楊秀穎，張 莉，楊海光，李 莉，方蓮花，杜冠華（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050）

特異性抗肝癌單味中草藥提取物的高通量篩選

楊秀穎，張 莉，楊海光，李 莉，方蓮花，杜冠華
（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050）

目的利用高通量篩選分析技術評價單味中草藥提取物對肝癌細胞及成纖維細胞的作用，以期獲得具有特異性抗肝癌作用的中草藥提取物。方法將242種常用單味中草藥分別應用石油醚、乙醇或水進行提取，共獲得554個中草藥提取物。采用MTT來評價提取物對人肝癌細胞Bel7402和小鼠成纖維細胞NIH3T3存活的作用。結果提取物對人肝癌細胞Bel7402及成纖維細胞NIH3T3生長抑制作用＞50%的樣品分別占總樣品數(shù)的7.4%和14.8%，對2種細胞抑制率同時＞50%的樣品占總數(shù)的4.4%，對Bel7402抑制率為對NIH3T3抑制率2倍以上且對Bel7402抑制率＞50%的樣品占總樣品數(shù)的1.6%。復篩結果顯示，防己乙醇提取物（DF173）對肝癌細胞的細胞毒作用特異性較好，具有良好的量效關系。DF173對Bel7402細胞毒作用IC50為8.27 mg·L-1，對NIH3T3的細胞毒作用IC50為19.48 mg·L-1。結論腫瘤細胞聯(lián)合正常成纖維細胞篩選評價中草藥提取物特異性抗腫瘤作用，有利于發(fā)現(xiàn)高效、低毒抗腫瘤中草藥提取物。

高通量篩選分析；中草藥提取物；抗肝癌藥（中藥）；Bel7402細胞；NIH3T3細胞；防己

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.010

細胞毒類抗腫瘤藥物是通過影響腫瘤細胞的核酸和蛋白質(zhì)等的結構與功能，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞死亡等作用。通常細胞毒類抗腫瘤藥物對腫瘤細胞和人體正常細胞的選擇性較低，可同時殺滅正常分裂的細胞，所以在臨床應用時易引起多種毒性反應。因此，研發(fā)對腫瘤細胞具有選擇性的細胞毒類抗腫瘤藥物意義重大。

高通量篩選技術使大規(guī)模系統(tǒng)活性研究成為可能，可以達到快速準確了解中草藥活性組分及藥理作用的目的，并為中草藥在腫瘤臨床治療方面提供科學依據(jù)。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種中草藥粗提物及其活性成分具有抑制腫瘤生長作用［1-3］，或?qū)鼓[瘤藥物有增敏作用［4］。目前細胞毒類抗腫瘤藥物的獲得主要是通過觀察候選藥物對腫瘤細胞的生長抑制、殺傷作用等細胞水平篩選方法。通過聯(lián)合對正常細胞的評價，不僅可以獲得對腫瘤細胞更加特異的細胞毒類藥物［5］，還可以幫助預測毒性作用。本研究利用本課題組前期建立的常用單味中草藥提取物樣品庫中的樣品，結合高通量篩選技術評價了不同溶劑中草藥提取物對人肝癌細胞Bel7402及小鼠成纖維細胞NIH3T3的細胞毒作用，獲得對肝癌細胞特異性作用的中草藥提取物，為進一步發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物活性成分提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥品和試劑

242種常用單味中草藥恒溫干燥4 h后，粉碎后過20目篩。各取1 kg分別采用5000 mL石油醚、乙醇或水3種不同溶劑進行提取。藥材分別采用10倍量溶劑回流提取3次，減壓回收溶劑得粗提物，共獲得554種中草藥提取物。各味中草藥提取物用二甲亞砜（DMSO）溶解，然后用生理鹽水稀釋至1 mg·L-1用于篩選，DMSO在篩選體系中含量＜1%。待篩選的中草藥粗提物以10 g·L-1的濃度溶于DMSO中，制成儲存液，用無菌生理鹽水稀釋到相應濃度。

