郭健敏，陳 雨，周 云，韓 重，楊 威（1.廣東省生物資源應用研究所藥物非臨床評價研究中心，廣東廣州 510990；2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東廣州 510990；3.廣東藥學院藥科學院藥理系，廣東廣州 510006）

呋喃二烯對人胃腺癌MGC-803細胞凋亡的誘導作用

郭健敏1，2，陳 雨2，3，周 云2，3，韓 重1，2，楊 威1，2
（1.廣東省生物資源應用研究所藥物非臨床評價研究中心，廣東廣州 510990；2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東廣州 510990；3.廣東藥學院藥科學院藥理系，廣東廣州 510006）

目的 研究呋喃二烯（FDE）在體外對人胃腺癌MGC-803細胞凋亡的誘導作用。方法 FDE 46.29～740.74 μmol·L-1與MGC-803細胞孵育48 h，MTT法測定FDE對細胞存活的抑制率；FDE 92.58～370.32 μmol·L-1與MGC-803細胞作用24 h，光鏡下及Hoechst 33342熒光染色分別觀察細胞形態(tài)和細胞凋亡，流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期，羅丹明123染色和DCFH-DA熒光探針分別檢測細胞線粒體膜電位的改變和活性氧的產(chǎn)生。結果 MTT結果表明，F(xiàn)DE 46.29～740.74 μmol·L-1對MGC-803存活具有明顯抑制作用，作用24，48和72 h時IC50分別為347.91，257.41和101.01 μmol·L-1。流式細胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結果顯示，F(xiàn)DE在92.58～370.32 μmol·L-1作用24 h，能顯著促進MGC-803細胞凋亡（P＜0.05）。細胞周期檢測結果表明，F(xiàn)DE可使MGC-803細胞周期阻滯于S期。羅丹明123和DCFH-DA染色結果顯示，當藥物濃度為370.37 μmol·L-1時，F(xiàn)DE使細胞內線粒體膜電位降低（P＜0.05），對應熒光強度的細胞比例與對照組的比值為0.85∶1，使細胞內活性氧水平增加，活性氧水平為對照組的1.30倍（P＜0.05）。結論 FDE可抑制人胃腺癌MGC-803細胞存活，并誘導其凋亡，其誘導凋亡的作用機制可能與激活線粒體凋亡通路、影響細胞周期和抑制DNA的生物合成相關。

呋喃二烯；MGC-803細胞；胃癌；細胞凋亡；細胞周期；線粒體膜電位；活性氧

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.006

胃癌是嚴重威脅我國人民生命健康的惡性腫瘤之一，其死亡率在各類腫瘤中仍居前位?；熥鳛橥砥谖赴┲委煹闹饕侄危谝欢ǔ潭壬夏軌蜓娱L患者生存期，提高生存率，改善生存質量，但目前仍未有突破性進展［1］。中醫(yī)學以辨證論治為核心，針對胃癌患者的不同情況辨證用藥，在延長患者生存期，提高生存率，改善生存質量，抗腫瘤生長、復發(fā)和轉移及配合化療增效減毒等方面有一定作用［2］。因此，中藥現(xiàn)代化在治療胃癌和防治術后復發(fā)轉移，或是配合化療增效減毒等均具有重要意義。

呋喃二烯（furanodiene，F(xiàn)DE）又名蓬獲術環(huán)二烯，是從抗腫瘤中藥溫莪術油中分離得到的單體主成分。有研究表明，其對多種人腫瘤細胞具有選擇性增殖抑制作用［3］。本課題組應用多種腫瘤細胞，觀察了FDE體外抑制細胞增殖的活性。結果顯示，F(xiàn)DE對人胃癌MGC-803細胞的生長有明顯抑制作用。關于FDE對胃癌MGC-803細胞抑制作用及作用機制的研究尚未見報道。因此，本研究對FDE抑制人胃癌MGC-803細胞的增殖作用及機制進行了研究。

