洪煒龍，陸 紅，吳存造，夏 鵬，陳必成，白永恒（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院.外科實(shí)驗(yàn)室，.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，.移植科，浙江溫州 5000）

γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號(hào)逆轉(zhuǎn)馬兜鈴酸誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

洪煒龍1，陸 紅2，吳存造3，夏 鵬3，陳必成1，白永恒1
（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.外科實(shí)驗(yàn)室，2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，3.移植科，浙江溫州 325000）

目的 探討γ-分泌酶抑制劑DAPT對(duì)馬兜鈴酸（AA）誘導(dǎo)引起腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與膠原累積的作用及分子機(jī)制。方法 將體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E分為正常細(xì)胞對(duì)照組、AA 10 mg·L-1組、AA 10 mg·L-1+DAPT1和10 μmol·L-1組。24 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Notch信號(hào)關(guān)鍵分子Notch1、Jagged1和Numb、表型轉(zhuǎn)化相關(guān)分子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、E-鈣黏著蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（Bmp7）和基質(zhì)成分Ⅰ型膠原a1（Col1a1）和Ⅲ型膠原a1（Col3a1）mRNA的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)Notch1、Jagged1、α-SMA和Col3a1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與正常細(xì)胞對(duì)照相比，AA處理后，腎小管上皮細(xì)胞基質(zhì)相關(guān)因子TGF-β1，α-SMA和Col3a1 mRNA表達(dá)上調(diào)，上皮標(biāo)志物E-鈣黏著蛋白mRNA的表達(dá)受到抑制，而且導(dǎo)致了Notch1、Jagged1 mRNA表達(dá)的上調(diào)和Numb mRNA表達(dá)的下調(diào)（P＜0.05），提示AA促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與基質(zhì)累積，同時(shí)激活了Notch信號(hào)通路。DAPT干預(yù)AA作用后，Notch1（P＜0.01）和Jagged1（P＜0.05）的mRNA表達(dá)下調(diào)，Numb mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），說(shuō)明DAPT抑制了AA誘導(dǎo)的Notch信號(hào)通路活化。此外，與AA損傷組相比，DAPT也降低了TGF-β1，α-SMA，Col1a1和Col3a1 mRNA表達(dá)（P＜0.05），提高BMP-7和E-鈣黏著蛋白mRNA表達(dá)（P＜0.05），提示DAPT抑制了AA誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化與基質(zhì)累積。結(jié)論 DAPT抑制AA誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化與基質(zhì)累積，其可能機(jī)制是DAPT靶向干預(yù)Notch信號(hào)的活化。

DAPT；馬兜鈴酸；表型轉(zhuǎn)化；基質(zhì)累積；Notch信號(hào)

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.005

Notch信號(hào)通路進(jìn)化中高度保守，其調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的功能幾乎涉及所有組織和器官。正常表達(dá)的Notch信號(hào)在器官發(fā)育和器官修復(fù)再生過(guò)程中起著重要作用［1-2］，但持續(xù)異常激活的Notch信號(hào)可導(dǎo)致肝癌等多種腫瘤的發(fā)生［3］。Notch信號(hào)活化也參與了肝、肺等多種器官組織的纖維化［4-7］，但馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）所致的腎纖維化中的作用及分子機(jī)制尚未明確［1-2，8］。前期研究表明，AA可致腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)并釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），促使上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT），最終導(dǎo)致基質(zhì)成分Ⅰ型膠原蛋白（typeⅠcollagen a1，Col1a1）和Ⅲ型膠原蛋白a1（Col3a1）過(guò)度累積［9-10］。在此過(guò)程中，損傷的上皮細(xì)胞反饋性誘導(dǎo)與增殖相關(guān)信號(hào)的活化，引起細(xì)胞的異常增殖，推動(dòng)EMT和基質(zhì)累積。（2S）-N-［N-（3，5-二氟苯乙?；?L-丙氨酰］-2-苯基甘氨酸叔丁酯｛N-［N-（3，5-difluorophenacetyl）-L-alanyl］-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT｝為一種γ-分泌酶抑制劑，研究表明，DAPT可阻斷由γ-分泌酶介導(dǎo)的Notch信號(hào)受體的酶切過(guò)程，使受體分子無(wú)法轉(zhuǎn)變成有效的活性片段，從而抑制Notch信號(hào)通路的激活。DAPT的特異性強(qiáng)，在有效范圍內(nèi)尚不引起毒副作用，而且也已被證明在抗腫瘤方面具有潛在作用［11］。本研究應(yīng)用DAPT，觀察其對(duì)AA所致的EMT、基質(zhì)累積及Notch信號(hào)活化的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑和主要儀器

