趙亞榮，石階平，黃健祥,王富華*

(1.農業(yè)部農產(chǎn)品質量安全檢測與評價重點實驗室，廣東　廣州　510640；2.廣東省農業(yè)科學院　農產(chǎn)品公共監(jiān)測中心，廣東　廣州　510640；3.中國農業(yè)大學　食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京　100083)

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高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定大米與小米中柄曲霉素殘留

趙亞榮1,2,3，石階平3，黃健祥1,2,王富華1,2*

(1.農業(yè)部農產(chǎn)品質量安全檢測與評價重點實驗室，廣東廣州510640；2.廣東省農業(yè)科學院農產(chǎn)品公共監(jiān)測中心，廣東廣州510640；3.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083)

通過優(yōu)化提取溶劑及其體積、超聲時間及吸附劑，建立了一種快速、簡單、準確測定大米和小米中柄曲霉素的分析方法。以乙腈為提取溶劑，乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附劑凈化，上清液過膜后進行分析，在電噴霧電離(ESI)模式下，采用多反應監(jiān)測(MRM)模式進行測定。結果表明，柄曲霉素在0.1～100.0 μg/L范圍內呈良好的線性，相關系數(shù)不低于0.999 0。大米中柄曲霉素的檢出限為0.03 μg/kg，定量下限為0.1 μg/kg，回收率為88.3%～91.5%，相對標準偏差(RSD)為2.3%～6.0%；小米中柄曲霉素的檢出限為0.1 μg/kg，定量下限為0.3 μg/kg，回收率為92.7%～103.8%，RSD為2.2%～6.9%，符合痕量分析的要求。采用該方法分析收集的大米和小米樣品，均未檢出柄曲霉素。

柄曲霉素；大米；小米；高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)

柄曲霉素(Sterigmatocystin，STC)是由雜色曲霉(Aspergillusversicolor)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami)等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有潛在的致癌性、致突變性和致畸性。其結構與黃曲霉毒素B1(AFB1)高度相似(如圖1)，基本結構組成為二呋喃環(huán)和氧雜蒽酮[1]。食物、飼料、屋內污垢物品是真菌產(chǎn)生STC的主要載體，一些植物和哺乳動物病原體也會導致STC的產(chǎn)生[2]。研究表明，在大鼠和猴子體內，STC的致死劑量約為AFB1的1/10；STC在大鼠體內引起肝癌所需的劑量比AFB1低1～2個數(shù)量級[3]。因此，國家癌癥研究中心(IARC)將其分為2B級致癌物[4]。大米作為我國的主糧之一，含有豐富的營養(yǎng)物質；小米作為健康食品，營養(yǎng)價值豐富。二者在生產(chǎn)、加工及儲存過程中均可能受到真菌污染，產(chǎn)生真菌毒素，因此，有必要建立一種簡便、靈敏、快速分析大米和小米中柄曲霉素的方法以保障消費者健康。

目前檢測柄曲霉素的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和色譜法。ELISA靈敏度高，特異性好，提取方法簡單，回收率好，一次實驗可檢測多個樣品；但由于STC在樣品中含量低，免疫原性弱，存在交叉反應且特異性抗體制備困難，使其在STC含量檢測中應用較少[5-6]。而色譜法主要包括薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)、氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)[7-11]。TLC由于操作簡單、所用試劑便宜等優(yōu)點，曾廣泛用于真菌毒素檢測。中國衛(wèi)生部頒發(fā)的食品中STC檢測的標準方法即為TLC技術[12]，但該方法存在檢測周期長、靈敏度較差、無法實現(xiàn)自動化等缺點，且柄曲霉素自身熒光性較弱，檢測時需衍生，操作復雜，易產(chǎn)生干擾，因此目前應用較少。HPLC-MS/MS具有選擇性好、抗干擾能力強、靈敏度高等特點，近幾年成為廣泛應用的定量檢測方法。樣品前處理作為檢測技術的重要環(huán)節(jié)，對降低基質效應、提高方法的準確度和靈敏性起著關鍵性作用。因此，高效的樣品凈化技術成為痕量分析的重要因素?；诳乖贵w反應的免疫親和柱(IAC)盡管能夠保證基質凈化效果以及準確檢測微痕量目標物[13]，但其價格較高。本研究結合操作簡單、成本低的QuEChERS前處理過程，采用HPLC-MS/MS技術，建立了一種高效、快速、準確的柄曲霉素定量分析方法。

1　實驗部分

1.1樣品、儀器與試劑

大米和小米樣品購自超市。取約500 g樣品打碎，過20目篩，置于干燥環(huán)境中備用。

高效液相色譜儀(LC-30AD)、帶電噴霧離子源三重四極桿質譜儀(LCMS-8050)，XR-ODS Ⅲ C18色譜柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)均購自日本島津公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器(A10 System，美國 Millipore 公司)；0.22 μm有機濾膜(天津津騰公司)；AL204電子分析天平(上海梅特勒-托利多公司)；YB-600A高速多功能粉碎機(浙江運邦公司)；H2050R高速離心機(湖南湘儀公司)；HU20500B超聲儀(天津恒奧公司)；QL-866渦旋儀(海門其林貝爾公司)。柄曲霉素標準品(純度≥99%，美國Sigma公司)；乙腈(HPLC級，美國Merck公司)；甲酸(純度≥98%，質譜用，美國Sigma公司)；氯化鈉和無水硫酸鎂均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2實驗方法