1　材料與方法

1.1藥物、細胞、主要試劑和儀器

1.2細胞培養(yǎng)

MGC-803細胞用RPMI 1640培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素混合液）于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞長至培養(yǎng)瓶85%時傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3MTT法檢測細胞存活

將處于對數(shù)生長期的MGC-803細胞，調整細胞密度3×107L-1，每孔100 μL，接種于96孔板，24 h后加入100 μL的終濃度分別為46.29，92.59，185.18，370.37和740.74 μmol·L-1的FDE，分別作用24，48 和72 h后，每孔加20 μL MTT（5 g·L-1），繼續(xù)作用4 h后，棄上清液，并加入DMSO 150 μL溶解反應產(chǎn)物，用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度值（absorbance，A490 nm），計算對細胞存活的抑制率。存活抑制率（%）=（A490 nm對照組-A490 nm藥物組）/A490 nm對照組）×100%。根據(jù)所得的FDE 5個濃度梯度的細胞存活抑制率繪制曲線，計算在3個不同作用時間點下FDE誘導細胞凋亡50%時的濃度，即IC50值。

1.4光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)

取1×106對數(shù)生長期MGC-803細胞接種于6孔板，每孔1 mL。24 h后每孔加入FDE 1 mL，終濃度分別為92.59，185.18和370.37 μmol·L-1，作用24 h后吸出培養(yǎng)液，PBS洗細胞2次，光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.5熒光顯微鏡下Hoechst33242染色法檢測細胞凋亡

取1×106個對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，24 h后加入不同濃度的FDE（終濃度92.59，185.18和370.37 μmol·L-1）作用24 h后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗2次。每孔加入500 μL Hoechst33242染色液，避光孵育30 min后用PBS洗1次，4%多聚甲醛固定15 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照。正常的細胞核呈藍色，凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。

1.6AnnexinⅤ-FlTC/Pl雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率

取1×106對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，加入不同濃度的FDE（終濃度92.59，185.18和370.37 μmol·L-1）作用24 h后收集細胞，PBS洗2次，將細胞重懸于200 μL結合緩沖液中，加入10 μL AnnexinⅤ-FITC，室溫避光孵育15 min，加入300 μL結合緩沖液和5 μL PI，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7流式細胞儀檢測細胞周期

取1×106對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，加入終濃度分別為92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集細胞，2000×g離心5 min，PBS洗2次，加入1 mL體積分數(shù)為75%的乙醇（-20℃預冷），混勻，4℃過夜固定。2000×g離心5 min，PBS洗3次，加入500 μL PI（終濃度50 mg·L-1）避光20 min后，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.8流式細胞儀檢測活性氧

取1×106對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，加入終濃度分別為92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集細胞，2000×g離心5 min，PBS洗2次后重懸，加入DCFH-DA熒光探針，室溫下避光染色30 min，離心棄上清，用PBS洗2次，通過流式細胞儀檢測熒光強度測定細胞內活性氧水平的變化。

1.9流式細胞儀檢測線粒體膜電位

取1×106對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，加入終濃度分別為92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集細胞，2000×g離心5 min，用無血清RPMI 1640洗2次，重懸細胞，加入羅丹明123染色液，使其最終濃度為10 mg·L-1，37℃避光孵育30 min后離心，棄去上清液，用PBS洗2次，流式細胞儀檢測細胞內線粒體膜電位的變化。

1.10統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1FDE對MGC-803細胞存活的抑制作用

隨著FDE濃度增加和作用時間的延長，F(xiàn)DE對MGC-803細胞存活的抑制作用增強（表1）。FDE作用24，48和72 h時，IC50分別為347.91，257.41 和101.01 μmol·L-1。