大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。AA和DAPT（美國(guó)Sigma公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，胎牛血清，胰蛋白酶和Trizol提取液（美國(guó)Gibco公司）；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；抗Ⅲ型膠原抗體和TRITC（美國(guó) Bioworld公司）；FITC（北京Solarbio公司）；RT-PCR試劑（美國(guó)Promega公司）。MyCycler梯度PCR儀，美國(guó)Bio-Rod公司；7500定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能掃描儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；AMEX-1200倒置相差顯微鏡，美國(guó)Advanced Microscop Group公司；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡，德國(guó)Leica公司。

1.2NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)和分組

用含5%胎牛血清的DMEM，置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。鋪6孔板，待細(xì)胞融合度約為70%時(shí)，開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。分為正常細(xì)胞對(duì)照組；AA 10 mg·L-1組；AA 10 mg·L-1+DAPT 1和10 μmol·L-1組。培養(yǎng)24 h后，采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)改變。

1.3實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)

采用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定260/280 nm吸光度值以確定濃度和純度。根據(jù)RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)將細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用DEPC處理水稀釋10倍。針對(duì)Notch信號(hào)關(guān)鍵分子Notch1、Jagged1和Numb、表型轉(zhuǎn)化相關(guān)分子TGF-β1、E-鈣黏著蛋白、α-SMA、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenic protein 7，Bmp7）Col1a1和Col3a1的mRNA設(shè)計(jì)特異性引物，以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，用實(shí)時(shí)PCR相對(duì)定量法進(jìn)行測(cè)定。引物序列如表1所示，由上海捷瑞公司合成。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，PCR擴(kuò)增體系：5 μL 2×SYBR綠色熒光定量試劑、上下游引物各1 μL，終濃度為200 nmol·L-1，1 μL cDNA，2 μL反應(yīng)緩沖液。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5 min，95℃10 s，60℃35 s，40個(gè)循環(huán)。通過(guò)溶解曲線評(píng)價(jià)PCR結(jié)果可靠性，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NRK-52E細(xì)胞，設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照組，AA 10 mg·L-1損傷組和DAPT干預(yù)組并進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，4%甲醛固定，0.3%Triton-X破膜，0.5%正常山羊血清封閉。各細(xì)胞爬片滴加針對(duì)Notch1、Jagged1、α-SMA、Col3a1、波形蛋白（vimentin）和E-鈣黏著蛋白的一抗工作液，于4℃孵育過(guò)夜。用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）或四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC，紅色）標(biāo)記的二抗工作液，于37℃孵育60 min。滴加DAPI至細(xì)胞爬片上，于室溫染色5 min。胞質(zhì)綠色或紅色與胞核藍(lán)色為陽(yáng)性著色。每組取10張片，每張取10個(gè)高倍視野（400×），用Image Pro Plus 6.0軟件分析熒光積分吸光度值（integrated absorbance，IA）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以表示，兩組樣本間比較采用t檢驗(yàn)與精確概率法，兩組樣本關(guān)聯(lián)性比較采用相關(guān)性分析，多組樣本間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Specific mRNA primers for Notch-，epithelial-to-mesenchymal transition（EMT）-and extra cellular matrixrelated genes

2　結(jié)果

2.1DAPT對(duì)馬兜鈴酸誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖1所示，正常細(xì)胞密度極高，細(xì)胞間接觸緊密，由于接觸抑制，細(xì)胞形態(tài)小，呈鋪路石狀；與正常細(xì)胞對(duì)照相比，AA處理NRK-52E細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量急劇下降，細(xì)胞損傷表現(xiàn)明顯，失去貼壁作用，細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中，并且細(xì)胞形態(tài)大，呈多形性。與AA 10 mg·L-1組相比，DAPT干預(yù)后，懸浮的細(xì)胞明顯減少，貼壁細(xì)胞數(shù)量增加。但同時(shí)，隨著DAPT濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量也隨著下降，推測(cè)可能與其細(xì)胞增殖的抑制作用相關(guān)。

Fig.1 Effect of DAPT on morphology of NRK-52E cells injuried by aristolochic acid（AA）（×200）.The cells were cultured for 24 h.

