亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        特異性抗肝癌單味中草藥提取物的高通量篩選

        2016-09-21 06:23:36楊秀穎楊海光方蓮花杜冠華中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室北京100050
        中國藥理學與毒理學雜志 2016年3期
        關鍵詞:細胞毒纖維細胞抑制率

        楊秀穎,張 莉,楊海光,李 莉,方蓮花,杜冠華(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室,北京 100050)

        特異性抗肝癌單味中草藥提取物的高通量篩選

        楊秀穎,張 莉,楊海光,李 莉,方蓮花,杜冠華
        (中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室,北京 100050)

        目的利用高通量篩選分析技術評價單味中草藥提取物對肝癌細胞及成纖維細胞的作用,以期獲得具有特異性抗肝癌作用的中草藥提取物。方法將242種常用單味中草藥分別應用石油醚、乙醇或水進行提取,共獲得554個中草藥提取物。采用MTT來評價提取物對人肝癌細胞Bel7402和小鼠成纖維細胞NIH3T3存活的作用。結果提取物對人肝癌細胞Bel7402及成纖維細胞NIH3T3生長抑制作用>50%的樣品分別占總樣品數(shù)的7.4%和14.8%,對2種細胞抑制率同時>50%的樣品占總數(shù)的4.4%,對Bel7402抑制率為對NIH3T3抑制率2倍以上且對Bel7402抑制率>50%的樣品占總樣品數(shù)的1.6%。復篩結果顯示,防己乙醇提取物(DF173)對肝癌細胞的細胞毒作用特異性較好,具有良好的量效關系。DF173對Bel7402細胞毒作用IC50為8.27 mg·L-1,對NIH3T3的細胞毒作用IC50為19.48 mg·L-1。結論腫瘤細胞聯(lián)合正常成纖維細胞篩選評價中草藥提取物特異性抗腫瘤作用,有利于發(fā)現(xiàn)高效、低毒抗腫瘤中草藥提取物。

        高通量篩選分析;中草藥提取物;抗肝癌藥(中藥);Bel7402細胞;NIH3T3細胞;防己

        DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.010

        細胞毒類抗腫瘤藥物是通過影響腫瘤細胞的核酸和蛋白質(zhì)等的結構與功能,發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞死亡等作用。通常細胞毒類抗腫瘤藥物對腫瘤細胞和人體正常細胞的選擇性較低,可同時殺滅正常分裂的細胞,所以在臨床應用時易引起多種毒性反應。因此,研發(fā)對腫瘤細胞具有選擇性的細胞毒類抗腫瘤藥物意義重大。

        高通量篩選技術使大規(guī)模系統(tǒng)活性研究成為可能,可以達到快速準確了解中草藥活性組分及藥理作用的目的,并為中草藥在腫瘤臨床治療方面提供科學依據(jù)。已有研究發(fā)現(xiàn),多種中草藥粗提物及其活性成分具有抑制腫瘤生長作用[1-3],或?qū)鼓[瘤藥物有增敏作用[4]。目前細胞毒類抗腫瘤藥物的獲得主要是通過觀察候選藥物對腫瘤細胞的生長抑制、殺傷作用等細胞水平篩選方法。通過聯(lián)合對正常細胞的評價,不僅可以獲得對腫瘤細胞更加特異的細胞毒類藥物[5],還可以幫助預測毒性作用。本研究利用本課題組前期建立的常用單味中草藥提取物樣品庫中的樣品,結合高通量篩選技術評價了不同溶劑中草藥提取物對人肝癌細胞Bel7402及小鼠成纖維細胞NIH3T3的細胞毒作用,獲得對肝癌細胞特異性作用的中草藥提取物,為進一步發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物活性成分提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1藥品和試劑

        242種常用單味中草藥恒溫干燥4 h后,粉碎后過20目篩。各取1 kg分別采用5000 mL石油醚、乙醇或水3種不同溶劑進行提取。藥材分別采用10倍量溶劑回流提取3次,減壓回收溶劑得粗提物,共獲得554種中草藥提取物。各味中草藥提取物用二甲亞砜(DMSO)溶解,然后用生理鹽水稀釋至1 mg·L-1用于篩選,DMSO在篩選體系中含量<1%。待篩選的中草藥粗提物以10 g·L-1的濃度溶于DMSO中,制成儲存液,用無菌生理鹽水稀釋到相應濃度。

        RPMI 1640細胞培養(yǎng)基,美國Gibco公司;標準胎牛血清,美國Hyclone公司;MTT,美國Sigma公司;人肝癌Bel7402細胞和小鼠成纖維細胞NIH3T3購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心。