2.2FDE對MGC-803細胞形態(tài)和凋亡形成的影響

普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DE作用24 h，MGC-803細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，細胞碎裂，染色質濃縮，同時細胞數(shù)量較對照組明顯減少（圖1）。Hoechst33242染色結果如圖2顯示，細胞對照組細胞呈淡藍色熒光，可見完整的細胞核。FDE作用24 h后，藍色熒光明顯加深且藍染細胞數(shù)量增多，可見到細胞染色質固縮，細胞核呈致密濃染和碎塊狀，顏色發(fā)白，同時可看到細胞核的邊緣化及凋亡小體。

Tab.1 Effect of furanodiene（FDE）on survival of MGC-803 cells detected with MTT assay

Fig.1 Effect of FDE treatment for 24 h on morphologi?cal changes of MGC-803 cells（×400）.Morphological chang?es were observed under optical microscope.↑：cell debris.

Fig.2 Effect of FDE for 24 h on morphological changes on MGC-803 cells（Hoechst 33242，×400）.Morphological changes　were　observed　underfluorescence　microscope.↑：apoptotic MGC-803 cells.

2.3FDE對MGC-803細胞凋亡的影響

AnnexinⅤ-FITC/PI染色后流式細胞儀檢測結果（圖3）表明，F(xiàn)DE作用24 h誘導細胞凋亡，與細胞對照組細胞凋亡率（6.3±4.4）%比較，F(xiàn)DE 92.59，185.18和370.37 μmol·L-1組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），分別為（14.1±5.4）%，（31.8± 5.7）%和（36.2±4.2）%（n=3），具有濃度效應關系（r= 0.936，P＜0.05），其中FDE為370.37 μmol·L-1時，細胞凋亡率是對照組的5.76倍。

Fig.3 Effect of FDE for 24 h on apoptosis of MGC-803 cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

2.4FDE對MGC-803細胞周期的影響

如圖4和表2所示，F(xiàn)DE作用24 h，MGC-803細胞周期分布發(fā)生了明顯變化（P＜0.05）。當FDE濃度為370.37 μmol·L-1時，S期細胞所占的百分比增至對照組的1.66倍，表明FDE可使MGC-803細胞阻滯于S期。

Fig.4 Effect of FDE treatment for 24 h on cell cycle of MGC-803 distribution detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

Tab.2 Effect of FDE on apoptosis and cell cycle of MGC-803 cells

2.5FDE對MGC-803細胞活性氧水平和線粒體膜電位的影響

表3和圖5結果表明，細胞對照組細胞活性氧水平較低，F(xiàn)DE作用24 h后，隨著藥物濃度增大細胞內活性氧水平升高（r=0.975，P＜0.05），當PDE濃度為370.37 μmol·L-1時，活性氧水平是細胞對照組的1.30倍。表3和圖6結果表明，F(xiàn)DE作用24 h PDE誘導細胞凋亡，隨著濃度的增加，熒光信號的強度逐漸減弱（P＜0.05），表明線粒體膜電位下降（P＜0.05）。流式檢測結果表明，當藥物濃度為370.37 μmol·L-1時，對應熒光強度的細胞比例與對照組之比為0.85∶1。

Tab.3 Effect of FDE treatment for 24 h on reactive oxygenspecies（ROS）and mitochodrial membrane potential（MMP）of MGC-803 cells

Fig.5 Effect of FDE treatment for 24 h on intracellular level of ROS　in　MGC-803cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

Fig.6　Effect of FDE treatment for 24 h on MMP in MGC-803 cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

3　討論

FDE最初是由日本學者Hikino等［4］從莪術中分離鑒定得到，國內外學者又相繼證明FDE還存在于白術［5］、沒藥［6］和珊瑚［7］中。據(jù)報道，F(xiàn)DE具有顯著的抑制腫瘤活性，并表現(xiàn)出很強的選擇性［8-9］。