2.2DAPT對(duì)馬兜鈴酸誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞基質(zhì)累積和TGF-β1表達(dá)的影響

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示（圖2），與正常細(xì)胞對(duì)照相比，AA 10 mg·L-1作用下，Col3a1蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。AA 10 mg·L-1組的Col1a1和Col3a1 mRNA的表達(dá)水平升高（P＜0.05）（表2），提示AA誘導(dǎo)了腎小管上皮細(xì)胞基質(zhì)過(guò)度的累積。DAPT干預(yù)后，Col3a1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05），Col1a1和Col3a1的mRNA水平也顯著下調(diào)（P＜0.05）。因此，DAPT對(duì)AA所致的基質(zhì)累積起到了抑制作用，這種作用可能與下調(diào)的TGF-β1mRNA表達(dá)密切相關(guān)。

2.3DAPT對(duì)馬兜鈴酸誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞中EMT相關(guān)mRNA的影響

實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示（表3），與正常細(xì)胞對(duì)照相比，AA 10 mg·L-1組肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏著蛋白的mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示（圖3），AA 10 mg·L-1作用后，α-SMA的蛋白表達(dá)上調(diào)至正常細(xì)胞對(duì)照的9.705倍（P＜0.05）。DAPT干預(yù)后，E-鈣黏著蛋白mRNA表達(dá)提高（P＜0.05），而α-SMA mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）。EMT抑制因子Bmp7 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。因此，DAPT可拮抗AA所致的表型轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

Fig.2 Effect of DAPT on Col3A1 protein expression in NRK-52E cells injured by AA（×400）.See Fig.1 for the treatment.

Tab.2 Effect of DAPT on mRNA expression of Col1a1，Col3a1 and TGF-β11in NRK-52E cells injured by AA

2.4DAPT對(duì)馬兜鈴酸誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞中Notch信號(hào)的影響

實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示（表4），DAPT作用24 h后，隨著DAPT濃度增加，Numb mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），而Notch1和Jagged1的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，P＜0.05），提示Notch信號(hào)通路被抑制。免疫熒光結(jié)果也顯示（圖4），DAPT可抑制AA 10 mg·L-1所致的Notch1和Jagged1蛋白表達(dá)升高。

Tab.3 Effect of DAPT on mRNA expression of EMT-related molecules in NRK-52E cells injured by AA

Fig.3 Effect of DAPT on protein expression of α -SMA in NRK-52E cells injured by AA（×400）.See Fig.1 for the cell tretament.

Tab.4 mRNA Expression of Notch signaling molecules in NRK-52E cells injured by AA

Fig.4 Effect of DAPT on protin expression of Notch1 and Jagged1 in NRK-52E cells injured by AA（×400）. See Fig.1 for the cell treatment.

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，γ-分泌酶抑制劑DAPT能顯著抑制AA所致腎纖維化過(guò)程中Notch信號(hào)的活化，同時(shí)緩解腎小管細(xì)胞纖維化進(jìn)程，甚至在一定程度上使得纖維化過(guò)程中肌成纖維樣腎小管細(xì)胞重新獲得上皮細(xì)胞表型。

AA損傷后，Col1a1，Col3a1和TGF-β1mRNA表達(dá)上調(diào)，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA mRNA表達(dá)上調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏著蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)EMT抑制因子Bmp7 mRNA表達(dá)下調(diào)，此外，Notch1和Jagged1 mRNA表達(dá)上調(diào)，Numb mRNA表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示，腎小管上皮細(xì)胞在受到AA損傷后，細(xì)胞外基質(zhì)生成能力增強(qiáng)，上皮細(xì)胞表型特征減弱，而肌成纖維細(xì)胞樣表型特征增強(qiáng)，同時(shí)EMT抑制能力下調(diào)。此外，Notch信號(hào)被活化。據(jù)此結(jié)果推測(cè)，在受到AA損傷后，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT和基質(zhì)累積，進(jìn)而導(dǎo)致了纖維化，而且Notch信號(hào)通路的激活可能參與這一過(guò)程。而相比于AA損傷組，DAPT干預(yù)后，Col1a1，Col3a1和TGF-β1mRNA表達(dá)下調(diào)，α-SMA mRNA表達(dá)下調(diào)，E-鈣黏著蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)，同時(shí)Bmp7 mRNA表達(dá)上調(diào)，此外，Notch1和Jagged1 mRNA表達(dá)下調(diào)，Numb mRNA表達(dá)上調(diào)。結(jié)果顯示，AA損傷的腎小管細(xì)胞在受到DAPT干預(yù)后，細(xì)胞外基質(zhì)生成能力下降，上皮細(xì)胞表型特征增強(qiáng)，而肌成纖維細(xì)胞樣表型特征減弱，EMT抑制能力顯著上調(diào)，同時(shí)Notch信號(hào)受到抑制。據(jù)此結(jié)果推測(cè)，在受到DAPT干預(yù)后，AA損傷的腎小管上皮細(xì)胞所發(fā)生的EMT和基質(zhì)累積受到顯著抑制，甚至出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。此外，據(jù)此結(jié)果推斷，Notch信號(hào)通路參與了AA誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