        1.2儀器

        細胞培養(yǎng)箱(Sanyo,日本);顯微鏡IX71(Olympus,日本);SpectraMaxM5酶標儀(Molecular Devices公司,美國);EDR-384S型自動分液系統(tǒng)(日本);Costar 96孔微板(Corning Incorporated公司,美國);Hamilton Microlab?STARplus自動工作站(Hamilton公司,瑞士)。

        1.3細胞培養(yǎng)條件

        人肝癌Bel7402細胞和小鼠成纖維細胞NIH3T3,均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),隔天換液,根據(jù)細胞生長情況每2~3 d傳代1次。

        1.4MTT法檢測細胞存活

        選用對數(shù)生長期的Bel7402和NIH3T3細胞,胰酶消化后,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成細胞懸液,接種在96孔培養(yǎng)板中。每孔接種細胞180 μL,細胞數(shù)量約為每孔3000個。37℃,5%CO2培養(yǎng)16 h,加入待測樣品。

        樣品處理孔加入20 μL相應濃度藥物,細胞對照則加20 μL生理鹽水(含0.1%DMSO),另設含同等體積培養(yǎng)基的空白對照組孔。細胞用樣品處理72 h后,棄去上清液,每孔加入100 μL新鮮配制的MTT(5 g·L-1)無血清培養(yǎng)液,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后,棄上清,每孔加入150 μL DMSO,充分振蕩。在酶標儀上490 nm波長處測定吸光度值(A)。計算細胞存活抑制率(%)。細胞存活抑制率(%)=(A細胞對照-A藥物)/(A細胞對照-A空白對照)×100%。

        1.5統(tǒng)計學分析

        2 結果

        2.1中草藥提取物對人肝癌細胞Bel7402存活的影響

        中草藥提取物與人肝癌細胞Bel7402共同作用。結果表明,終濃度為0.1 g·L-1時,多種中草藥提取物對人肝癌細胞系Bel7402具有細胞毒作用,其中抑制率>50%的提取物約占總樣品數(shù)的7.4%,抑制率>80%的樣品占2.2%(圖1)。

        2.2中草藥提取物對小鼠成纖維細胞NlH3T3存活的影響

        Fig.1 Effect of 554 traditional Chinese medicine (TCM)extracts on viability of human hepatocellular carcinoma cells(Bel7402).A:scatter;B:floating column. Lines a and c represent the accumulated inhibitory rate distribution curve of 554 samples;line b represents an approximate normal inhibitory rate distribution curve of 554 samples.

        中草藥提取物與小鼠成纖維細胞NIH3T3共同作用。結果表明,在0.1 g·L-1的終濃度下,多種中草藥提取物對小鼠成纖維細胞NIH3T3具有細胞毒作用,其中抑制率>50%的提取物約占總樣品數(shù)的14.8%,抑制率>80%的樣品占4.5%(圖2)。

        2.3中草藥提取物對細胞Bel7402和NlH3T3存活作用的比較

        初篩結果顯示,對NIH3T3表現(xiàn)為高細胞毒作用的樣品較對Bel7402細胞樣品多。大部分對Bel7402細胞具有細胞毒作用的樣品,同時對NIH3T3細胞也有細胞毒作用(圖3A)。對NIH3T3和(或)Bel7402細胞毒作用>50%的中草藥提取物共99個,占總數(shù)的17.4%。而對Bel7402和NIH3T3細胞同時具有細胞毒作用的樣品占總數(shù)的4.4%。對Bel7402的細胞毒作用>50%且抑制率為NIH3T3細胞2倍以上樣品占總樣品數(shù)的1.6%(圖3B)。

        2.4具有抗癌活性樣品復篩及特異性作用評價

        選取對Bel7402細胞毒作用強度與NIH3T3比率>2的樣品進行復篩,結果顯示,樣品防己乙醇提取DF173具有較好的重復性和良好的量效關系。DF173對肝癌細胞Bel7402和成纖維細胞NIH3T3的細胞毒作用IC50分別為8.27和19.48 mg·L-1。此藥的細胞毒的效力在肝癌細胞中作用明顯強于成纖維細胞株(圖4)。

        Fig.2 Effect of 554 TCM extracts on viability of fibro?blast cells(NlH3T3).A:scatter;B:floating column.Lines a and c represent the accumulated inhibitory rate distribution curves of 554 samples;line b represents an approximate normal inhibitory rate distribution curve of 554 samples.

        Fig.3 Comparison of TCM extraction on viability of Bel 7402 and NlH3T3 cells.A:the merged column graph of inhibitory rate of 554 samples in human hepatocellular carcinoma cells Bel 7402 and mouse fibroblast cells NIH3T3.B:the scatter curve of inhibitory rate above 50%of samples in Bel 7402 cells and/or NIH 3T3 cells.

        Fig.4 The concentration-response curves of DF173 on inhibitory rate in Bel7402 cells and NlH3T3 cells.,n=3.**P<0.01,compared with NIH 3T3 control.

