田　舍， 江建新， 張　浩， 張　宏， 孫誠誼

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院， 貴州 貴陽　550004)

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原發(fā)性肺癌患者血清的代謝組學(xué)初步研究*

田舍， 江建新， 張浩， 張宏， 孫誠誼**

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院， 貴州 貴陽550004)

目的： 分析原發(fā)性肺癌患者血清中小分子代謝產(chǎn)物的改變。方法： 利用質(zhì)子核磁共振(1H NMR)檢測18例肺癌(病例組)和同期17例正常體健者(對照組)血清中小分子代謝產(chǎn)物α-葡萄糖、不飽和脂肪酸、肌酐、丙氨酸、谷氨酸鹽、丙三醇、蘇氨酸、異亮氨基酸、低密度脂蛋白、3-羥丁酸、脂類以及極低密度脂蛋白含量，通過主成分分析法比較兩組受檢者血清中小分子代謝產(chǎn)物含量的變化。結(jié)果：1H NMR圖譜能明顯區(qū)分實(shí)驗(yàn)組和對照組血清小分子代謝產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)組血清中α-葡萄糖、不飽和脂肪酸及肌酐含量較對照組明顯增加，丙氨酸、谷氨酸鹽、丙三醇、蘇氨酸、異亮氨基酸、低密度脂蛋白、3-羥丁酸、脂類及極低密度脂蛋白較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 原發(fā)性肺癌患者血清中小分子代謝產(chǎn)物與正常體健者存在差異，原發(fā)性肺癌患者血清丙氨酸、谷氨酸鹽、丙三醇、蘇氨酸以及異亮氨基酸可能成為原發(fā)性肺癌診斷標(biāo)志物。

肺腫瘤； 代謝組學(xué)； 質(zhì)子核磁共振； 診斷； 生物學(xué)標(biāo)志物

[Abstract]Objective: To analyze the change of small and medium molecular metabolites in blood serum in patients with primary pulmonary carcinoma. Methods:1H NMR was adopted to detect the content of small and medium molecular metabolite, including Alpha-glucose, unsaturated fatty acid, creatinine, alanine, glutamate, glycerol, threonine, isoleucine, low density lipoprotein, 3-hydroxybutyrate, lipids, and very low density lipoprotein, in 18 blood specimens from patients with primary pulmonary carcinoma(experimental group) and 17 specimens from healthy controls(control group). The changes of serum small and medium molecular metabolites in the two groups were analyzed and compared by Partial Least Squares (PLS). Results: MR1H map can clearly distinguish between experimental group and control group in terms of serum small molecule metabolites. In the experimental group, the serum alpha-glucose, unsaturated fatty acid and creatinine content increased significantly compared with those in control group, while alanine, glutamate, glycerol, threonine, isoleucine, low density lipoprotein, 3-hydroxybutyrate, lipids and very low density lipoprotein decreased significantly compared with those in control group, the differences were statistically significant(P<0.05). Conclusion: There exist differences in serum of small molecular metabolites between patients with primary pulmonary carcinoma and normal healthy people. In patients with primary pulmonary carcinoma, serum alanine, glutamate, glycerol, threonine, isoleucine may be the biomarkers in the diagnosis of primary pulmonary carcinoma.

[Key words]lung cancer; metabonomics; proton nuclear magnetic resonance; diagnosis; biomarkers

我國肺癌發(fā)病率已達(dá)到61.4/10萬，由于肺癌起病隱匿，患者對治療的依從性較差和可普遍運(yùn)用的檢測手段缺乏，確診的肺癌患者80%已屬于晚期，5年生存率<15%[1]。早期診斷和早期治療是預(yù)防肺癌發(fā)生和降低死亡率最有效的方法，早期診斷的肺癌患者，5年生存率可達(dá)到80%，根治切除后5年生存率可達(dá)到35%～50%[2]。因此，尋找一種高特異性、高敏感性的非損傷性的腫瘤診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床變得十分必要。代謝組學(xué)研究是比較分析健康狀態(tài)與疾病狀態(tài)下小分子代謝產(chǎn)物表達(dá)的差異，可幫助尋找各種疾病早期診斷的生物標(biāo)志物，用于疾病預(yù)后及治療效果的評判[3]?；诤舜殴舱?nuclear magnetic resonance, NMR)的代謝組學(xué)方法可以在受檢者體內(nèi)或體外快速、無損傷性地進(jìn)行代謝物含量的比較分析。本研究采用1HNMR觀察原發(fā)性肺癌患者血清中小分子代謝產(chǎn)物的變化，分析原發(fā)性肺部腫瘤患者血清特征代謝譜，從中篩選代表性小分子標(biāo)志物，以期為原發(fā)性肺癌的早期診斷提供新的分子標(biāo)記。

