張柱霞 孫明英 楊潔 姜樹原 閆少春 邵國

（包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)研究中心，包頭 014010）

5-Aza-CdR對低氧NG108-15細(xì)胞的影響機(jī)制研究

張柱霞 孫明英 楊潔 姜樹原 閆少春 邵國

（包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)研究中心，包頭 014010）

通過使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）抑制劑5-氮-2'脫氧胞苷（5-aza-2'deoxycytidine，5-Aza-CdR）和低氧干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞系NG108-15，旨為揭示5-Aza-CdR、低氧、低氧預(yù)適應(yīng)對NG108-15細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期影響的相關(guān)機(jī)制。利用5-Aza-CdR（10.0 μmol/L）孵育NG108-15細(xì)胞后進(jìn)行低氧與低氧預(yù)適應(yīng)處理；使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；通過RTCA分析細(xì)胞增殖指數(shù)；收集細(xì)胞后使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化情況；利用Real-time PCR檢測甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs和細(xì)胞周期相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，5-Aza-CdR和低氧抑制NG108-15細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞早期和晚期凋亡，低氧預(yù)適應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞的增殖。然而，5-Aza-CdR處理后再低氧與低氧預(yù)適應(yīng)，DNMTs和細(xì)胞相關(guān)周期基因的mRNA轉(zhuǎn)錄增加（P＜0.05）。10.0 μmol/L的5-Aza-CdR聯(lián)合低氧處理抑制細(xì)胞的增殖，低氧預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。

NG108-15細(xì)胞；5-氮-2'脫氧胞苷；低氧；低氧預(yù)適應(yīng)

低氧預(yù)適應(yīng)（Hypoxic preconditioning）是指一次或多次短暫、非致死性低氧刺激后，可以增強(qiáng)機(jī)體對致死性缺血/低氧的耐受性，是一種細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的啟動(dòng)［1］。據(jù)流行病學(xué)研究顯示臨床上各種心血管疾病都與缺血/低氧有著密切的聯(lián)系［2］，但是低氧預(yù)適應(yīng)的應(yīng)用卻研究甚少。前期的實(shí)驗(yàn)研究顯示低氧預(yù)適應(yīng)影響DNA的甲基化，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中很重要的研究方向，對DNA進(jìn)行甲基化修飾的酶是甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT），已發(fā)現(xiàn)了3種有催化活性的轉(zhuǎn)移酶［3］：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。

核苷酸類似物5-Aza-CdR［4］作為去甲基化的試劑，以其抑制DNMTs而廣泛應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)的研究［5］。由于DNA甲基化在正常細(xì)胞的周期中有重要作用，5-Aza-CdR對細(xì)胞的周期、分化和死亡產(chǎn)生影響［6］。5-Aza-CdR在腫瘤的治療方面有廣泛的應(yīng)用［7］，因其可摻入DNA中抑制DNA的復(fù)制。其在神經(jīng)發(fā)育和分化，突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶，以及維持神經(jīng)元的生存等相關(guān)基因的表達(dá)方面具有重要作用［8］。

NG108-15細(xì)胞系由Bernd Hamprecht 于1971年建立，目前已在國內(nèi)不少實(shí)驗(yàn)室傳代和利用，并將其作為生物模型［9］和藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究［10］。NG108-15細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞模型，由于其細(xì)胞膜上存在多種離子通道和受體［11］，在神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)研究領(lǐng)域是一種優(yōu)良的模型，并得到廣泛地應(yīng)用。5-Aza-CdR對腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響已有報(bào)道［12-15］，但其對神經(jīng)細(xì)胞周期的影響尚未見報(bào)道。因此，本研究利用小鼠神經(jīng)細(xì)胞系NG108-15為實(shí)驗(yàn)材料，通過研究5-Aza-CdR和低氧預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞的影響，旨為在體內(nèi)研究5-Aza-CdR對神經(jīng)系統(tǒng)的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞 NG108-15細(xì)胞購于上海細(xì)胞所。

