羅純猛 金日龍 杜 健 李 力 馬 健 佟智慧.遼寧省撫順市中心醫(yī):骨科外二科,遼寧撫順3006;.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī):骨科,遼寧沈陽000
m iR-140-5p調(diào)控FGF9在拇外翻中的作用
羅純猛1金日龍1杜健2李力1馬健1佟智慧1
1.遼寧省撫順市中心醫(yī):骨科外二科,遼寧撫順113006;2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī):骨科,遼寧沈陽110001
目的探討miR-140-5p調(diào)控FGF9在拇外翻中的作用,從基因?qū)用骊U明拇外翻的發(fā)病機制,為臨床預防和治療拇外翻提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法收集2013~2015年于撫順市中心醫(yī):就診的拇外翻患者(10例)和非拇外翻患者(5例)的第一跖骨內(nèi)側(cè)骨組織及表面軟組織樣本,運用Western blot以及real-time PCR檢測各組織中miR-140-5p和FGF9的表達,并對其表達差異進行分析。利用人成骨細胞系hFOB1.19對骨保護素(OPG)和骨鈣素(OCN)進行Western blot分析,驗證miR-140-5p和FGF9的調(diào)控關(guān)系和對成骨細胞成骨能力的影響。結(jié)果拇外翻患者第一跖趾關(guān)節(jié)與非拇外翻患者比較,miR-140-5p表達顯著下降(P=0.0065),F(xiàn)GF9表達明顯增高(P= 0.0055)。上調(diào)miR-140-5p后FGF9mRNA表達顯著下降(P=0.0050),而下調(diào)miR-140-5p后FGF9mRNA表達顯著增加(P=0.0035)。與未轉(zhuǎn)染組比較上調(diào)miR-140-5p后OPG(P=0.0045)和OCN蛋白(P=0.0037)表達明顯增強,而下調(diào)miR-140-5p后OPG(P=0.0047)和OCN蛋白(P=0.0049)表達減弱。結(jié)論本研究初步證明了miR-140-5p與FGF9在拇外翻的病理過程中具有重要作用,這為拇外翻的病因以及診治研究提供了新的方向。[關(guān)鍵詞]拇外翻;m iR-140-5p;FGF9;成骨細胞
[Avsteact]Ovjective To discuss effects ofmiR-140-5p on FGF9 in hallux valgus,illuminate the pathogenesis of hallux valgus from the point of gene,which provides basic theoretical foundation for the treatment and prevention of hallux valgus.M ethods Samples of patientswith hallux valgus(10 cases)and without hallux valgus(5 cases)in the Fushun Central Hospital from 2013 to 2015 were collected,thus the expression of miR-140-5p and FGF9 in the first metatarsalmedial bone tissues and the surface of the soft tissueswere analyzed with Western blot and real-time PCR. Besides,Western blot analysis on OPG and OCN with osteoblast cell line hFOB1.19 were conducted;the effects and regulation relationship betweenmiR-140-5p and FGF9 on the osteogenic capacity of osteoblast cell line were verified. Results Compared with the first plantar toe joint of the patients without hallux valgus,themiR-140-5p of hallux valgus patients reduced remarkably(P=0.0065),F(xiàn)GF9mRNA increased obviously(P=0.0055).After the increasing of miR-140-5p,F(xiàn)GF9mRNA was reduced remarkably(P=0.0050),and after the reducing ofmiR-140-5p,F(xiàn)GF9mRNA was increased remarkably(P=0.0035).Compared with the untransfected group,OPG(P=0.0045)and OCN(P= 0.0037)protein increased aftermiR-140-5p was increased.While the decrease ofmiR-140-5p caused the weaken of OPG(P=0.0047)and OCN protein(P=0.0049).Conclusion This experiment primarily proves the important functions thatmiR-140-5p and FGF9 having in the pathological process of hallux valgus,which provides new direction for the pathogenesis and diagnosis of hallux valgus.
