譚劍 熊欣 梁萬利 彭華松 張雪洪

（上海交通大學(xué) 微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

ARTP技術(shù)選育吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株及發(fā)酵優(yōu)化

譚劍 熊欣 梁萬利 彭華松 張雪洪

（上海交通大學(xué) 微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

從一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的綠針假單胞菌P3株出發(fā)，利用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)進(jìn)行誘變育種，從初篩的20株突變株中獲得了一株P(guān)CN產(chǎn)量達(dá)到2 093 mg/L的突變株P(guān)3-9，為出發(fā)菌株的125%。隨后通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了各種營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)該高產(chǎn)菌株合成PCN的影響，結(jié)果表明發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源分別為甘油和蛋白胨，外源添加Fe3+或Fe2+對(duì)于積累PCN有顯著促進(jìn)作用，而添加苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸對(duì)PCN產(chǎn)量無明顯影響。優(yōu)化后，該突變株的PCN產(chǎn)量高達(dá)2 810 mg/L，是目前國(guó)際上通過誘變育種獲得的較高PCN產(chǎn)量。

吩嗪-1-甲酰胺；常壓室溫等離子體；培養(yǎng)基優(yōu)化

吩嗪-1-甲酰胺（Phenazine-1-carboxamide，PCN）是一種天然的吩嗪類化合物，具有廣譜的抗真菌活性，主要由假單胞菌屬合成［1-3］。與已經(jīng)獲得的農(nóng)藥藥證的第一代吩嗪類生物農(nóng)藥——申嗪霉素［4，5］相比，該抗生素具有更好的安全性、穩(wěn)定性及對(duì)植物病原真菌的抑菌活性［6，7］，在防治水稻紋枯病和小麥赤霉病等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值［8］。據(jù)報(bào)道，目前能合成PCN的微生物菌株有綠針假單胞菌PCL1391［2］，銅綠假單胞菌PAO1［9］，PUPa3［10］，PUP6［11］，MML221［8］等，但由于PCN產(chǎn)率較低，尚未能大規(guī)模推廣應(yīng)用。

由清華大學(xué)和北京思清源生物科技公司合作研發(fā)的常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種系統(tǒng)利用了ARTP在放電時(shí)產(chǎn)生的各種電子流對(duì)微生物基因進(jìn)行損傷從而誘導(dǎo)其進(jìn)行誘變，能在常壓室溫下操作，具有成本低、安全性高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)越性，取得了良好的實(shí)際應(yīng)用效果［12，13］。綠針假單胞菌HT66為本實(shí)驗(yàn)室從水稻根際分離的一株可以天然合成吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的野生型菌株，PCN產(chǎn)量可達(dá)425 mg/L，是目前國(guó)際上報(bào)道的吩嗪化合物產(chǎn)量最高的野生菌株；張平原［14］從綠針假單胞菌HT66出發(fā)，經(jīng)過多輪的紫外線和亞硝基胍處理，獲得了高產(chǎn)突變株P(guān)3，PCN產(chǎn)量為野生株的3.9倍。為了避免長(zhǎng)期使用相同誘變技術(shù)導(dǎo)致菌株出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象，本研究以P3為出發(fā)菌株，嘗試以一種新型的ARTP技術(shù)進(jìn)行誘變育種［15，16］，并對(duì)突變株的發(fā)酵條件進(jìn)行初步的優(yōu)化，進(jìn)一步提高PCN產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

出發(fā)菌株：綠針假單胞菌P3（Pseudomonas Chlororaphis P3），由實(shí)驗(yàn)室保存。

King’s B固體培養(yǎng)基［17，18］（g/L）：蛋白胨20，甘油 18.915，K2HPO40.514，MgSO40.732，瓊脂20，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基（g/L）：成分除無瓊脂外同King’s B固體培養(yǎng)基，60 mL裝于250 mL凹槽三角瓶中。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：基礎(chǔ)成分同種子培養(yǎng)基，具體成分實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化。