Dulbecco，s Modified Eagle Medium（GIBCO 公司）；5-Aza-CdR（Sigma 公司）；TRIzol（TaKaRa公司）；superscript III（Invitrogen 公司）；2 X real-time PCR Mix（南京凱基）；其余試劑為國產(chǎn)試劑。CO2培養(yǎng)箱（Therom）；三氣培養(yǎng)箱（Therom）；xCELLigence DP系統(tǒng)（艾森生物公司提供）；流式細(xì)胞儀（BD FACSCantoTMⅡ）。Real-time PCR儀（ABI公司7900-HT）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及5-Aza-CdR的配制 NG108-15細(xì)胞于含10%新生牛血清的Dulbecco，s Modified Eagle Medium培養(yǎng)基，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。5-Aza-CdR粉末溶于PBS中配成濃度為1.0 mmol/L 的貯存液，過濾后-20℃保存。

1.2.2 NG108-15細(xì)胞的5-Aza-CdR和低氧處理 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到指數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為4組：C組（空白組）、H組（低氧組）、Ha組（10 μmol/L 5-Aza-CdR+低氧組）、HP（低氧預(yù)適應(yīng)組）。低氧預(yù)適應(yīng)組條件：低氧（1%O2/5% CO2/94% N2）30 min和常氧（21% O2/5% CO2/75%N2）30 min交替進(jìn)行，共4個(gè)循環(huán)，然后低氧8 h，復(fù)氧8 h；低氧組是直接低氧刺激8 h，然后復(fù)氧8 h。收集細(xì)胞。

1.2.3 RTCA測定細(xì)胞的增殖 NG108-15細(xì)胞株在進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)前一天進(jìn)行細(xì)胞傳代，當(dāng)細(xì)胞融合度在60%-80%之間，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)8×104個(gè)/mL。E-plate置于儀器檢測臺(tái)上測試培養(yǎng)基的基線。上室孔中加入細(xì)胞懸液，室溫放置30 min。測定24 h內(nèi)細(xì)胞貼壁生長情況。10 μmol/L的5-Aza-CdR藥物處理，24 h后，3個(gè)E-plate分別進(jìn)行不同條件的處理，對照、低氧、低氧預(yù)適應(yīng)處理。實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞增值指數(shù)。

1.2.4 NG108-15細(xì)胞流式測定凋亡和周期 收集細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液洗3遍，加入預(yù)冷的70%的乙醇固定1 h，用3 mL PBS在流式管中洗一遍，用1 mL PI染色4℃避光反應(yīng)30 min。測定細(xì)胞周期的變化。

預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞懸液3遍，用1 mL的Binding buffer懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移100 μl到流式管中，染色，渦旋震蕩，室溫避光放置15 min，補(bǔ)加400μL的Binding buffer。測定細(xì)胞凋亡的變化。

1.2.5 Real-time PCR檢測DNMT各亞型在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化 TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，Nondrop 2000微量分光光度計(jì)檢測總RNA的純度和含量。使用的superscript III試劑盒（Invitrogen公司）逆轉(zhuǎn)錄總RNA成為cDNA，于-20℃保存。引物由Invitrogen公司合成（表1）。

Real-time PCR：Real-time PCR的條件與先前發(fā)表文章相同［7］。Real-time檢測中CCND1、CCND2和DNMTs的CT值通過β-actin的CT值均一化，即ΔCT= CT目標(biāo)基因-CTbeta-actin，而DNMTs mRNA相對豐度值以ΔΔCT值（DD value）表示，ΔΔCT=2-ΔCT。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA和Tukey對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，數(shù)值以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)圖