[Key woeds]Hallux valgus;miR-140-5p;FGF9;Osteoblast
拇外翻是指拇趾偏離中線,向外傾斜大于正常生理性拇外翻角度,同時拇趾在縱軸上向外略有旋轉(zhuǎn)畸形。由于其復雜的解剖畸形給拇外翻的治療帶來很大的困難,而且拇外翻畸形嚴重影響患者的生活質(zhì)量,還可能會進一步導致踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)以及髖關(guān)節(jié)的畸形[1]。拇外翻最為主要的病理改變?yōu)榈谝货殴莾?nèi)翻合并跖骨頭內(nèi)側(cè)骨贅增生和拇囊炎[2-7]。但是該病理改變發(fā)病機制一直未被研究清楚,有研究表明,成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factors,F(xiàn)GF)可以刺激的第一跖趾關(guān)節(jié)的軟組織增生,這為拇外翻的病理學研究提供了一個新的方向[8]。對FGFs的研究可能會闡明拇外翻骨贅形成的原因。
現(xiàn)有報道指出遺傳因素是拇外翻的最主要的內(nèi)部因素,研究發(fā)現(xiàn)拇外翻的患者很多都有家族史,遺傳獲得的體型及體質(zhì)可構(gòu)成特定的生物力學結(jié)構(gòu)及功能,在一定誘因的影響下可導致拇外翻的形成[9-10],但是其具體機制并不明確,而且目前關(guān)于拇外翻的基因研究并不多見。已有學者在肝細胞中證實miR-140-5p對于FGF9 mRNA的調(diào)控作用[11],因此推測在人成骨細胞中也存在此調(diào)控機制。本研究將從首次以拇外翻患者多余骨贅中miR-140-5p以及FGF9的差異表達入手,并應用人體成骨細胞驗證miR-140-5p對FGF9的調(diào)控作用和對成骨細胞成骨功能的影響,目的是明確拇外翻和miR-140-5p、FGF9之間的關(guān)系,進一步探索拇外翻發(fā)病機制。
1.1對象
選擇2013~2015年于撫順市中心醫(yī):(以下簡稱“我:”)就診的10例拇外翻患者,其中女9例,男1例,年齡20~75歲。選擇同期我:收治的因車禍至下肢血運嚴重受損并導致截肢的5例非拇外翻患者,其中女3例,男2例,年齡20~60歲。術(shù)前獲得患者的同意并簽署知情同意書,拇外翻患者矯形手術(shù)中切除第一跖骨頭內(nèi)側(cè)骨贅帶表面軟組織,非拇外翻患者取第一跖骨頭內(nèi)側(cè)骨組織及表面軟組織。本研究經(jīng)遼寧省醫(yī)學倫理委員會批準。
1.2細胞培養(yǎng)
人成骨細胞株(hFOB1.19)購自中國科學:上海細胞所細胞庫,培養(yǎng)基為DMEM∶F12=1∶1(Gibco),胎牛血清(上海洛神生物技術(shù)有限公司)。hFOB1.19需在34℃,5%CO2的條件下培養(yǎng),培養(yǎng)基為DMEM∶F12=1∶1,添加終濃度為10%的胎牛血清及終濃度為0.3‰的G418(Amersco)。隔1 d換液1次。
1.3采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法上下調(diào)控m iR-140-5p的表達
由綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)標記,編碼has-miR-140-5p反義寡核苷酸鏈的慢病毒(lentivirus,LV)由上海吉凱基因化學技術(shù)公司包裝,分別用于體外培養(yǎng)hFOB 1.19細胞表達miR-140-5p的上調(diào)(LV-pre-miR-140-5p)或下調(diào)(anti-LV-miR-140-5p)。GFP標記的空白慢病毒載體(LV-null)用作空白對照。以感染復數(shù)(MOI)=10進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)不同轉(zhuǎn)染情況分為:未進行慢病毒轉(zhuǎn)染的正常hFOB 1.19細胞作為未轉(zhuǎn)染組;轉(zhuǎn)染了LV-premiR-140-5p的hFOB 1.19細胞作為上調(diào)組;轉(zhuǎn)染了anti-LV-miR-140-5p的hFOB 1.19細胞作為下調(diào)組;轉(zhuǎn)染了LV-null的hFOB 1.19細胞作為上調(diào)對照組;轉(zhuǎn)染了anti-LV-null的hFOB 1.19細胞作為下調(diào)對照組。
1.4采用免疫組化檢測FGF9的表達
切片:經(jīng)取材后取得的組織置于多聚甲醛內(nèi)固定4 h后,后置于30%蔗糖溶液浸泡1周左右,使組織沉至溶液底部。制作蠟塊:應用蠟塊切片機做正中矢狀面切片,厚度為10μm。切片后室溫放置1 h。應用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法對組織進行形態(tài)學分析。FGF9抗體購于Abcam公司(貨號:ab71395),采用微波法修復抗原,并且應用DAB法進行顯色,最終通過激光共聚焦顯微鏡觀察拍照,并且應用Qwin(v2.3,Leica Inc.,德國)軟件對拍攝結(jié)果進行定量分析用以判斷整體組織中FGF9的表達情況。
