脂質體和核酸輕輕混勻，室溫靜置20min。每瓶換新鮮的無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液1.8 mL，將混合液加入，混勻后置培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。轉染后6 h，更換為常規(guī)高糖DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后收細胞，進行RNA或蛋白質提取。

1.4293A細胞轉染與報告基因分析

將293A細胞接種到24孔板，細胞密度達到80%時進行轉染。每孔加入5μL脂質體Lipofectamine 3000、400 ng質粒pGL3-SM22α-Promter、50 ng內參質粒pRL-TK和20 nmol/LmiRNA，其他操作與上述A7R5細胞的轉染相同。培養(yǎng)24 h后，按Dual-Luciferase報告基因檢測試劑盒進行熒光素酶活性測定。

1.5RNA提取、逆轉錄與實時定量PCR

采用Trizol一步法提取RNA。逆轉錄和實時定量PCR操作均按照試劑盒說明進行。使用的PCR引物序列為SM22α上游引物：5＇-CGAGGAAGGAGCACGAAG-3＇，SM22α下游引物：5＇-TCCTGCGTTGCTGTCTGT-3＇，β-actin上游引物：5＇-TGTGCCCATCTATGAGGGTTACG-3＇，β-actin下游引物：5＇-AAGAGGATGCGGCAGTGGC-3＇。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸15 s，重復40個循環(huán)；然后進行溶解曲線分析。采用相對定量方法（2-△△Ct）對實時定量PCR的結果進行分析。

1.6W estern blot檢測蛋白表達

采用RIPA細胞裂解液提取細胞蛋白，用改良的Lowry法進行蛋白定量。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，每個泳道加入30μg蛋白樣本。采用半干轉膜法。使用含5%脫脂奶粉的TTBS于37℃封閉PVDF膜2 h。將膜置入TTBS適當稀釋的一抗溶液中，4℃孵育過夜。TTBS室溫洗膜3次，每次10min。將膜置入1∶2000稀釋的熒光標記二抗溶液中，于室溫避光孵育1 h。避光洗膜后，使用Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.7統(tǒng)計學方法

上述實驗均重復3次，取其均值。采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1大鼠SM 22α啟動子與m iR-342-3p的結合位點

采用RNAhybrid［11］軟件分析發(fā)現，大鼠SM22α啟動子（-103～-122）含有一個miR-342-3p識別位點；通過Targetscan［12］軟件分析大鼠SM22α3'UTR上未發(fā)現miR-342-3p的識別位點。見圖1。

2.2m iR-342-3p對大鼠SM 22α啟動子轉錄活性的影響

為了論證miR-342-3p與大鼠SM22α啟動子是否存在直接相互作用，本研究將miR-342-3p mimics、miR-control分別與pGL3-SM22α-Promoter和pRLTK質粒共轉染293A細胞，通過熒光素酶活性分析顯示，與miR-control相比，miR-342-3p能夠使SM22α啟動子轉錄活性降低（0.54±0.03）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。細胞表型標志基因α-SMA蛋白質水平下降了（0.28± 0.04）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3B。

圖1　大鼠SM 22琢啟動子與m iR-342-3p的結合位點

圖2　m iR-342-3p對大鼠SM 22琢啟動子轉錄活性的影響（n=3）

2.3m iR-342-3p對血管平滑肌細胞中SM 22α mRNA和蛋白質水平的影響

為了論證miR-342-3p是否在血管平滑肌細胞中調控通過與啟動子互作從轉錄水平調控SM22α的表達，本研究向A7R5細胞中分別轉染miR-342-3p mimics、miR-control。qRT-PCR檢測顯示，與miR-control相比，miR-342-3p使SM22αmRNA水平降低了（0.45±0.04）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3A。另外，Western blot檢測顯示，轉染miR-342-3p血管平滑肌細胞中SM22α蛋白質水平下降了（0.41± 0.05）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；血管平滑肌