1　對象與方法

1.1研究對象

隨機(jī)抽取2012年1月～2013年12月診斷為原發(fā)性肺癌患者18例作為病例組，男性15例，女性3例，平均(44.6±1.47)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：胸部X線檢查發(fā)現(xiàn)肺部孤立性結(jié)節(jié)或腫物，有分葉或毛刺；肺癌高危人群，有咳嗽或血痰，胸部X線檢查發(fā)現(xiàn)局部性病變，經(jīng)積極抗炎或抗結(jié)核治療2～4周無效或病變增大；節(jié)段性肺炎在2～3個(gè)月內(nèi)發(fā)展成為肺葉不張，或肺葉不張短期內(nèi)發(fā)展成為全肺不張；短期內(nèi)出現(xiàn)無其他原因的一側(cè)增長性血性胸水，或一側(cè)多量血性胸水伴隨肺不張或胸膜結(jié)節(jié)狀改變著；明顯咳嗽、氣急，胸片顯示雙肺粟粒樣或彌漫性病變，排除粟粒性肺結(jié)核、肺轉(zhuǎn)移瘤、肺真菌病者；胸片發(fā)現(xiàn)肺部腫物，伴有肺門或縱膈淋巴結(jié)腫大，并出現(xiàn)上腔靜脈阻塞、喉返神經(jīng)麻痹或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移表現(xiàn)者。選取同期健康體檢者17例為對照組，男性8例，女性9例，平均(40.2±1.97歲)，入選標(biāo)準(zhǔn)： 既往身體健康，無長期服藥史，無重大疾病史以及近期無感染史，無吸毒及酗酒史。病例組與對照組在年齡、性別、血常規(guī)、血生化分析結(jié)果等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有入選對象均簽署知情同意書，研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1樣本的采集所有入選者采集血清前未使用任何藥物及治療干預(yù)，于清晨室溫下取空腹8 h后靜脈血8 mL，室溫下自然凝固后3 000 g離心10 min，收集上清液，編號， 置-80 ℃冷凍備用。向已編號試管中依次加入TSP重水(D2O)溶液(1 g/L)100 μL，血清500 μL及D2O 50 μL，充分震蕩混勻后， 13 000 g 離心10 min。取500 μL上清加入5 mm核磁共振管中待用，當(dāng)樣本全部溶解呈勻質(zhì)透明時(shí)，進(jìn)行核磁檢測。

1.2.2NMR數(shù)據(jù)采集及分析采用核磁共振儀(型號Bruker AV-600)檢測，檢測溫度為26.85 ℃。以三甲基硅烷(TMSP)信號峰定位化學(xué)位移(ppm)進(jìn)行調(diào)零。調(diào)整基線后以0.04 ppm為間隔，從0 ～8 ppm對譜圖進(jìn)行積分處理，對譜峰進(jìn)行相位校正，進(jìn)行傅立葉變換(MestRec軟件)得到1H NMR譜圖，以0.01 ppm進(jìn)行分段積分。將積分按每張譜的總積分強(qiáng)度歸一化。所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件保存。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

病例組血清1H-NMR圖譜(圖1)，利用SIMCA-P 10.0軟件進(jìn)行PCA分析獲得血清中小分子代謝產(chǎn)物散點(diǎn)圖，用以區(qū)分2組人群，在血清1HNMR譜的得分圖中，病例組與正常對照組能明顯區(qū)分開(圖1)，通過檢測血清樣品，得到血清1H NMR圖譜(圖2)。根據(jù)化學(xué)位移進(jìn)行分段積分，

圖1　病例組與對照組血清1HNMR譜中三維積分圖Fig.1　Three dimensional integral map of serum1HNMR in experimental group and control group