1.2 方法

1.2.1 PCN檢測(cè)方法 取24 h發(fā)酵液0.4 mL，加入20 μL 6 mol/L鹽酸酸化后，用3.6 mL乙酸乙酯震蕩萃取5 min，取0.4 mL萃取液吹干后加入1 mL乙腈溶解，以HPLC檢測(cè)。

HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為WondaSil-WR反相柱，流動(dòng)相為乙腈-25 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相比例：0-2min，8%乙腈-92% 25 mmol/L乙酸銨；2-20 min，乙腈濃度由8%升至60%，乙酸銨濃度由92%下降至40%；20-21 min，8%乙腈-92%乙酸銨。檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min。

1.2.2 ARTP誘變 本實(shí)驗(yàn)以PCN高產(chǎn)突變株P(guān)3作為出發(fā)菌，利用ARTP技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行誘變處理。取對(duì)數(shù)期的P3菌懸液（OD600值為0.6左右），用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次后取10 μL的菌液均勻涂抹于金屬載片。設(shè)置儀器功率為100 W，氣流量10 SLM，照射距離2 mm。實(shí)驗(yàn)中以時(shí)間為變量，各組處理時(shí)間分別為0 s、20 s、30 s、45 s、60 s、90 s、120 s，制作致死率曲線。根據(jù)致死率，以20s照射時(shí)長(zhǎng)為最佳誘變條件重復(fù)等離子體的照射誘變，以獲得最佳誘變效果。將誘變菌液稀釋后涂布King’s B平板，觀察菌株在平板上的生長(zhǎng)情況，根據(jù)菌落產(chǎn)生PCN晶體的時(shí)間和大小初步篩選出高產(chǎn)突變株，最后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，HPLC檢測(cè)PCN產(chǎn)量。1.2.3 不同營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)PCN發(fā)酵的影響

1.2.3.1 碳源的影響 在King’s B培養(yǎng)基中，以等摩爾數(shù)的碳原子為基準(zhǔn)分別添加甘油、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖作為碳源，28℃，180 r/min，搖床培養(yǎng)24 h后檢測(cè)PCN產(chǎn)量，每組設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 氮源的影響 根據(jù)不同氮源的含氮量，往King’s B培養(yǎng)基中分別添加相同摩爾量的有機(jī)氮源（蛋白胨、玉米漿、牛肉膏）和無機(jī)氮源（硫酸銨）作為氮源，其他條件同上。

1.2.3.3 微量元素的影響 根據(jù)植物根際中礦物質(zhì)成分分布，分別添加Cu2+、Fe3+、Mn2+和Zn2+四種陽離子為考察對(duì)象，陽離子最終濃度為1 mmol/L，保持陰離子為Cl-，其他條件同上。

1.2.3.4 氨基酸的影響 分別添加等摩爾濃度（1mmol/L或5 mmol/L）的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸到King’s B培養(yǎng)基中，并設(shè)空白對(duì)照組，其他條件同上。

2 結(jié)果

2.1 誘變菌株的篩選

2.1.1 ARTP誘變致死率曲線 根據(jù)致死率公式制作綠針假單胞菌P3株的誘變致死率曲線，如圖1所示。

由圖1-A可知，等離子體照射與P3株的致死率存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。照射時(shí)間20 s時(shí)，致死率為77.54%；照射時(shí)間45-90 s時(shí)，致死率在98%以上；照射時(shí)間為120 s時(shí)，菌株被完全殺死。為保證較高的正突變率，可使致死率保持在75%左右，因此本實(shí)驗(yàn)選擇20 s為最適宜的照射時(shí)長(zhǎng)，并進(jìn)行多次誘變實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1-B所示。