1.5采用real-time PCR檢測m iR-140-5p和FGF9 mRNA的表達
real-time PCR所用引物序列見表1。首先應用Trizol法提取樣本中的總RNA并且測定OD260/OD280值以及RNA濃度,應用Invitrogen(貨號:C28025-032)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄cDNA,下一步使用TAKARA的SYBR Premis Ex TaqⅡ(Perfect Real Time)試劑盒進行real time PCR反應,樣本通過94℃預變性2 min、94℃變性20 s、58℃退火20 s、72℃延伸30 s、74℃讀板、共40個循環(huán)后得到一個平均Ct值,通過該數(shù)值來計算mRNA的相對含量。最終結(jié)果運用Comparative Delta-delta Ct法即ΔΔCt法進行相對定量分析,用來判斷miR-140-5p和FGF9mRNA的相對表達量。
表1 Rea l tim e-PCR引物序列
1.6采用Western blot檢測骨保護素(OPG)和骨鈣素(OCN)的表達
從組織中提取總蛋白,并且應用BCA法進行蛋白定量,之后通過制膠,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫雜交反應,ECL發(fā)光,拍照等步驟取得圖像,并通過bio-rad的Quantity One軟件對結(jié)果進行分析,用以判斷細胞中OPG和OCN蛋白的表達情況。OPG、OCN抗體購于Abcam公司(貨號:ab183910、ab93876)。
1.7統(tǒng)計學方法
采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1拇外翻中FGF9與m iR-140-5p的關(guān)系
免疫組化實驗結(jié)果顯示,非拇外翻患者及拇外翻患者骨組織中均有FGF9表達,拇外翻患者骨組織中FGF9的表達量明顯高于非拇外翻患者(P=0.0055)(圖1A)。拇外翻患者組織中miR-140-5p的表達量明顯低于非拇外翻患者(P=0.0065)(圖1B)。
圖1 拇外翻及非拇外翻患者骨組織中FGF9與m iR-140-5p的表達情況(SP染色,400×)
2.2成骨細胞中m iR-140-5p對FGF9的調(diào)控作用
在上調(diào)了miR-140-5p的表達之后,采用real time-PCR觀察miR-140-5p和FGF9mRNA的表達,發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組比較上調(diào)組中miR-140-5p mRNA的表達顯著升高(P=0.0052)(圖2A),而FGF9 mRNA的表達明顯下降(P=0.0050)(見圖2B)。在下調(diào)了miR-140-5p mRNA的表達之后,發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組比較下調(diào)組中miR-140-5p的表達顯著降低(P= 0.0056)(見圖2A),而FGF9 mRNA的表達明顯增強(P=0.0045)(圖2B)。
圖2 成骨細胞中m iR-140-5p和FGF9 m RNA的表達情況
2.3m iR-140-5p和FGF9對成骨細胞成骨功能的影響
Western blot結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染組比較,下調(diào)miR-140-5p的表達之后,OCN(P=0.0049)和OPG(P=0.0047)蛋白表達水平均明顯降低,而上調(diào)miR-140-5p的表達之后,OCN(P=0.0037)和OPG(P= 0.0045)蛋白表達水平均顯著提高。見圖3。
圖3 成骨細胞中OPG和OCN的表達情況