通過t檢驗(yàn)方法篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的化學(xué)位移段，經(jīng)過1H NMR圖譜比對小分子代謝物，發(fā)現(xiàn)病例組血清中α-葡萄糖、不飽和脂肪酸及肌酐含量較對照組明顯增加，丙氨酸、谷氨酸鹽、丙三醇、蘇氨酸、異亮氨基酸、低密度脂蛋白、3-羥丁酸、脂類及極低密度脂蛋白較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3　討論

腫瘤作為一種基因疾病，可以認(rèn)為是一種代謝性的疾病，當(dāng)腫瘤基因開始突變與抑癌基因的失活，從細(xì)胞基因改變開始到細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，細(xì)胞代謝狀態(tài)始終貫穿于腫瘤的發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程中。機(jī)體代謝物的整體相關(guān)圖譜可反映細(xì)胞、組織或器官的生理狀態(tài)，系統(tǒng)比較不同生理狀態(tài)、不同實(shí)驗(yàn)條件下的相關(guān)性圖譜，可區(qū)分處于不同生理狀態(tài)的細(xì)胞、組織或器官[3]。

注：A為低密度脂蛋白，B為纈氨酸，C為異丁酸鹽，D為三羥基丁酸，E為海藻鹽，F(xiàn)為乳酸鹽，G為乙酸鹽，H為糖蛋白，I為乙酰半胱氨酸，J為乙酰乙酸鹽，K為谷氨酰胺，L為天冬氨酸鹽，M為二甲胺，N為賴氨酸，O為肌酐，P為丙三醇，Q為谷氨酸鹽，R為丙氨酸，S為β-葡萄糖，T為α-葡萄糖圖2　被檢血清代謝組分600.13 MHz單脈沖1H NMR圖譜Fig.2　600.13 MHz single pulse 1H NMR map of serum metabolic components

代謝產(chǎn)物定位信號峰化學(xué) 位移(10-6)變化趨勢(1)α-葡萄糖5.24、3.76、3.72增加肌酐3.92增加丙氨酸3.76增加谷氨酸/谷氨酰胺3.68、2.08減少丙三醇3.64減少蘇氨酸3.6減少異亮氨基酸1.28、0.93減少低密度脂蛋白1.24減少3-羥丁酸1.2減少極低密度脂蛋白0.88減少膽固醇0.72減少

(1)與對照組比較的變化趨勢

本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肺癌患者機(jī)體出現(xiàn)糖代謝亢進(jìn)和脂肪代謝的減弱，這可能是因?yàn)榉尾磕[瘤的生長攝取了患者血清中大量能量物質(zhì)，機(jī)體為保證其他正常器官機(jī)體能量代謝需要，須增加有氧氧化途徑中的“原料”而出現(xiàn)糖代謝亢進(jìn)和脂肪代謝的減弱，丙氨酸、支鏈氨基酸等作為能量物質(zhì)參與機(jī)體糖異生代謝，補(bǔ)償機(jī)體因?yàn)槁韵娜鄙俚哪芰縖4-5]。同時(shí)因?yàn)樘穷惔x的亢進(jìn)，造成血清中脂肪代謝途徑的抑制，引起脂類相關(guān)代謝產(chǎn)物的降低。

氨基酸代謝不僅對于機(jī)體合成代謝有重要作用，對于腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲能力同樣具有重要的意義。某些氨基酸如同腫瘤標(biāo)志物一樣，在肺癌、皮膚癌、前列腺癌、結(jié)腸和乳腺癌不同的腫瘤患者中表現(xiàn)出異常表達(dá)，但是在慢性消耗性疾病中與正常人沒有太大差別[3，6-11]。腫瘤在肺部的生長，不僅影響人體呼吸、循環(huán)系統(tǒng)，同樣會(huì)引起機(jī)體能量代謝方面的改變，并造成整體代謝狀態(tài)的改變，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)一些氨基酸代謝相關(guān)的酶發(fā)生代謝狀態(tài)改變，造成氨基酸的異常表達(dá)，為腫瘤組織提供能量，構(gòu)建自己生長發(fā)育所需相關(guān)蛋白，而且還能逃逸宿主免疫系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用和免疫監(jiān)視等作用[12]。氨基酸還可作為信號分子，參與到腫瘤細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞各種信號通路中，并作為原癌基因下游作用蛋白對自身進(jìn)行調(diào)控、參與細(xì)胞能量相關(guān)代謝調(diào)控信號通路形成，控制細(xì)胞的增殖周期、生長以及侵襲能力[13-14]。