圖1 綠針假單胞菌P3株的ARTP致死率曲線（A）和平板培養(yǎng)菌落圖（B）

2.1.2 誘變株篩選與PCN產(chǎn)量測(cè)定 經(jīng)過ARTP誘變處理，根據(jù)固體平板培養(yǎng)基上單菌落產(chǎn)生綠色結(jié)晶（PCN）時(shí)間的先后和晶體量篩選出20株突變株，進(jìn)行在King’s B培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，并通過HPLC檢測(cè)PCN產(chǎn)量，如圖2所示。大部分初篩的誘變菌株P(guān)CN產(chǎn)量與出發(fā)菌株P(guān)3相比均有提高，只有少量菌株產(chǎn)量降低（圖2-A）；其中，誘變株P(guān)3-9產(chǎn)量最高，為P3株的125%左右，達(dá)到2 093 mg/L，說明ARTP誘變對(duì)于提高菌株P(guān)CN產(chǎn)量有著良好的效果，并選擇突變株P(guān)3-9進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2-B為突變株P(guān)3-9的HPLC檢測(cè)圖，PCN保留時(shí)間為17.199 min。

2.2 發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)PCN合成的影響 考察5種發(fā)酵常用碳源對(duì)PCN產(chǎn)量的影響，結(jié)果（圖3）表明不同的碳源對(duì)PCN產(chǎn)量影響差異很大。其中，以甘油為碳源的培養(yǎng)基中PCN產(chǎn)量最高，為2 100 mg/L左右，而以麥芽糖作為碳源PCN產(chǎn)量?jī)H為不到100 mg/L，以葡萄糖及蔗糖為碳源時(shí)的PCN產(chǎn)量稍高于空白組，分別為161 mg/L和234 mg/L。

圖2 ARTP誘變初篩菌株與出發(fā)菌株P(guān)3的PCN產(chǎn)量比（A）和菌株P(guān)3-9的HPLC檢測(cè)圖（B）

圖3 碳源對(duì)PCN合成的影響

2.2.2 氮源對(duì)PCN合成的影響 分別以有機(jī)氮源蛋白胨、牛肉膏、玉米漿和無機(jī)氮源硫酸銨、硝酸鉀為對(duì)象，考察不同氮源對(duì)PCN產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，以蛋白胨為氮源進(jìn)行發(fā)酵PCN產(chǎn)量最高，達(dá)2 031 mg/L，而添加工業(yè)常用的玉米漿和無機(jī)氮源硫酸銨、硝酸鉀幾乎無PCN產(chǎn)生。以牛肉膏為氮源PCN的產(chǎn)率與蛋白胨相比相對(duì)較低，僅為231 mg/L。

圖4 不同氮源對(duì)PCN合成的影響

2.2.3 微量元素對(duì)產(chǎn)PCN的影響 本實(shí)驗(yàn)以Cu2+、Fe3+、Mn2+和Zn2+四種陽離子為考察對(duì)象，添加各種陽離子（濃度為1 mmol/L）到King’s B培養(yǎng)基中，陰離子均為Cl-，發(fā)酵24 h后檢測(cè)PCN產(chǎn)量，結(jié)果（圖5）表明，與空白對(duì)照組相比，加入Cu2+的實(shí)驗(yàn)組中PCN產(chǎn)量反而降低，加入Mn2+和Zn2+對(duì)于PCN產(chǎn)量無明顯影響；而加入Fe3+對(duì)于PCN的積累有明顯促進(jìn)作用，比空白對(duì)照組高出約760 mg/L，高達(dá)2 810 mg/L。