NG108-15細(xì)胞分別進(jìn)行C、H、Ha、HP四種不同的處理，24 h后倒置顯微鏡下觀察它們的形態(tài)變化情況。圖1可以看出，C組細(xì)胞呈現(xiàn)上皮性貼壁生長，細(xì)胞呈多角形，形狀不規(guī)則，輪廓清楚，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞生長旺盛（圖1-C）；H組有少部分細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了皺縮，多角形態(tài)趨于規(guī)則，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞間接觸變松，部分細(xì)胞體積縮小，胞核固縮，染色質(zhì)凝集成塊狀，折光性及貼壁能力減弱，增殖減慢，細(xì)胞存活數(shù)減少，生長狀態(tài)變差（圖-H）；Ha和HP組細(xì)胞形態(tài)較H組有一定程度的好轉(zhuǎn)，不過HP組表現(xiàn)比較明顯，表明低氧預(yù)適應(yīng)可以很明顯增強(qiáng)細(xì)胞的耐受性。

圖1 不同處理下的細(xì)胞顯微形態(tài)圖（100×）

2.2 RTCA監(jiān)測加入5-Aza-CdR前后低氧預(yù)適應(yīng)細(xì)胞增值變化情況。

上一階段實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明5-Aza-CdR對細(xì)胞的抑制濃度為10 μmol/L［2］。通過RTCA（實(shí)時(shí)定量細(xì)胞動(dòng)態(tài)監(jiān)測）分析C、H、Ha和HP組對細(xì)胞增殖的作用，如圖2所示。與C組相比，H組和Ha組都抑制了細(xì)胞的增殖（P≤0.05，n=6），HP促進(jìn)細(xì)胞的增殖（P≤0.05，n=6）。與H組相比，Ha組進(jìn)一步抑制了細(xì)胞的增殖（P≤0.05，n=6），可見低氧和5-Aza-CdR都抑制細(xì)胞的增殖，而低氧預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用。

圖2 RTCA測定NG108-15細(xì)胞在不同情況下的增長指數(shù)

2.3 5-aza-CdR對低氧預(yù)適應(yīng)處理的NG108-15細(xì)胞周期和凋亡的影響

10.0 μmol/L的5-Aza-CdR處理24 h后，進(jìn)行低氧、低氧預(yù)適應(yīng)處理，24 h后，使用流式細(xì)胞儀測定C、H、Ha、HP組細(xì)胞的周期和凋亡變化情況（圖3），單純的低氧很明顯的促進(jìn)了細(xì)胞的早期和晚期凋亡，低氧預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞凋亡有抑制作用。加入5-Aza-CdR后再低氧，與對照組相比促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，但沒有直接低氧組表現(xiàn)明顯。細(xì)胞周期變化不是很顯著，但是可以觀察到5-Aza-CdR聯(lián)合低氧組細(xì)胞G2期表達(dá)增加（圖4）。

2.4 5-Aza-CdR對低氧預(yù)適應(yīng)處理的NG108-15細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞相關(guān)周期基因的影響

收集細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Real-time PCR檢測它們的表達(dá)變化情況（圖5）。以mRNA/beta-actin mRNA的相對豐度表示，H組較C組，其DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)顯著降低（0.1619±0.1157 VS 0.584 9±1.121 3， 1.433 7±1.027 2 VS 6.323 5±8.637 0，0.272 6±0.2265 VS 0.910 2±1.499 1）；HP組較H組其DNMT1、DNMT-3A和DNMT3B mRNA表達(dá)顯著升高（1.297 6 ±1.347 1 VS 0.161 9±0.115 7，4.397 1±3.776 2 VS 1.433 7±1.027 2和0.781 2±0.778 5 VS 0.272 6±0.226 5，P≤0.05，n=9）；Ha組較H組其DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)顯著升高（1.5236±1.9031 VS 0.161 9±0.115 7，18.690 2±19.326 3 VS 1.433 7±1.027 2和2.122 3±2.364 3 VS 0.272 6±0.226 5，P≤0.05，n=9），低氧很明顯地抑制了甲基轉(zhuǎn)移酶的地轉(zhuǎn)錄水平。低氧預(yù)適應(yīng)和加入5-Aza-CdR后低氧同樣會(huì)提高甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄水平，且表現(xiàn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 5-Aza-CdR對低氧預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞NG108-15凋亡的影響