代謝組學(xué)作為生物系統(tǒng)定性和定量的手段，在自然產(chǎn)物的分析、基因功能檢測得到了長足的發(fā)展。本文通過1H-NMR方法對原發(fā)性肺癌患者血清中代謝物的篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中α-葡萄糖、不飽和脂肪酸及肌酐含量較健康者明顯增加，丙氨酸、谷氨酸鹽、丙三醇、蘇氨酸、異亮氨基酸、低密度脂蛋白、3-羥丁酸、脂類及極低密度脂蛋白較對照組明顯減少(P<0.05)。對于符合上述代謝結(jié)果變化的患者應(yīng)高度重視，列為原發(fā)性肺癌高危人群。1H-NMR為臨床診斷工作提供一條研究疾病機(jī)制的重要手段，為肺癌在早期及作出診斷及治療，對患者生理代謝功能的調(diào)節(jié)，有助于延長患者的生存期。

[1]龍莉艷,張桂云.肺癌研究文獻(xiàn)的循證計(jì)量分析[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志， 2008 (12): 1105-1111.

[2]支修益,石遠(yuǎn)凱,于金明.中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015版)[J].中華腫瘤雜志， 2015(37):67-78.

[3]Camacho D, de la Fuente A, Mendes P. The origin of correlation in metabolomics data[J]. Metabolomics, 2005(1): 53-63.

[4]Gaurav K, Goel RK, Shukla M,et al. Glutamine: A novel approach to chemotherapy-induced toxicity [J]. Indian J Med Paediatr Oncol, 2012 (1):13-20.

[5]范志娟,田亞瓊,劉寶陽,等.中分化HCC患者組織中游離氨基酸水平變化[J]. 營養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2015 (1)：96-98.

[6]張國濱,張晉,徐恒周,等.支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶1在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義[J]. 中華神經(jīng)外科雜志, 2015 (12)：1259-1262.

[7]Kumar SS, Rao MR, Balasubramanian MP. Antiproliferative role of indigofera aspalathoides on 20 methylcholanthrene induced fibrosarcoma in rats.[J].Asian Pac J Trop Biomed, 2012(12):966-974.

[8]Sinha S, Ekka M, Sharma U, et al. Assessment of changes in brain metabolites in Indian patients with type-2 diabetes mellitus using proton magnetic resonance spectroscopy[J]. BMC Res Notes, 2014(7):7-14.

[9]Varol S, ?zdemir HH, Cevik MU, et al. Protective effects of l-glutamine against toxicity of deltamethrin in the cerebral tissue [J]. Neuropsychiatr Dis Treat, 2016(12):1005-1011.

[10]Wang Q, Sun T, Cao Y, et al. A dried blood spot mass spectrometry metabolomic approach for rapid breast cancer detection [J]. Cancer, 2016(9):1389-1398.

[11]Lopes-Pires ME, Naime AC, Almeida Cardelli NJ, et al. PKC and AKT modulate cGMP/PKG signaling pathway on platelet aggregation in experimental sepsis, 2015 (9): e0137901.

[12]Wise DR, Thompson CB. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer[J]. Trends Biochem Sci, 2010(35):427-433.

[13]Chakrabarti G, Silvers MA, Ilcheva M. Tumor-selective use of DNA base excision repair inhibition in pancreatic cancer using the NQO1 bioactivatable drug, β-lapachone[J]. Sci Rep, 2015 (5):17066.

[14]Brown DM, Williams H, Ryan KJ, et al. Mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK-M) and serine biosynthetic pathway genes are co-ordinately increased during anabolic agent-induced skeletal muscle growth[J]. Sci Rep, 2016(6): 22090-22102.

(2016-03-25收稿，2016-07-01修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Primary Study of Serum Metabonomic on Patients with Primary Pulmonary Carcinoma

TIAN She, JIANG Jianxin, ZHANG Hao, ZHANG Hong, SUN Chengyi

(TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniveristy,Guiyang550004,Guizhou,China)

貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(gzwjkj2014-1-004); 貴陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目[(2010)筑科農(nóng)合字第1-社-19號]

Email:chengyisun@medmail.com.cn

R734.2

A

1000-2707(2016)08-0915-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.012

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