圖5 不同微量元素對(duì)PCN產(chǎn)量的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證鐵離子對(duì)PCN產(chǎn)量的促進(jìn)作用，并探究不同價(jià)態(tài)鐵離子和不同陰離子對(duì)PCN合成的影響，本實(shí)驗(yàn)分別考察了2 mmol/L濃度的氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵和硫酸鐵對(duì)PCN合成的影響。結(jié)果（圖6）顯示，空白對(duì)照組中PCN產(chǎn)量為2 073 mg/L，而添加了Fe2+和Fe3+的實(shí)驗(yàn)組的PCN產(chǎn)量普遍保持在2 800 mg/L左右，產(chǎn)量提高了35%，說明Fe2+和Fe3+對(duì)于促進(jìn)PCN積累均有顯著效果。在同種陽離子條件下，陰離子種類對(duì)于PCN產(chǎn)量的影響不明顯，進(jìn)一步驗(yàn)證了鐵離子對(duì)于PCN產(chǎn)量的影響。此外，與添加Fe3+相比，添加Fe2+的PCN產(chǎn)量略低20-30 mg/L，且Fe2+不穩(wěn)定，高溫下易被氧化，故可考慮在培養(yǎng)基中添加適量FeCl3溶液，提高PCN產(chǎn)量。

圖6 添加Fe2+和Fe3+對(duì)PCN產(chǎn)量的影響

2.2.4 氨基酸對(duì)PCN合成的影響 外源添加濃度為1 mmol/L和5 mmol/L氨基酸，研究苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸對(duì)PCN合成的影響。由結(jié)果（圖7）可知，與空白對(duì)照組相比，添加色氨酸后 PCN產(chǎn)量略微降低，由此推測(cè)可能高濃度的色氨酸對(duì)合成途徑存在一定的反饋抑制作用。添加1 mmol/L的苯丙氨酸和酪氨酸對(duì)于PCN產(chǎn)量無明顯影響，而當(dāng)添加濃度為5 mmol/L時(shí)，苯丙氨酸和酪氨酸對(duì)于PCN的積累有輕微的促進(jìn)作用。

圖7 不同氨基酸對(duì)PCN產(chǎn)量的影響

3 討論

假單胞菌產(chǎn)生吩嗪類抗生素吩嗪-1-甲酰胺具有廣譜的抑菌性，具有良好的應(yīng)用前景［1-3］，但大部分研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，與工業(yè)化生產(chǎn)仍有較大差距［8-11］。本研究利用ARTP誘變育種方法對(duì)P3株進(jìn)行處理，并篩選到一株產(chǎn)量為P3株125%的高產(chǎn)突變株P(guān)3-9，并對(duì)菌株P(guān)3-9的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生物柴油合成工業(yè)的副產(chǎn)物甘油及常作為發(fā)酵氮源的蛋白胨均有利于P3-9株在發(fā)酵過程中PCN的的積累。微量元素作為生物活性物質(zhì)的組成成分或新陳代謝過程中生理活性作用的調(diào)節(jié)因子，對(duì)綠針假單胞菌PCL1391中PCN的合成［19］和銅綠假單胞菌M18中吩嗪-1-羧酸（PCA）的合成［20］有著重要的影響。本研究中，外源添加Fe3+可有效促進(jìn)菌株P(guān)CN的合成，與Tjeerd van Rij等［19］的結(jié)果一致，推測(cè)Fe3+可能是特定酶的輔助因子或者參與了吩嗪化合物的氧化還原反應(yīng)，從而明顯地促進(jìn)了次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，具體的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究［21］。在假單胞菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中，吩嗪化合物與芳香族氨基酸共用部分合成途徑［19］。但本研究中外源添加低濃度的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸對(duì)于PCN產(chǎn)量效果并未像PCL1391中所報(bào)道的PCN產(chǎn)量提高數(shù)倍的情況［19］，分析可能由于培養(yǎng)基中的復(fù)雜氮源已經(jīng)包含少量氨基酸類物質(zhì)所造成。后續(xù)可通過響應(yīng)面［22］等方法研究不同營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)綠針假單胞菌中的PCN合成的影響，并確定最優(yōu)培養(yǎng)基組分。另外，發(fā)酵條件如溫度、溶氧量及pH值也是影響次級(jí)代謝產(chǎn)物積累的重要因素，通過對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化可進(jìn)一步為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供可能。