圖4 流式測定NG108-15細(xì)胞周期情況

圖5 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs和細(xì)胞周期相關(guān)基因在空白組、低氧預(yù)適應(yīng)組和加入5-Aza-CdR后低氧預(yù)適應(yīng)處理組的RNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況

細(xì)胞周期相關(guān)基因，以mRNA/beta-actin mRNA的相對豐度表示（圖5），H組較C組，其CCND1和CCND2 mRNA表達(dá)顯著降低（0.429 7±0.641 9 VS 0.696 6±0.906 4，0.169 2±0.170 2 VS 0.417 1± 0.674 4），HP組較H組其CCND1和CCND2 mRNA表達(dá)顯著升高（0.565 4±0.581 8 VS 0.429 7±0.641 9P≤0.05，n=9，0.524 0±0.468 2 VS 0.169 2±0.170 2），Ha組較H組其CCND1和CCND2 mRNA表達(dá)顯著升高（0.646 5±0.738 6 VS 0.429 7±0.641 9 P≤0.05，n=9，1.305 5±1.280 0 VS 0.169 2±0.170 2），低氧很明顯的抑制了細(xì)胞周期相關(guān)基因地轉(zhuǎn)錄水平。低氧預(yù)適應(yīng)和加入5-Aza-CdR后低氧同樣會(huì)提高轉(zhuǎn)錄水平，且表現(xiàn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞模型進(jìn)行研究5-Aza-CdR和低氧預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞的影響。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化告訴我們，5-Aza-CdR和低氧處理都會(huì)使細(xì)胞的形態(tài)、伸展性、貼壁性變差，而低氧預(yù)適應(yīng)處理細(xì)胞則會(huì)使它們都有所好轉(zhuǎn)。RTCA細(xì)胞增值曲線顯示，5-Aza-CdR和低氧抑制細(xì)胞的分裂增殖，低氧預(yù)適應(yīng)很明顯地促進(jìn)分裂增殖，其增殖速度甚至超過了空白對照。我們猜測低氧和5-Aza-CdR抑制了細(xì)胞內(nèi)部的某種生長、分裂因子，使細(xì)胞的生長增殖信號(hào)傳遞受到抑制，表現(xiàn)為低氧和5-Aza-CdR處理后細(xì)胞的生長增殖受到抑制，而低氧預(yù)適應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖，為在臨床上抑制腫瘤和促進(jìn)正常細(xì)胞的增殖提供了理論指導(dǎo)。因此我們可以通過使用一定濃度的5-Aza-CdR和一定程度的低氧來抑制腫瘤細(xì)胞的生長，而同樣可以通過采用低氧預(yù)適應(yīng)的方法來預(yù)防或治療臨床上由于缺血缺氧造成的各種疾病，使癥狀得到一定程度的改善。

細(xì)胞凋亡結(jié)果提示我們，加入5-Aza-CdR后再進(jìn)行低氧處理促進(jìn)早期細(xì)胞的凋亡，但是對晚期細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用不是很明顯，直接低氧處理對細(xì)胞早期和晚期凋亡都有很明顯的促進(jìn)作用。而低氧預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞的早期、晚期凋亡都表現(xiàn)為明顯的抑制作用。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示低氧抑制甲基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，而加入5-Aza-CdR或是低氧預(yù)適應(yīng)處理后，它們的轉(zhuǎn)錄水平都提高，且都有顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