miR-140-5p已經(jīng)被證實在多種疾病中均具有重要作用,對于其功能研究主要集中在腫瘤方面,其作為下游靶蛋白抑制因素,在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中具有重要作用[12-13]。不僅如此,miR-140-5p在免疫系統(tǒng)中的作用也已得到驗證[14]。在骨科的相關(guān)疾病中miR-140-5p也發(fā)揮著重要作用,在骨折愈合方面,通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn),在骨折的大鼠體內(nèi)miR-140-5p的表達顯著增高[15]。有報道指出miR-140-5p在骨關(guān)節(jié)炎大鼠的病理發(fā)展過程中具有重要作用[16]。但是目前miR-140-5p與拇外翻之間相關(guān)性并沒有被明確。本研究發(fā)現(xiàn)miR-140-5p在非拇外翻患者與拇外翻患者之間的差異表達。雖然之前已有學者在肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)miR-140-5p可以調(diào)控FGF9mRNA的表達[11],但是在成骨細胞中驗證他們兩者之間的調(diào)控關(guān)系并不多見。本研究初步對拇外翻的發(fā)病機制進行探討,這為拇外翻的治療以及預防提出了新的方向。
多余骨贅形成是拇外翻和拇囊炎的主要病因,但是其具體機制并不明確?,F(xiàn)有報道指出FGFs可以刺激拇外翻患者第一跖趾關(guān)節(jié)軟組織中的間充質(zhì)細胞增殖并且可能與拇外翻的發(fā)病具有密切關(guān)系[8]。到目前為止,F(xiàn)GFs家族中有23個家族成員被發(fā)現(xiàn)。FGFs來源于有脊椎和無脊椎動物。它包含兩個大的內(nèi)含子序列,兩個內(nèi)含子功能區(qū)域可以分為3個外顯子區(qū)域,這是FGF家庭因素的特點之一。然而FGF 11~14的易位區(qū)域包含5個外顯子。FGF基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域為5~100 kb[17]。FGFs在膜內(nèi)成骨以及軟骨內(nèi)成骨的過程中具有重要作用。FGFs可以促進成骨細胞增殖并且抑制破骨細胞分化。FGF9普遍分布在整個脊椎動物身體并具有很多生理功能?,F(xiàn)已證實FGF9在多發(fā)性骨性連接綜合征(SYNS)中具有重要作用[18]并且還可以促進軟骨成骨[19]。FGF9還可以通過與FGFR-3結(jié)合促進膜內(nèi)成骨[20]。因此本研究推測拇外翻骨贅形成可能與FGF9促進骨形成作用有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示,在拇外翻患者的骨贅組織中FGF9的表達高于非拇外翻患者。并且成骨細胞的功能隨著FGF9的表達增高而增強。
成骨細胞是骨形成的主要功能細胞,負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。拇外翻患者第一跖趾關(guān)節(jié)處多余骨贅的形成標志著成骨細胞成骨能力的亢進。所以對于成骨細胞成骨能力的觀察是研究拇外翻病因的關(guān)鍵。OCN是骨礦化過程中必不可少的,其可以促進骨形成,本研究應用OCN檢測hFOB1.19細胞骨形成指標。NF-κB配體的受體(RANKL)是破骨細胞生成、激活及存活必不可少的因素,而OPG是RANKL的可溶性誘餌受體,可以抑制RANKL對破骨細胞的作用[21],因此本研究應用OPG檢測hFOB1.19細胞骨吸收指標。通過上述指標充分反映成骨細胞的成骨能力。本研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞的成骨能力與FGF9和miR-140-5p之間存在相關(guān)性。這也預示著FGF9和miR-140-5p可能是拇外翻畸形過程中的關(guān)鍵因素。
本實驗明確了在拇外翻患者中miR-140-5p表達降低,導致FGF9表達增強并刺激第一跖趾關(guān)節(jié)局部骨組織異常增生,導致多余骨贅形成。目前對于拇外翻發(fā)病機制的研究并不多見,本實驗初步證明了miR-140-5p與FGF9在拇外翻的病理過程中具有重要作用,但是明確拇外翻的具體發(fā)病機制還需要更深入的研究,希望本實驗可以為拇外翻的病因以及診治研究提供一個新的方向。
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Effect of FGF9 eegulated vy m iR-140-5p on hallux valgus
LUO Chunmeng1JIN Rilong1DU Jian2LILi1MA Jian1TONG Zhihui1
1.The Second Surgical Department of Orthopedics,the Fushun Central Hospital,Liaoning Province,F(xiàn)ushun 113006,China;2.Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Liaoning Province,Shenyang 110001,China
R687.3
A
1674-4721(2016)08(c)-0004-05
2016-06-10本文編輯:任念)
國家自然科學基金資助項目(81471094)。
佟智慧(1966.2-),男,碩士,主任醫(yī)師;研究方向:脊柱外科。