1.2.1柄曲霉素標準溶液的配制用乙腈溶解5 mg柄曲霉素標準品，配制成500 mg/L的柄曲霉素標準儲備液，置于-20 ℃保存。

1.2.2樣品提取與凈化稱取大米和小米樣品各5.0 g(精確至0.01 g)，分別置于50 mL離心管中，加入柄曲霉素標準溶液，室溫下放置過夜后取出，加入25 mL乙腈，旋渦1 min，超聲7 min，加入1 g無水MgSO4和1 g NaCl，旋渦1 min，離心5 min(4 500 r/min)。取上清液，加入50 mg PSA，旋渦1 min，離心5 min(4 500 r/min)。取上清液，過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS檢測。

加標樣品：稱取5.0 g(精確至0.01 g)空白樣品，按照上述過程提取，用提取上清液配制濃度依次為0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100 μg/L的基質標準溶液。

1.2.3實驗條件液相色譜條件：XR-ODS Ⅲ C18色譜柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～6 min，10%～95% B；6～6.1 min，95%～10% B；6.1～9 min，10% B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

質譜條件：電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監(jiān)測(MRM)；離子源接口溫度300 ℃；脫溶劑溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；霧化氣流速3 L/min；加熱氣流速10 L/min；干燥氣流速10 L/min；使用[M+H]+(m/z324.6)作為母離子,子離子分別為310.0(25 eV)和281.0(36 eV)，其中m/z310.0為定量離子。

2　結果與討論

2.1前處理條件的優(yōu)化

合適的樣品前處理可達到去除基質干擾、富集目標物、定量轉換等目的[14]。提取過程中加入無水硫酸鎂和氯化鈉能夠產(chǎn)生鹽析效應，使基質中親水性成分的溶解度降低，促使溶劑相和水相分離，從而提高提取效率，此外，已有研究表明，一些吸附劑的加入會造成部分目標物的損失[15]。本研究分別從提取劑組成和體積、超聲時間、吸附劑類型等方面對前處理過程進行了優(yōu)化。

2.1.1提取溶劑及體積的影響提取劑對樣品回收率的影響較大，真菌毒素的常用提取溶劑有乙腈、甲醇、乙腈-水以及甲醇-水。據(jù)文獻報道，在相同樣品中添加同樣濃度的標準樣品，采用乙腈作為提取劑時回收率較甲醇高[9-10]。參照上述文獻，本文分別以乙腈、乙腈-水(84∶16，90∶10)混合溶液作為提取溶劑，對加標濃度為100 μg/kg的大米樣品按“1.2.2”方法進行處理后，采用HPLC-MS/MS進行測定。結果表明，以乙腈為提取溶劑時，柄曲霉素的提取效果最佳。而以乙腈-水(84∶16)為提取溶劑時，柄曲霉素的回收率達140%，這與Versilovskis 等的實驗結果不同[8,16]。進一步考察了不同體積(10，20，25 mL)乙腈提取時對目標物回收率的影響，結果顯示，當乙腈體積為25 mL時，樣品的提取效果最好，回收率為105.6%。

2.1.2超聲時間的影響在相同條件下，考察了提取超聲時間(3,5,7,10 min)對目標物回收率的影響。結果顯示，柄曲霉素的回收率分別為91.4%，93.2%，94.5%和95.1%，回收率隨著超聲時間的延長而提高。但當超聲時間超過7 min后，回收率增加不明顯，且延長超聲時間會使超聲儀中的水溫升高，影響目標化合物的回收率。綜合考慮樣品處理時間等因素，最終選擇7 min作為超聲時間。

2.1.3吸附劑的影響考察了C18、弗羅里硅土、石墨化碳黑和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA) 4種吸附劑對回收率的影響，結果見圖2。從圖中可以看出，PSA作為吸附劑時，樣品中柄曲霉素的回收率最好。這是由于PSA具有弱的陰離子交換能力，主要通過氫鍵與化合物結合，可有效吸附脂肪酸、部分色素、糖和有機酸，此外PSA還同時具有一級和二級胺，與化合物的結合能力最強。而當以石墨化碳黑作為吸附劑時，回收率最差。這可能是因為石墨化碳黑的表面六邊形結構使其對平面分子或含有平面芳香環(huán)的分子具有強烈的吸附作用，由于柄曲霉素結構中含有呋喃環(huán)，因此可被石墨化碳黑吸附從而使柄曲霉素的回收率降低。弗羅里硅土是硅膠鍵合氧化鎂的吸附劑，與硅膠相似，是強極性吸附劑，主要適用于脂肪量高的樣品。C18吸附劑是硅膠基質上接有十八烷基，具有較高的碳含量，可去除大量的油脂和非極性物質，常被用作凈化劑[17]。綜合回收率和RSD結果，最終選擇PSA作為吸附劑。