RPMI 1640細胞培養(yǎng)基，美國Gibco公司；標準胎牛血清，美國Hyclone公司；MTT，美國Sigma公司；人肝癌Bel7402細胞和小鼠成纖維細胞NIH3T3購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心。

1.2儀器

細胞培養(yǎng)箱（Sanyo，日本）；顯微鏡IX71（Olympus，日本）；SpectraMaxM5酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；EDR-384S型自動分液系統(tǒng)（日本）；Costar 96孔微板（Corning Incorporated公司，美國）；Hamilton Microlab?STARplus自動工作站（Hamilton公司，瑞士）。

1.3細胞培養(yǎng)條件

人肝癌Bel7402細胞和小鼠成纖維細胞NIH3T3，均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，根據(jù)細胞生長情況每2～3 d傳代1次。

1.4MTT法檢測細胞存活

選用對數(shù)生長期的Bel7402和NIH3T3細胞，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成細胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中。每孔接種細胞180 μL，細胞數(shù)量約為每孔3000個。37℃，5%CO2培養(yǎng)16 h，加入待測樣品。

樣品處理孔加入20 μL相應濃度藥物，細胞對照則加20 μL生理鹽水（含0.1%DMSO），另設含同等體積培養(yǎng)基的空白對照組孔。細胞用樣品處理72 h后，棄去上清液，每孔加入100 μL新鮮配制的MTT（5 g·L-1）無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，充分振蕩。在酶標儀上490 nm波長處測定吸光度值（A）。計算細胞存活抑制率（%）。細胞存活抑制率（%）=（A細胞對照-A藥物）/（A細胞對照-A空白對照）×100%。

1.5統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1中草藥提取物對人肝癌細胞Bel7402存活的影響

中草藥提取物與人肝癌細胞Bel7402共同作用。結果表明，終濃度為0.1 g·L-1時，多種中草藥提取物對人肝癌細胞系Bel7402具有細胞毒作用，其中抑制率＞50%的提取物約占總樣品數(shù)的7.4%，抑制率＞80%的樣品占2.2%（圖1）。

2.2中草藥提取物對小鼠成纖維細胞NlH3T3存活的影響

Fig.1　Effect of 554 traditional Chinese medicine （TCM）extracts on viability of human hepatocellular carcinoma cells（Bel7402）.A：scatter；B：floating column. Lines a and c represent the accumulated inhibitory rate distribution curve of 554 samples；line b represents an approximate normal inhibitory rate distribution curve of 554 samples.

中草藥提取物與小鼠成纖維細胞NIH3T3共同作用。結果表明，在0.1 g·L-1的終濃度下，多種中草藥提取物對小鼠成纖維細胞NIH3T3具有細胞毒作用，其中抑制率＞50%的提取物約占總樣品數(shù)的14.8%，抑制率＞80%的樣品占4.5%（圖2）。

2.3中草藥提取物對細胞Bel7402和NlH3T3存活作用的比較

初篩結果顯示，對NIH3T3表現(xiàn)為高細胞毒作用的樣品較對Bel7402細胞樣品多。大部分對Bel7402細胞具有細胞毒作用的樣品，同時對NIH3T3細胞也有細胞毒作用（圖3A）。對NIH3T3和（或）Bel7402細胞毒作用＞50%的中草藥提取物共99個，占總數(shù)的17.4%。而對Bel7402和NIH3T3細胞同時具有細胞毒作用的樣品占總數(shù)的4.4%。對Bel7402的細胞毒作用＞50%且抑制率為NIH3T3細胞2倍以上樣品占總樣品數(shù)的1.6%（圖3B）。

2.4具有抗癌活性樣品復篩及特異性作用評價

選取對Bel7402細胞毒作用強度與NIH3T3比率＞2的樣品進行復篩，結果顯示，樣品防己乙醇提取DF173具有較好的重復性和良好的量效關系。DF173對肝癌細胞Bel7402和成纖維細胞NIH3T3的細胞毒作用IC50分別為8.27和19.48 mg·L-1。此藥的細胞毒的效力在肝癌細胞中作用明顯強于成纖維細胞株（圖4）。

Fig.2 Effect of 554 TCM extracts on viability of fibro?blast cells（NlH3T3）.A：scatter；B：floating column.Lines a and c represent the accumulated inhibitory rate distribution curves of 554 samples；line b represents an approximate normal inhibitory rate distribution curve of 554 samples.

