侯劍偉　張彤　丁越　劉云　劉祥蘭

（上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海201203）

大黃蒽醌類化合物柱色譜分離的教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)計(jì)※

侯劍偉張彤丁越劉云劉祥蘭

（上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海201203）

目的色譜分析實(shí)驗(yàn)中柱色譜分離實(shí)驗(yàn)是中藥學(xué)專業(yè)學(xué)生需掌握的一個(gè)實(shí)驗(yàn)技能，學(xué)生通過該實(shí)驗(yàn)掌握實(shí)驗(yàn)技能外，還通過該實(shí)驗(yàn)掌握色譜中一些常用術(shù)語和參數(shù)的計(jì)算及意義。方法用硅膠柱色譜分離大黃蒽醌類化合物，以硅膠（200～300目）為吸附劑、石油醚：乙酸乙酯（4∶1）為洗脫劑洗脫。結(jié)果蒽醌類化合物在洗脫過程中，中能明顯分離3個(gè)色帶，色帶間分離度良好。結(jié)論以柱色譜分離大黃蒽醌類化合物做為色譜分析中柱層析實(shí)驗(yàn)，完全滿足實(shí)驗(yàn)教學(xué)需要。

色譜；大黃；蒽醌類化合物；柱層析；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

色譜分析實(shí)驗(yàn)是中藥學(xué)專業(yè)必須掌握的一類實(shí)驗(yàn)，其內(nèi)容主要包括柱層析、薄層色譜層析及色譜類儀器分析實(shí)驗(yàn)。學(xué)生通過該類實(shí)驗(yàn)課程，不僅學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的操作技能，更通過該類課程加深儀器分析課程中色譜理論的學(xué)習(xí)。大黃蒽醌類化合物提取分離實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在部分中醫(yī)藥院校有開設(shè)，但主要開設(shè)在中藥化學(xué)、天然藥物化學(xué)課程中。中化類課程側(cè)重利用PH萃取法分離鑒定大黃中游離蒽醌，而大黃分離應(yīng)用在色譜分析類實(shí)驗(yàn)中較少。大黃根莖中主要含有五種蒽醌類化合物，極性由大到小為大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。由于結(jié)構(gòu)不同，極性不同，在硅膠柱色譜上的吸附性能也不同，可用硅膠柱色譜法分離。

1　儀器與試劑

石油醚60℃～90℃（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸乙酯（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），柱層析用硅膠200～300目（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硅膠H板（青島海洋化工有限公司）。樣品制備：大黃乙醇提取物：取大黃粉末100 g，加入400 ml乙醇，超聲提取30分鐘，過濾藥材殘?jiān)?，減壓回收乙醇，得到大黃乙醇提取物。大黃乙醇提取物拌硅膠樣品：取大黃乙醇提取物，加入3倍量的柱層析用硅膠，加入乙酸乙酯適量復(fù)溶，連同硅膠在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干待用。

2　實(shí)驗(yàn)步驟

2.1大黃蒽醌化合物的柱色譜分離裝柱：取柱內(nèi)徑為1.5 cm的色譜柱一根，長(zhǎng)度約30 cm，按柱層析干法裝柱，將7 g柱層析硅膠裝入色譜柱中，輕輕敲打色譜柱，使之結(jié)實(shí)備用。上樣：將0.2 g左右的苷元硅膠混合物加于硅膠上端，平鋪成一薄層，再在上面加入1 cm的石英砂。洗脫：取石油醚：乙酸乙酯（4∶1）的混合溶劑洗脫。大黃蒽醌類化合物在層析柱中顯3個(gè)色帶，由下至上，第一色帶為大黃素甲醚與大黃酚的混合物、第二色帶為大黃素，第三色帶為蘆薈大黃素。用量筒收集各色帶及空白帶，方便記錄其體積。

2.2數(shù)據(jù)記錄記錄所用硅膠用量（m），初次加入硅膠柱上端洗脫劑的體積（約30 ml）及在色譜柱中高度H0，打開活塞，第一滴洗脫液流出色譜柱時(shí)，殘留石英砂上端洗脫液高度（H1），色譜柱內(nèi)徑（d），計(jì)算死體積（V0），記錄洗脫各個(gè)色帶或空白帶的保留體積。用尺量出各色帶流出色譜柱時(shí)的高度（WR）。記錄參數(shù)見圖1。

圖1　大黃蒽醌柱色譜分離示意圖

2.3計(jì)算和分析本實(shí)驗(yàn)學(xué)生需掌握柱色譜分離的實(shí)驗(yàn)操作步驟，還需結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算參數(shù)如下：死體積V0：指的是色譜柱中未被固定相占據(jù)的空隙體積，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，即第一次加入色譜柱的流動(dòng)相體積減去當(dāng)?shù)谝坏蜗疵撘毫鞒錾V柱時(shí)柱上端的洗脫劑體積。數(shù)據(jù)記錄時(shí)記錄第一次加入洗脫劑時(shí)柱上端洗脫劑高度H0，加入的體積V初（約30ml），當(dāng)?shù)谝淮蜗疵搫┝鞒錾V柱時(shí)，色譜柱上端殘留洗脫劑高度H1。死體積V0計(jì)算公式可簡(jiǎn)化為：

保留體積VR：從洗脫開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。本實(shí)驗(yàn)有3個(gè)色帶，其保留體積VR計(jì)算公式為：

調(diào)整保留體積VR：扣除死體積后的保留體積。其計(jì)算公式為：

理論塔板數(shù)nR：色譜柱分離效率的指標(biāo)。其計(jì)算公式為：

分配系數(shù)K：溶質(zhì)在兩相中的遷移能力及分離效能

2.4大黃蒽醌化合物薄層色譜鑒定取大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇分別配制成0.5 mg/ml溶液。吸取上述三種對(duì)照溶液及收集到的3個(gè)色帶分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚（30～60℃）一甲酸乙酯一甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視［1］。