2.2工作曲線、檢出限與定量下限

以樣品空白提取液配制柄曲霉素濃度在0.1～100.0 μg/L的系列標準溶液，以HPLC-MS/MS的峰面積為縱坐標(y)、以基質標樣濃度為橫坐標(x,μg/L)繪制標準曲線。以3倍信噪比作為方法的檢出限(LOD)，以10倍信噪比作為方法的定量下限(LOQ)。得出大米基質的線性方程為y=26 915x+15 548，r2=0.999 0，LOD為0.03 μg/kg，LOQ為0.1 μg/kg；小米基質的線性方程為y=21 009x+15 031，r2=0.999 0，LOD為0.1 μg/kg，LOQ為0.3 μg/kg。圖3為大米加標樣品10 μg/kg的色譜圖。

2.3回收率與相對標準偏差

稱取大米、小米樣品各5 g，分別置于50 mL離心管中，添加柄曲霉素標準溶液，旋渦混勻，使其在大米和小米中的加標水平為定量下限的1倍、5倍和10倍，室溫放置，過夜。依照“1.2.2”方法進行樣品前處理，利用HPLC-MS/MS分析。每個樣品做5個平行，計算其加標回收率。結果見表1，大米中柄曲霉素的回收率為88.3%～91.5%，相對標準偏差(RSD)為2.3%～6.0%；小米中柄曲霉素的回收率為92.7%～103.8%，RSD為2.2%～6.9%。方法的準確度及精密度符合定量分析要求。

2.4日間精密度

稱取大米、小米樣品各5 g，添加STC標準溶液，使樣品中STC的含量為100 μg/kg，按照“1.2.2”方法進行前處理并采用HPLC-MS/MS分析，每隔3 d平行測定1次，每個樣品做5個平行，測得大米和小米樣品的方法日間精密度分別為6.0%和7.4%。

2.5實際樣品分析

分別對采集自黑龍江的2013年20份大米樣品、廣東省的2013年40份大米樣品、廣東省的2014年40份大米樣品及內蒙古、山西等地不同年份26份小米樣品進行測定，所有樣品均未檢出柄曲霉素。來自黑龍江的樣品于-18 ℃保存兩年，保存溫度偏低，不利于產(chǎn)毒素菌株的生長和代謝；而廣東省80份樣品均保存在干燥、通風的環(huán)境中，同樣不利于真菌的生長。小米樣品中，有保存3年及3年以上的樣品，其中部分肉眼可見已發(fā)霉，但未檢出柄曲霉素，這可能是因為小米中真菌代謝未產(chǎn)生柄曲霉素或柄曲霉素含量低于本方法檢出限。

3　結　論

建立了大米和小米中柄曲霉素的高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析方法。該方法樣品前處理簡單快速，其準確度、精密度、線性關系和靈敏度滿足真菌毒素的分析要求，為提高農產(chǎn)品質量安全水平提供了良好的技術支持。

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Determination of Sterigmatocystin in Rice and Millet by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Ya-rong1，2，3,SHI Jie-ping3,HUANG Jian-xiang1,2,WANG Fu-hua1,2*

(1.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Agro-product Safety and Quality,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510640,China；2.Public Monitoring Center for Agro-product of Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou510640,China；3.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing100083,China)

Sterigmatocystin,a mycotoxin produced by fungi and widely distributed in cereal food,has a potential toxic effect to human and animals with risk on food safety.In this study,a rapid,simple and accurate high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was established for the analysis of sterigmatocystin in rice and millet by optimizing extraction solvent and its volume,ultrasonic time and adsorbent.The samples were extracted with acetonitrile,and cleaned up with PSA,then detected after the supernatant was filtered through nylon filter.The detection was performed in the electrospray ion(ESI) positive mode and multiple reaction monitoring(MRM) mode.The sterigmatocystin showed good linear relationships in the range of 0.1-100.0 μg/L with correlation coefficients not less than 0.999 0．The limit of detection(LOD) and the limit of quantitation(LOQ)for sterigmatocystin in rice were 0.03 μg/kg and 0.1 μg/kg,respectirely,the recoveries ranged from 88.3% to 91.5% with relative standard deviations(RSDs) of 2.3%-6.0%.The LOD and LOQ for sterigmatocystin in millet were 0.1 μg/kg and 0.3 μg/kg,respectively,and the recoveries were 92.7%-103.8% with RSDs of 2.2%-6.9%.The proposed method could meet the requirement for trace analysis.The method was applied in the the detection of the collected rice and millet samples,and no sterigmatocystin was detected.

sterigmatocystin;rice;millet;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

2016-01-04；

2016-01-26

農業(yè)部農產(chǎn)品質量安全檢測與評價重點實驗室開放課題項目(NK201501)

王富華，研究員，研究方向：農產(chǎn)品質量安全，Tel：020-85161430，E-mail：wfhwqs@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.020

O657.63;S852.44

A

1004-4957(2016)08-1041-05