圖3　m iR-342-3p對血管平滑肌細胞中SM 22琢m RNA和蛋白質水平的影響（n=3）

3　討論

miRNA除了通過與啟動子結合，從轉錄水平調控靶基因的表達外［4-7］，還能夠通過以下調控模式參與眾多生物學過程：①miRNA能夠進入線粒體，與靶mRNA 5'UTR結合，激活靶基因的翻譯。例如，miR-1與Ago2協(xié)同結合于線粒體中ND1和COX1 mRNA的5'UTR，增強它們的翻譯效率，調控骨骼肌、心肌細胞的分化過程［13］。②miRNA能夠與胞核中靶primiRNA結合，參與miRNA的加工調控。例如，miR-709可以與核內pri-miR-15a/16-1結合，抑制miR-15a/16-1的成熟，參與調控細胞凋亡［14］。③miRNA通過與靶mRNA的開放閱讀框結合，從轉錄后水平抑制其翻譯。例如，miR-134、miR-296和miR-470能夠結合于Nanog、Oct4和Sox2等基因mRNA的開放閱讀框，抑制蛋白表達水平，參與調控胚胎干細胞的分化［15］。④miRNA除了識別靶mRNA的3'UTR外，還能與靶mRNA的5'UTR結合，從轉錄后水平調控靶基因的翻譯。例如，miR-10a能夠結合于多種核糖體蛋白mRNA的5'UTR，增強它們的翻譯效率［16］。⑤miRNA與lncRNA發(fā)生互作。例如，miR-133和miR-135可通過與linc-MD1的結合，在轉錄后水平調節(jié)轉錄因子MAML1和MEF2C的表達，參與肌肉分化調控過程［17］。⑥miRNA與假基因發(fā)生互作。例如，miR-19b和miR-20a可與PTENP1假基因3'UTR結合降低其豐度，進而調控抑癌基因PTEN活性［18］。⑦miRNA通過與蛋白因子結合在轉錄后水平調節(jié)基因的表達。例如，miR-328可以與蛋白質HnRNPE2結合，使其與CEBPA mRNA解離，促進細胞分化［19］。

miRNA廣泛參與了VSMC表型轉化、增殖、分化等生物學過程［20-25］，在動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，但這些成果主要關注miRNA對胞質中mRNA 3'UTR的轉錄后調控模式，而未對上述其他調控模式進行探討。本研究發(fā)現，miR-342-3p能夠降低血管平滑肌細胞中SM22αmRNA和蛋白質水平。通過分析在SM22αmRNA 3'UTR中未發(fā)現miR-342-3p的識別位點，而在大鼠SM22α啟動子中存在1個miR-342-3的識別位點。由此推測miR-342-3可能通過與SM22α啟動子相互作用，從轉錄水平，而不是轉錄后水平，調控SM22α的表達。為了論證上述推測，本研究通過報告基因分析，證明miR-342-3能夠抑制SM22α啟動子轉錄活性。提示miR-342-3p通過作用于SM22α啟動子，從轉錄水平下調SM22α的表達。

總之，本研究證明miR-342-3p不通過作用于大鼠SM22αmRNA 3'UTR，而是通過作用于大鼠SM22α啟動子，從轉錄水平下調SM22α的表達，進而可能參與血管平滑肌細胞表型轉化調控，為miRNA調控血管平滑肌細胞表型轉化的機制研究提供了新角度。

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m iR-342-3p eepeesses teansceiptional activity of SM 22αpeomotee

SHANG Dan LIMeihong XU Xin CAO Shanhu SUN Shaoguang

1.Shijiazhuang Health and Epidemic Prevention Station，Beijing Railway Bureau，Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；2.Department of Pharmacy，Zhaoyuan People's Hospital，Shandong Province，Zhaoyuan 265400，China；3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Basic Medical College，Hebei Medical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050017，China

R34

A

1674-4721（2016）08（c）-0012-051*2*333

2016-05-23本文編輯：程銘）

國家自然科學基金項目（81200215）；河北省自然科學基金資助項目（H2013206151）；河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃（1120140198）。

*共同第一作者

孫紹光（1978.4-），男，博士，副教授；研究方向：調控性非編碼RNA。