4 結(jié)論

（1）通過ARTP誘變實(shí)驗(yàn)，制定致死率曲線并確定了最佳誘變時(shí)間20 s，并通過初篩獲得了20株誘變突變株，其中突變株P(guān)3-9的PCN產(chǎn)量最高，為出發(fā)菌株P(guān)3株的125%左右。由此可知，ARTP誘變育種是一種提高綠針假單胞菌PCN產(chǎn)量的有效手段。

（2）初步探索了培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)誘變高產(chǎn)株合成PCN的影響，確定了用于發(fā)酵積累PCN的最佳碳源和氮源分別為甘油和蛋白胨，外源添加Fe3+和Fe2+對(duì)于積累PCN有顯著的促進(jìn)作用。外源添加少量苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸對(duì)于PCN產(chǎn)量無顯著影響。

（3）由于工業(yè)育種技術(shù)的不斷發(fā)展和假單胞菌自身對(duì)環(huán)境的敏感性，誘變育種及發(fā)酵優(yōu)化可以作為有效的手段來提高吩嗪類抗生素的產(chǎn)量。

［1］Jane BL， John N. Phenazine natural products：biosynthesis，synthetic analogues， and biological aActivity［J］. Chem. Rev，2004， 104：1663-1685.

［2］Chin-A-Woeng TFC， Thomas-Oates JE， Lugtenberg BJJ， et al. Introduction of the phzH gene of Pseudomonas chlororaphis PCL1391 extends the range of biocontrol ability of phenazine-1-carboxylic acid-producing Pseudomonas spp. strains［J］. Mol Plant-Microbe Interact， 2001， 14：1006-1015.

［3］Chin-A-Woeng TFC， Bloemberg GV， Mulders IHM， et al. Root colonization by phenazine-1-carboxamide-producing bacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is essential for biocontrol of tomato foot and root rot［J］. Mol Plant-Microbe Interact， 2000，13：1340-1345.

［4］許煜泉. 綠色微生物源抗菌劑申嗪霉素（M18）［J］. 精細(xì)與專用化學(xué)品， 2004， 12（20）：8-17.

［5］沈麗娟. 高效、廣譜、安全生物殺菌劑——申嗪霉素［J］. 世界農(nóng)藥， 2011， 33（3）：58.

［6］申慧峰. 在銅綠假單胞菌根際株M18中高效轉(zhuǎn)化吩嗪-1-羧酸為吩嗪-1-甲酰胺［D］. 上海：上海交通大學(xué)， 2012.

［7］Chin-A-Woeng TFC， Bloemberg GV， van der Bij AJ， et al. Biocontrol by phenazine-1-carboxamide-producing Pseudomonas chlororaphis PCL1391 of tomato root rot caused by Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici［J］. Mol Plant-Microbe Interact， 1998， 11：1069-1077.

［8］Shanmugaiah V， Mathivanan N， Varghese B. Purification， crystal structure and antimicrobial activity of phenazine-1-carboxamide produced by a growth-promoting biocontrol bacterium， Pseudomonas aeruginosa MML2212［J］. Journal of Applied Microbiology， 2010，108（2）：703-711.

［9］Mavrodi DV， Bonsall RF， Delaney SM， et al. Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-1-carboxamidefrom Pseudomonas aeruginosa PAO1［J］. Journal of Bacteriology，2001， 183（21）：6454-6465.

［10］Kumar RS， Ayyadurai N， Pandiaraja P， et al. Characterization of antifungal metabolite produced by a new strain Pseudomonas aeruginosa PUPa3 that exhibits broad-spectrum antifungal activity and biofertilizing traits［J］. Journal of Applied Microbiology，2005， 98（1）：145-154.

［11］Naik PR， Sakthivel N. Functional characterization of a novel hydrocarbonoclastic Pseudomonas sp. strain PUP6 with plantgrowth-promoting traits and antifungal potential［J］. Research in Microbiology， 2006， 157（6）：538-546.