Fig.3　Comparison of TCM extraction on viability of Bel 7402 and NlH3T3 cells.A：the merged column graph of inhibitory rate of 554 samples in human hepatocellular carcinoma cells Bel 7402 and mouse fibroblast cells NIH3T3.B：the scatter curve of inhibitory rate above 50%of samples in Bel 7402 cells and/or NIH 3T3 cells.

Fig.4 The concentration-response curves of DF173 on inhibitory rate in Bel7402 cells and NlH3T3 cells.，n=3.**P＜0.01，compared with NIH 3T3 control.

3　討論

本研究采用人肝癌細胞Bel 7402，并利用小鼠成纖維細胞NIH3T3作為正常細胞對照，對常用的242種單味中草藥的不同極性溶劑提取物抗肝癌作用進行了高通量篩選。結果顯示，在0.1 g·L-1的濃度下，約14.8%的中草藥提取物樣品對成纖維細胞生長抑制作用達到50%以上，反映了中草藥粗提物的成分比較復雜，雖存在一定細胞毒作用，但特異性相對較差。

以往報道中草藥中具有細胞毒活性的化學成分類型廣泛，包括揮發(fā)油、生物堿、萜類和內(nèi)酯等，其作用機制和途徑也不盡相同［6-7］。目前臨床抗肝癌治療中，應用中草藥及其提取物抗肝癌治療比較廣泛，藥理作用一般為抑制腫瘤細胞生長、逆轉耐藥性及增強機體免疫力等。本研究采用MTT方法簡單、快速，是應用最為廣泛的抗腫瘤作用評價模型之一，但該模型提供的信息有限。同時考察藥物對正常細胞的細胞毒作用及作用強度，可以為發(fā)現(xiàn)作用更加特異、對人體毒性更低的抗肝癌中草藥提取物提供線索。但因現(xiàn)有的成纖維細胞株也具有無限繁殖的特性，因此其作為正常細胞使用仍然具有相對性。對可持續(xù)增殖的正常細胞株界定及開發(fā)，仍需要進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，防己乙醇提取物DF173對肝癌細胞細胞毒作用特異性相對較強。而對成纖維細胞NIH3T3細胞毒作用較低。提示DF173提取物可能在肝癌治療中具有高特異和低毒的特性。防己及其主要成分漢防己甲素（tetrandrine）具有抗腫瘤作用［8-9］，防己的醇溶性提取物中有漢防己甲素。還有研究顯示，漢防己甲素具有促進肝癌細胞Bel7402凋亡的作用［9］。本研究結果與該文獻報道相符。

傳統(tǒng)篩選模式是只針對腫瘤細胞的細胞毒篩選模式，選擇性較低。腫瘤細胞聯(lián)合正常成纖維細胞，篩選評價中草藥提取物特異性抗腫瘤細胞毒作用，將有利于發(fā)現(xiàn)高效、低毒的抗腫瘤藥物。

［1］ Huang Q，Lu G，Shen HM，Chung MC，Ong CN. Anti-cancer properties ofanthraquinonesfrom rhubarb［J］.Med Res Rev，2007，27（5）：609-630.

［2］ Li XJ，Zhang HY.Western-medicine-validated antitumor agents and traditional Chinese medicine ［J］.Trends Mol Med，2008，14（1）：1-2.

［3］ Jiang X，Huang XC，Ao L，Liu WB，Han F，Cao J，et al.Total alkaloids of Tripterygium hypoglaucum （levl.）Hutch inhibits tumor growth both in vitro and in vivo［J］.J Ethnopharmacol，2014，151（1）：292-298.

［4］ Berger A，Quast SA，Pl?tz M，Hein M，Kunz M，Langer P，et al.Sensitization of melanoma cells for death ligand-induced apoptosis by an indirubin derivative-enhancement of both extrinsic and in?trinsic apoptosis pathways［J］.Biochem Pharma?col，2011，81（1）：71-81.