        3 討論

        本研究采用人肝癌細胞Bel 7402,并利用小鼠成纖維細胞NIH3T3作為正常細胞對照,對常用的242種單味中草藥的不同極性溶劑提取物抗肝癌作用進行了高通量篩選。結果顯示,在0.1 g·L-1的濃度下,約14.8%的中草藥提取物樣品對成纖維細胞生長抑制作用達到50%以上,反映了中草藥粗提物的成分比較復雜,雖存在一定細胞毒作用,但特異性相對較差。

        以往報道中草藥中具有細胞毒活性的化學成分類型廣泛,包括揮發(fā)油、生物堿、萜類和內(nèi)酯等,其作用機制和途徑也不盡相同[6-7]。目前臨床抗肝癌治療中,應用中草藥及其提取物抗肝癌治療比較廣泛,藥理作用一般為抑制腫瘤細胞生長、逆轉耐藥性及增強機體免疫力等。本研究采用MTT方法簡單、快速,是應用最為廣泛的抗腫瘤作用評價模型之一,但該模型提供的信息有限。同時考察藥物對正常細胞的細胞毒作用及作用強度,可以為發(fā)現(xiàn)作用更加特異、對人體毒性更低的抗肝癌中草藥提取物提供線索。但因現(xiàn)有的成纖維細胞株也具有無限繁殖的特性,因此其作為正常細胞使用仍然具有相對性。對可持續(xù)增殖的正常細胞株界定及開發(fā),仍需要進一步研究。

        本研究發(fā)現(xiàn),防己乙醇提取物DF173對肝癌細胞細胞毒作用特異性相對較強。而對成纖維細胞NIH3T3細胞毒作用較低。提示DF173提取物可能在肝癌治療中具有高特異和低毒的特性。防己及其主要成分漢防己甲素(tetrandrine)具有抗腫瘤作用[8-9],防己的醇溶性提取物中有漢防己甲素。還有研究顯示,漢防己甲素具有促進肝癌細胞Bel7402凋亡的作用[9]。本研究結果與該文獻報道相符。

        傳統(tǒng)篩選模式是只針對腫瘤細胞的細胞毒篩選模式,選擇性較低。腫瘤細胞聯(lián)合正常成纖維細胞,篩選評價中草藥提取物特異性抗腫瘤細胞毒作用,將有利于發(fā)現(xiàn)高效、低毒的抗腫瘤藥物。

        [1] Huang Q,Lu G,Shen HM,Chung MC,Ong CN. Anti-cancer properties ofanthraquinonesfrom rhubarb[J].Med Res Rev,2007,27(5):609-630.

        [2] Li XJ,Zhang HY.Western-medicine-validated antitumor agents and traditional Chinese medicine [J].Trends Mol Med,2008,14(1):1-2.

        [3] Jiang X,Huang XC,Ao L,Liu WB,Han F,Cao J,et al.Total alkaloids of Tripterygium hypoglaucum (levl.)Hutch inhibits tumor growth both in vitro and in vivo[J].J Ethnopharmacol,2014,151(1):292-298.

        [4] Berger A,Quast SA,Pl?tz M,Hein M,Kunz M,Langer P,et al.Sensitization of melanoma cells for death ligand-induced apoptosis by an indirubin derivative-enhancement of both extrinsic and in?trinsic apoptosis pathways[J].Biochem Pharma?col,2011,81(1):71-81.

        [5] Ramachandran E,Senthil Raja D,Bhuvanesh NS,Natarajan K.Synthesis,characterization and in vitro pharmacological evaluation of new water soluble Ni(Ⅱ)complexes of 4N-substituted thiosemicar?bazones of 2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-carbal?dehyde[J].Eur J Med Chem,2013,64:179-189.

        [6] Efferth T,Li PC,Konkimalla VS,Kaina B.From traditional Chinese medicine to rational cancer therapy[J].Trends Mol Med,2007,13(8):353-361.

        [7] Wang S,Wu X,Tan M,Gong J,Tan W,Bian B,et al.Fighting fire with fire:poisonous Chinese herbal medicine for cancer therapy[J].J Ethno?pharmacol,2012,140(1):33-45.

        [8] Yu VW,Ho WS.Tetrandrine inhibits hepatocellu?lar carcinoma cell growth through the caspase pathway and G2/M phase[J].Oncol Rep,2013,29(6):2205-2210.

        [9]Deng WY,Sun XC,Li SY.The effect of tetran?drine on proliferation and apoptosis of human liver cancer cell line 7402[J].J Med Postgrad(醫(yī)學研究生學報),2007,(2):138-141.