文獻(xiàn)報(bào)道5-Aza-CdR對DNMT1有抑制作用［15，16］，這與5-Aza-CdR對小鼠神經(jīng)細(xì)胞NG108-15的作用相似，同時(shí)看到低氧抑制了甲基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄，但是在低氧后加入5-Aza-CdR后卻很大程度的促進(jìn)了甲基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄水平。這與低氧預(yù)適應(yīng)有相同的表達(dá)。5-Aza-CdR處理的細(xì)胞再進(jìn)行低氧處理后，卻進(jìn)一步抑制了細(xì)胞增殖。猜測5-Aza-CdR配合低氧提高甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，DNA的甲基化表達(dá)增加，能關(guān)閉某些基因的活性，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的。同樣這種處理使細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)提高，使細(xì)胞阻滯在G2期。低氧預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，提高低氧條件下的耐受性。

5-Aza-CdR聯(lián)合低氧和低氧預(yù)適應(yīng)條件下，DNMTs和細(xì)胞周期相關(guān)基因有相同的表達(dá)水平，但是前者表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖，而后者卻表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。可見5-Aza-CdR聯(lián)合低氧對細(xì)胞的抑制作用還有其它的途徑。而且報(bào)道DNA甲基化以突觸可塑性的機(jī)制在大腦中參與學(xué)習(xí)記憶［17-20］，但是其具體機(jī)制尚不清楚。這兩個(gè)問題需要我們更深一步的探索。

4 結(jié)論

低氧抑制細(xì)胞的增殖，5-Aza-CdR聯(lián)合低氧抑制細(xì)胞的增殖但是對DNMTs和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)卻有促進(jìn)作用。低氧預(yù)適應(yīng)對DNMTs和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)卻有促進(jìn)作用，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

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［19］Morris MJ， Adachi M， Na ES， et al. Selective role for DNMT3a in learning and memory［J］. Neurobiol Learn Mem， 2014， 115：30-37.

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（責(zé)任編輯李楠）

The Affecting Mechanism of 5-aza-2'-deoxycytidine on the NG108-15 Cells in Hypoxia

ZHANG Zhu-xia SUN Ming-ying YANG Jie JIANG Shu-yan YAN Shao-chun SHAO Guo
（Biomedical Research Center of Center Laboratory，Baotou Medical College，Baotou 014010）

The aim of this study is to explore the mechanisms of 5-aza-2'deoxycytidine（5-Aza-CdR）and/or hypoxia and/or hypoxic preconditioning on the proliferation and cycle of NG108-15 cells while using the inhibitor（5-Aza-CdR）of DNA methyltransferases（DNMTs）to interfere the nerve cell line NG108-15. The 10.0 μmol/L 5-Aza-CdR was added to cell culture medium， and then cells were treated in hypoxia and/or hypoxic preconditioning. The cell morphology was observed under inverted microscope. The proliferation of NG108-15 was measured using the RTCA. The cell apoptosis and cell cycle were analyzed through flow cytometry analysis. The mRNA levels of DNMTs and cell cycleassociated gene were analyzed by real-time PCR. 5-Aza-CdR and hypoxia inhibited NG108-15 cells proliferation， promoted cell early and late apoptosis， and hypoxic preconditioning promoted cell proliferation. However， as cells were treated by hypoxic or hypoxic preconditioning after the cell treated with 5-Aza-CdR， DNMTs and mRNA transcription of cell cycle-associated genes increased. Conclusively， the jointed treatment of 10.0 μM 5-Aza-CdR with hypoxic inhibited the proliferation of nerve cell line NG108-15， and hypoxic preconditioning had a promoting effect on the cell proliferation.

NG108-15 cell line；5-aza-2'-deoxycytidine；hypoxic；hypoxic preconditioning

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.034

2015-03-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81460283），內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014MS0810），自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目［S201410127（Y02）］

張柱霞，女，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)和分子生物學(xué)，E-mail：836796250@qq.com；孫明英同為本文第一作者

邵國，男，博士，教授，研究方向：低氧神經(jīng)保護(hù)；E-mail：shootshao@163.com