［5］ Ramachandran E，Senthil Raja D，Bhuvanesh NS，Natarajan K.Synthesis，characterization and in vitro pharmacological evaluation of new water soluble Ni（Ⅱ）complexes of 4N-substituted thiosemicar?bazones of 2-oxo-1，2-dihydroquinoline-3-carbal?dehyde［J］.Eur J Med Chem，2013，64：179-189.

［6］ Efferth T，Li PC，Konkimalla VS，Kaina B.From traditional Chinese medicine to rational cancer therapy［J］.Trends Mol Med，2007，13（8）：353-361.

［7］ Wang S，Wu X，Tan M，Gong J，Tan W，Bian B，et al.Fighting fire with fire：poisonous Chinese herbal medicine for cancer therapy［J］.J Ethno?pharmacol，2012，140（1）：33-45.

［8］ Yu VW，Ho WS.Tetrandrine inhibits hepatocellu?lar carcinoma cell growth through the caspase pathway and G2/M phase［J］.Oncol Rep，2013，29（6）：2205-2210.

［9］Deng WY，Sun XC，Li SY.The effect of tetran?drine on proliferation and apoptosis of human liver cancer cell line 7402［J］.J Med Postgrad（醫(yī)學研究生學報），2007，（2）：138-141.

High-throughput screening of single Chinese plant extracts on specific anti-hepatoma drugs

YANG Xiu-ying，ZHANG Li，YANG Hai-guang，LI Li，F(xiàn)ANG Lian-hua，DU Guan-hua
（Beijing Key Laboratory of Drug Target Identification and Drug Screening，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

OBJECTlVE To evaluate the effect of single traditional Chinese medicine（TCM）herb extracts on hepatoma and normal fibroblast cells using high-throughput screening in order to obtain extracts with specific anti-hepatoma effect.METHODS 242 commonly used TCM herbs were extracted by petroleum ether，ethanol and water，respectively.The total number of TCM extracts was 554.The cyto?toxicity of samples was evaluated by MTT in human hepatoma cells Bel7402 and mice normal fibroblasts NIH3T3.RESULTS 7.4%of the total extracts had an inhibitory effect greater than 50%for Bel7402，but 14.8%for fibroblasts NIH3T3 cells.Extracts with an inhibitory effect above 50%on both Bel7402 and NIH3T3 cells accounted for 4.4%of the total extracts.Our results showed that the sample DF173 had preferable cytotoxicity effect on hepatoma carcinoma cells in a good dose-effect relationship.DF173 is an ethanol extract from Stephania tetrandra，which is a commonly used herb in TCM.The cytotoxic IC50of DF173 against Bel7402 was 8.27 mg·L-1，and 19.48 mg·L-1on NIH3T3.CONCLUSlON The componentsof TCM herbs are highly complicated.The combination of tumor cells with normal fibroblast cells to evaluate the cytotoxicity effect during anti-tumor drug screening will contribute much to the discovery of TCM drugs with high anti-tumor efficiency and lower toxicity.

high-throughput screening assays；plant extracts，Chinese；anti-hepatoma drugs （TCM）；Bel7402 cells；NIH3T3 cells；Stephania tetrandra

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81470159）；and National Science and Technology Major Projects for″Major New Drugs Innovation and Development″（2013ZX09508104）

DU Guan-hua，E-mail：dugh@imm.ac.cn，Tel：（010）63165184

R965.1，R285

A

1000-3002-（2016）03-0243-05

2015-11-23接受日期：2016-01-30）

（本文編輯：喬 虹）

國家自然科學基金（81470159）；國家科技重大專項（2013ZX09508104）

楊秀穎，女，博士，副研究員，主要從事藥理學、新藥藥物篩選研究；杜冠華，男，研究員，博士生導師，主要從事藥理學、新藥藥物篩選研究。

杜冠華，E-mail：dugh@imm.ac.cn，Tel：（010）63165184