        High-throughput screening of single Chinese plant extracts on specific anti-hepatoma drugs

        YANG Xiu-ying,ZHANG Li,YANG Hai-guang,LI Li,F(xiàn)ANG Lian-hua,DU Guan-hua
        (Beijing Key Laboratory of Drug Target Identification and Drug Screening,Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

        OBJECTlVE To evaluate the effect of single traditional Chinese medicine(TCM)herb extracts on hepatoma and normal fibroblast cells using high-throughput screening in order to obtain extracts with specific anti-hepatoma effect.METHODS 242 commonly used TCM herbs were extracted by petroleum ether,ethanol and water,respectively.The total number of TCM extracts was 554.The cyto?toxicity of samples was evaluated by MTT in human hepatoma cells Bel7402 and mice normal fibroblasts NIH3T3.RESULTS 7.4%of the total extracts had an inhibitory effect greater than 50%for Bel7402,but 14.8%for fibroblasts NIH3T3 cells.Extracts with an inhibitory effect above 50%on both Bel7402 and NIH3T3 cells accounted for 4.4%of the total extracts.Our results showed that the sample DF173 had preferable cytotoxicity effect on hepatoma carcinoma cells in a good dose-effect relationship.DF173 is an ethanol extract from Stephania tetrandra,which is a commonly used herb in TCM.The cytotoxic IC50of DF173 against Bel7402 was 8.27 mg·L-1,and 19.48 mg·L-1on NIH3T3.CONCLUSlON The componentsof TCM herbs are highly complicated.The combination of tumor cells with normal fibroblast cells to evaluate the cytotoxicity effect during anti-tumor drug screening will contribute much to the discovery of TCM drugs with high anti-tumor efficiency and lower toxicity.

        high-throughput screening assays;plant extracts,Chinese;anti-hepatoma drugs (TCM);Bel7402 cells;NIH3T3 cells;Stephania tetrandra

        The project supported by National Natural Science Foundation of China(81470159);and National Science and Technology Major Projects for″Major New Drugs Innovation and Development″(2013ZX09508104)

        DU Guan-hua,E-mail:dugh@imm.ac.cn,Tel:(010)63165184

        R965.1,R285

        A

        1000-3002-(2016)03-0243-05

        2015-11-23接受日期:2016-01-30)

        (本文編輯:喬 虹)

        國家自然科學基金(81470159);國家科技重大專項(2013ZX09508104)

        楊秀穎,女,博士,副研究員,主要從事藥理學、新藥藥物篩選研究;杜冠華,男,研究員,博士生導師,主要從事藥理學、新藥藥物篩選研究。

        杜冠華,E-mail:dugh@imm.ac.cn,Tel:(010)63165184

        猜你喜歡
        細胞毒纖維細胞抑制率
        中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
        黑龍江科學(2023年8期)2023-06-04 08:40:58
        血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
        Tiger17促進口腔黏膜成纖維細胞的增殖和遷移
        崗松中二氫黃酮的分離、絕對構型的確定及細胞毒活性
        滇南小耳豬膽道成纖維細胞的培養(yǎng)鑒定
        廣藿香內(nèi)生真菌Daldinia eschscholzii A630次級代謝產(chǎn)物及其細胞毒活性研究
        日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
        微紫青霉菌次級代謝產(chǎn)物的化學成分和細胞毒活性
        中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:07:47
        胃癌組織中成纖維細胞生長因子19和成纖維細胞生長因子受體4的表達及臨床意義
        兩種制備大鼠胚胎成纖維細胞的方法比較
        欧美金发尤物大战黑人| 综合成人亚洲网友偷自拍| 国产激情一区二区三区在线| 国产精品成人va在线观看| 国产喷水福利在线视频| 东京热加勒比日韩精品| 国产精品视频白浆免费视频| 超碰97人人射妻| 久久精品成人欧美大片| 亚洲一区二区精品久久岳| 亚洲成人激情深爱影院在线| 伊人久久大香线蕉av色| 日本韩无专砖码高清| 无码av专区丝袜专区| 成人av综合资源在线| 一二三四日本中文在线| 欧美精品黄页在线观看视频| 精品蜜桃视频在线观看| 人妻中文字幕在线中文字幕| 亚洲欧洲精品无码av| 人妻久久999精品1024| 日本一区二区啪啪视频| 国产成人无码一区二区三区| 最新国产乱人伦偷精品免费网站 | 国产精品久久这里只有精品| 青青草视频在线观看绿色| 欧美变态另类刺激| 亚洲肥老熟妇四十五十路在线| 国产高清亚洲精品视频| 中国亚洲一区二区视频| 亚洲av蜜桃永久无码精品| 中文不卡视频| 中文字幕乱码一区在线观看 | 久久九九青青国产精品| 一区二区激情偷拍老牛视频av| 草色噜噜噜av在线观看香蕉| 成 人 网 站 免 费 av| 少妇一级aa一区二区三区片| 亚洲免费国产中文字幕久久久 | 亚洲色欲色欲www在线播放| 大伊香蕉精品视频一区|