4　大黃苷元提取物制備考察

大黃苷元提取一般所用方法為甲醇加熱回流，或三氯甲烷回流提?。?-3］。所用試劑量大，步驟繁瑣，本文采用乙醇超聲提取的方法，并對(duì)這三種提取方法進(jìn)行了提取率、耗時(shí)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了考察，結(jié)果見表1。

表1　不同提取方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

由表1可見雖然甲醇回流與氯仿回流提取率較高，但兩者耗時(shí)較長(zhǎng)，步驟繁瑣，試劑用量較大，有一定的毒性，而乙醇超聲耗時(shí)短，試劑用量小，無毒。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。實(shí)際每組學(xué)生用量約0.06 g提取物浸膏粉，用量較少。因此選用乙醇超聲提取大黃苷元混合物，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作量。

5　洗脫劑體系的考察

原大黃蒽醌柱色譜分離實(shí)驗(yàn)洗脫劑體系為三氯甲烷：丙酮（95∶5），三氯甲烷對(duì)心、肝、腎有損害，為可疑致癌物［4］，在倡導(dǎo)綠色化學(xué)的今天，少用及不用對(duì)環(huán)境、人體危害大的試劑已成了共識(shí)，因此考察了幾個(gè)洗脫劑體系替代掉三氯甲烷，以分離色帶、分離度、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)作為考察指標(biāo)，考察結(jié)果見表2

表2　不同洗脫劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的考察

由表2可見，各色帶間的分離度都能達(dá)到＞1.5，能夠完全分離。用三氯甲烷：丙酮和二氯甲烷：丙酮體系只能分離2個(gè)色帶，環(huán)已烷：乙酸乙酯體系耗時(shí)太長(zhǎng)，不適合作為教學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此選用石油醚：乙酸乙酯體系。

6　洗脫劑比例及硅膠用量的考察

對(duì)不同比例石油醚：乙酸乙酯洗脫劑及硅膠用量進(jìn)行優(yōu)化，以分離度與實(shí)驗(yàn)耗時(shí)作為考察指標(biāo)結(jié)果如下

表3　洗脫劑比例及硅膠用量的考察

從表3的結(jié)果來看，硅膠用量降至7 g后，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)能滿足實(shí)驗(yàn)教學(xué)需要，色帶間均能完全分離。根據(jù)實(shí)際教學(xué)時(shí)間安排，選用石油醚：乙酸乙酯4∶1硅膠用量為7 g的條件對(duì)大黃蒽醌提取物進(jìn)行分離。

7　結(jié)語

選用大黃作為作為通過柱層析實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)色譜理論的實(shí)驗(yàn)教學(xué)其優(yōu)點(diǎn)：大黃蒽醌類化合物其顏色黃色，在該實(shí)驗(yàn)中，能明顯的在色譜柱中顯示3個(gè)色帶，學(xué)生可憑肉眼觀察，進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄并進(jìn)行相關(guān)色譜參數(shù)的計(jì)算。該實(shí)驗(yàn)所用試劑安全低毒，用量少，分離產(chǎn)物可用作下一步實(shí)驗(yàn)的材料，實(shí)驗(yàn)契合綠色化學(xué)5R的理念。該課程可靈活銜接其他實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，方便開設(shè)綜合類實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。分離的產(chǎn)物可用過薄層層析、高效液相色譜進(jìn)行純度的鑒定等。該實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)間適中，從教師講解到學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)需時(shí)150～180 min，滿足本專科學(xué)校一次實(shí)驗(yàn)課的時(shí)間。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部［S］.2015:22.

［2］張海暉，裘愛泳，等.超聲技術(shù)提取大黃蒽醌類成分［J］.中成藥，2005，27 （9）:1075.

［3］劉建華，韓立強(qiáng)，等.提取方法對(duì)大黃蒽醌類成分及抗氧化活性的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（22）:9484.

［4］曹勵(lì)，陳瑛，等.氯仿對(duì)機(jī)體免疫功能的毒性作用［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2003（4）.

A Teaching Experiment Project Design of Rhubarb Anthraquinones Compounds Column Chromatography Separation

HOU Jianwei，ZHANG Tong，DING Yue，LIU Yun，LIU Xianglan
（Experimental Center for Teacher&Learning，Shanghai University of TCM，Shanghai 201203，China）

Objective The column chromatography separation in chromatographic analysis experiment is one of majors of Chinese materia medica students to master the experimental skills.Through the experiment，students grasp the skill of experiment，and through the experiment，students master some common terms in chromatography and parameter calculation and significance.Methods Using silica gel column chromatography separation of rhubarb anthraquinone compounds，silica gel（200-300 mesh）was used as adsorbent，petroleum ether，ethyl acetate（4：1）was used as the eluent elution.Results The anthraquinone compounds in the process of elution can clearly separate 3 ribbons，and ribbon between the separation degree is good.Conclusion By column chromatography separation of rhubarb anthraquinone compounds as a chromatographic column chromatography in the analysis of the experiment fully meets the needs of the experiment teaching.

chromatography；rhubarb；anthraquinones compounds；column chromatography；experimental teaching

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.18.059

1672-2779（2016）-18-0133-02

（本文編輯：李海燕本文校對(duì)：丁越2016-07-11）

上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)課程建設(shè)項(xiàng)目資金支持（No：SHUTCM2015ZDKCJS006，SHUTCM2015KCJS043）