本研究使用MTT法分別檢測FDE作用24，48 和72 h后對MGC-803細胞存活的影響。結果顯示，F(xiàn)DE隨著濃度的增加和作用時間的延長，對MGC-803細胞存活有明顯的抑制作用。細胞形態(tài)觀察和Hoechst33242熒光染色可見，F(xiàn)DE對MGC-803細胞凋亡具有誘導作用。通過檢測細胞凋亡率、線粒體膜電位、活性氧變化以及細胞周期變化等，進一步研究FDE對MGC-803細胞存活抑制作用的作用機制。結果提示，F(xiàn)DE可以明顯誘導MGC-803細胞凋亡，并呈明顯的濃度效應關系；可降低線粒體膜電位，提高細胞內活性氧水平，阻滯細胞生長于S期，從而促進MGC-803細胞的凋亡［10］。上述結果提示，F(xiàn)DE可以使MGC-803細胞阻滯于S期，阻止其進入G2期和M期，從而抑制MGC-803細胞的增殖并使其凋亡［11-12］。由此可知，F(xiàn)DE抗腫瘤的作用機制可能是通過作用于DNA合成而誘導MGC-803細胞發(fā)生凋亡，使細胞生長停滯于S期，降低腫瘤細胞的增殖活性，推測FDE具有一定的研究開發(fā)前景。

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lnduction of furanodiene on apoptosis of human gastric adenocarcinoma MGC-803 cells

GUO Jian-min1，2，CHEN Yu2，3，ZHOU Yun2，3，HAN Zhong1，2，YANG Wei1，2
（1.Center for Drug Non-clinical Evaluation and Research，Guangdong Institute of Applied Bioresources，Guangzhou 510990，China；2.Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co.，Ltd.，Guangzhou 510990，China；3.Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTlVE To investigate the effect of furanodiene（FDE），a diterpene derived from the medicinal plant Zedoary，on apoptosis of human gastric cancer MGC-803 cells induced in vitro. METHODS MGC-803 cells were treated with FDE 46.29～740.74 μmol·L-1for 24，48 and 72 h，and the cell viability was detected with MTT assay.Cell morphology was observed by light microscopy and Hoechst33342 staining.Flow cytometry was used to detect cell apoptotic rate and cell cycle.Rh123 staining and fluorescence probe DCFH-DA were employed to detect the changes in mitochondrial membrane potential（MMP）and reactive oxygen species（ROS）.RESULTS MTT Results showed that FDE 46.29-740.74 μmol·L-1exhibited significantly higher cytotoxicity to gastric cancer MGC-803 cells. IC50for MGC-803 of 24，48 and 72 h treatment was 347.91，257.41 and 101.01 μmol·L-1，respectively. Treatment with FDE 92.58-370.32 μmol·L-1for 24 h also caused significant morphological changes in MGC-803 cells.AnnexinⅤ-FITC/PI double staining showed that the apoptotic rate increased after FDE 92.58-370.32 μmol·L-1treatment for 24 h（P＜0.05）.FDE enabled MGC-803 cell cycle arrest in S phase.DCFHDA staining showed that FDE resulted in an increase in intracellular ROS levels（P＜0.05）when PDE concentration was 370.37 μmol·L-1（P＜0.05）.MMP decreased after FDE treatment when PDE concen?tration was 370.37 μmol·L-1（P＜0.05）.CONCLUSlON FDE Possesses potent tumor selected toxicity and can induce apoptosis of MGC-803 cells through cell cycle arresting，which is related to inhibition of DNA biosynthesis.

furanodiene；MGC-803 cells；gastric cancer；apoptosis；cell cycle；mitochondrial membrane potential；reactive oxygen species

The project supported by National Science and Technology Major Project（2013ZX09103001012）

YANG Wei，E-mail：yangwei0719@163.com，Tel：（020）22698388

R979.1

A

1000-3002-（2016）03-0215-06

2016-01-12接受日期：2016-02-26）

（本文編輯：齊春會）

國家科技重大專項（2013ZX0910-3001012）

郭健敏（1987-），女，碩士研究生，主要從事新藥藥理與毒理學研究，E-mail：hihiqinqin@qq.com；楊 威（1978-），男，研究員，主要從事新藥藥理毒理研究。

楊 威，E-mail：yangwei0719@163.com，Tel：（020）22698388