本研究雖然可推斷DAPT抑制Notch信號(hào)逆轉(zhuǎn)AA誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，但要斷定Notch信號(hào)是否直接參與表型轉(zhuǎn)化和纖維化，并且要完整確認(rèn)通過(guò)哪些通路來(lái)影響表型轉(zhuǎn)化和纖維化，需要做進(jìn)一步研究。此外，本研究針對(duì)體外實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞模型的建立和藥物干預(yù)的生化因素較體內(nèi)條件有大幅簡(jiǎn)化，直觀地對(duì)Notch信號(hào)在AA誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過(guò)程的整個(gè)信號(hào)和分子網(wǎng)絡(luò)中的作用進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)評(píng)和定位，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步從體外實(shí)驗(yàn)角度闡釋DAPT可通過(guò)靶向阻斷Notch信號(hào)，下調(diào)了AA誘導(dǎo)的TGF-β1的表達(dá)和釋放，抑制EMT和膠原累積，最終緩解纖維化樣改變。然而，DAPT干預(yù)Notch信號(hào)進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化作用尚需未來(lái)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)予證實(shí)。本研究從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控途徑上查找有效的治療藥物，在一定程度上可為腎間充質(zhì)纖維化的治療提供新的思路。

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γ-Secretase inhibitor DAPT reduces aristolochic acid-induced phenotypic transformation by inhibiting Notch pathway in renal tubular epithelial cells

HONG Wei-long1，LU Hong2，WU Cun-zao3，XIA Peng3，CHEN Bi-cheng1，BAI Yong-heng1
（1.Wenzhou Key Laboratory of Surgery，2.Department of Laboratory Medicine，3.Department of Transplantation，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China）

OBJECTlVE To investigate the effect of γ-secretase inhibitor N-［N-（3，5-difluorophen?acetyl）-L-alanyl］-S-phenylglycine t-butyl ester（DAPT）on phenotypic transformation and matrix accu?mulation induced by aristolochic acid（AA）in renal tubular epithelial cells（NRK-52E）and explore the mechanism.METHODS NRK-52E cells were divided stochastically into normal cell control group，AA 10 mg·L-1group and AA 10 mg·L-1+DAPT 1 and 10 μmol·L-1group.After 24 h，the mRNA expressions of Notch1，Jagged1，Numb，E-cadherin，transforming growth factor-β1（TGF-β1），α-smooth muscle actin（α-SMA），bone morphogenic protein 7（Bmp7），typeⅠ a1（Col1a1）andⅢ collagens a1 （Col3a1）were quantified by quantitative real-time RT-PCR.The protein expressions of Notch1，Jagged1，α-SMA，and Col3a1 in NRK-52E cells were detected by immunofluorescence staining.RESULTS In NRK-52E cells，AA enhanced the expression of TGF-β1，α-SMA and Col3a1 mRNA（P＜0.05），reduced the expression of E-cadherin mRNA（P＜0.05），up-regulated the mRNA expression of Notch1 mRNA（P＜0.01）and Jagged1（P＜0.05），and down-regulated the mRNA expression of Numb mRNA（P＜0.05）compared with normal cell control group，indicating that phenotypic transformation and matrix accumu?lation occurred in AA-treated NRK-52E cells，accompanied by activated Notch signaling.Treatment with DAPT inhibited Notch signaling by decreasing the expression of Notch1 and Jagged1（P＜0.05），and increasing the expression of Numb mRNA（P＜0.05）.Furthermore，DAPT also down-regulated the expression levels of TGF-β1，α-SMA，Col1a1 and Col3a1 mRNA（P＜0.05），and up-regulated the expression level of Bmp7 and E-cadherin mRNA（P＜0.05）compared with AA group，suggesting that DAPT inhibited phenotypic transformation and matrix accumulation in AA-treated NRK-52E cells. CONCLUSlON AA induces phenotypic transformation and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells，which is inhibited by DAPT treatment.The possible mechanism is that DAPT suppresses the activation of Notch signaling，resulting in the reduction of epithelial-to-mesenchymal transition and matrix deposition.

DAPT；aristolochic acid；phenotype transformation；matrix accumulation；Notch signaling

The project supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LQ16H310005）；Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LY16H050007）；and Wenzhou Municipal Science and Technology Plan Project （Y20130149）

BAI Yong-heng，E-mail：greatsailor@163.com，Tel：（0577）88069338

R974，R966

A

1000-3002-（2016）03-0209-06

2015-10-23接受日期：2016-03-10）

（本文編輯：賀云霞）

浙江省自然科學(xué)基金（LQ16H310005）；浙江省自然科學(xué)基金（LY16H050007）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20130149）

洪煒龍，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事?lián)p傷后修復(fù)機(jī)制及干預(yù)研究。

白永恒，E-mail：greatsailor@163.com