［12］王光耀. 高產(chǎn)率生產(chǎn)L-乳酸擬干酪乳桿菌的高通量選育方法建立及應(yīng)用［D］. 上海：華東理工大學(xué)， 2013.

［13］施躍峰， 桑金隆， 竺莉紅， 等. 等離子體處理選育之江菌素產(chǎn)生菌［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào)， 2002， 16（4）：208-211.

［14］張平原. 一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺綠針假單胞菌HT66的鑒定與改造［D］. 上海：上海交通大學(xué)， 2014.

［15］金麗華， 方明月， 張翀， 等. 常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2011， 27（3）：461-467.

［16］蔡友華， 李文鋒， 盧偉寧， 等. 新型常壓室溫等離子體（ARTP）快速誘變高產(chǎn)蘇氨酸的突變株［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2013， 29（8）：1888-1892.

［17］Shtark O， Shaposhnikov AI， Kravchenko LV. The production of antifungal metabolites by Pseudomonas chlororaphis grown on different nutrient sources［J］. Mikrobiologiia， 2003， 72：645-650.

［18］陳鴻銳， 陳碧瑤， 陳玲玲. 吩嗪-1-羧酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方的初步確定［J］. 生物技術(shù)世界， 2012（3）：21.

［19］van Rij ET， Wesselink M， Chin-A-Woeng TFC， et al. Influence of environmental conditions on the production of phenazine-1-carboxamide by Pseudomonas chlororaphis PCL1391［J］. MPMI，2004， 17（5）：557-566.

［20］李雅乾. 假單胞菌株M18吩嗪合成基因簇表達(dá)調(diào)控及其產(chǎn)物發(fā)酵優(yōu)化研究［D］. 上海：上海交通大學(xué)， 2009.

［21］Wang Y， Wilks JC， Danhorn T， et al. Phenazine-1-carboxylic acid promotes bacterial biofilm development via ferrous iron acquisition［J］. J Bacteriol， 2011， 193（14）：3606-3617.

［22］Du X， Li Y， Zhou W， et al. Phenazine-1-carboxylic acid production in a chromosomally non-scar triple-deleted mutant Pseudomonas aeruginosa using statistical experimental designs to optimize yield［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2013， 97：7767-7778.

（責(zé)任編輯李楠）

Breeding of a Phenazine-1-carboxamid-producing Strain by ARTP Mutation and Its Optimization of Fermentation

TAN Jian XIONG Xin LIANG Wan-li PENG Hua-song ZHANG Xue-hong
（State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240）

Using an atmospheric and room temperature plasma（ARTP）jet to mutagenize a phenazine-1-carboxamide-producting strain Pseudomonas Chlororaphis P3， the mutant strain P3-9 with the highest phenazine-1-carboxamide（PCN）yield of more than 2 093 mg/L was obtained from the primary-screened 20 mutant ones， and it was 125% that by the original strain. Furthermore， single factor experiment was used to investigate the effects of varied nutrient factors on the PCN synthesis of P3-9. The results showed that the best carbon source and nitrogen source were glycerol and tryptone respectively. Adding Fe3+or Fe2+had a significant effect on PCN production， and no measurable effect while adding aromatic amino acids of phenylalanine， tryptophan and tyrosine. After the optimization， the PCN yield of strain P3-9 reached 2 810 mg/L，which was the highest yield of PCN by mutation breeding in the world so far.

phenazine-1-carboxamide；atmospheric and room temperature plasma；medium optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.029

2015-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270084），國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2012AA022107），國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 （“973”計(jì)劃） （2012CB721005）

譚劍，男，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的生物合成與調(diào)控；E-mail：kevintan_2014@163.com

彭華松，男，博士，副教授，研究方向：微生物代謝調(diào)控；E-mail：hspeng@sjtu.edu.cn