李麗卡李象欽謝國文李海生鄭毅勝藤婕華高錦偉

（1.廣州大學生命科學學院，廣州 510006；2.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣州 510303）

基于cpDNA片段探討中-日間斷分布雙花木屬植物的系統(tǒng)發(fā)育學

李麗卡1李象欽1謝國文1李海生2鄭毅勝1藤婕華1高錦偉1

（1.廣州大學生命科學學院，廣州 510006；2.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣州 510303）

雙花木屬（Disanthus）植物為東亞特有瀕危物種和典型的中-日間斷分布成分，基于葉綠體DNA（cpDNA）的3個片段（psbA-trnH、rps16F-R2、psaA-ycf3）聯(lián)合對雙花木屬16個居群的164個個體進行系統(tǒng)發(fā)育學研究，系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果支持日本的D. Cercidifolius和中國的D. cercidifolius subsp. Longipes為單系類群，兩個群體間無共享單倍型，且結(jié)果進一步支持日本群體分為兩個地理組，一個來自日本本州島的中部（居群QF，CY），一個是來自日本本州島的西南部（居群gz、gd和JH）。PERMUT分析結(jié)果表明，雙花木屬居群間總的遺傳多樣性Ht（0.725）高于居群內(nèi)平均遺傳多樣性場Hs（0.148），居群遺傳差異Nst（0.905）大于Gst（0.796），存在極顯著的譜系地理學結(jié)構(gòu)。AMOVA進一步表明，雙花木屬的變異主要來自群體間，即中國和日本的兩個群體分化明顯，變異占53.08%，組內(nèi)種群間的變異占24.11%，來自個體間的變異為22.80%。

雙花木屬；瀕危；系統(tǒng)發(fā)育

雙花木屬（Disanthus）隸屬金縷梅科（Hamamelidaceae），現(xiàn)存雙花木原種（D. cercidifolius）和亞種長柄雙花木（D. cercidifolius subsp. Longipes），由于分布區(qū)域生境破壞嚴重，自然居群大小正驟減，被列為國家二級重點保護瀕危物種。該屬植物為落葉小喬木或灌木，并且是一種優(yōu)良的（觀葉、花和果）珍稀觀賞植物［1］。其葉為寬卵圓形，基部心形，后期轉(zhuǎn)紅色，長柄雙花木因葉柄長而得名；花序頭狀，腋生，有花5-8朵，排在一個平面上；果是蒴果，種子黑色，室間開裂，每室有光亮的種子數(shù)顆。該屬植物大多分布于山體陰坡或半陰坡，零星生長于低山丘陵地、山洼谷底灘地、溝谷溪流邊或溪邊坡上常綠與落葉闊葉混交林林緣，樹高約為2-5 m。雙花木自然地理分布區(qū)僅殘存于日本南部本州和四國的山地，長柄雙花木為我國中亞熱帶中東部特有，僅分布于廣東與廣西北部、湖南、江西及浙江西部的山地，近年在粵、桂北和贛東北發(fā)現(xiàn)新居群［2，3］。對雙花木屬染色體和核型的分析結(jié)果表明［4，5］，雙花木的染色體為2n=16，潘開玉與楊親二［6］的研究結(jié)果進一步得出中國的與日本的核型差異十分明顯，但是形態(tài)學的差異很小，因此兩個亞種的分類地位存在爭議。Shi等［7］通過基因序列檢測來探討金縷梅科的系統(tǒng)發(fā)育（宏觀進化）關(guān)系，認為雙花木屬與紅花荷屬、殼菜果屬、馬蹄荷屬等近緣，而與形態(tài)性狀不太一致［8-11］。近年來，隨著DNA測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，對植物基因組研究的不斷深入，DNA序列以其獨特的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于譜系地理研究。對于植物而言，葉綠體cpDNA和核糖體rDNA常被用于屬及屬以下分類單元的研究，其中葉綠體DNA的非編碼區(qū)序列（內(nèi)含子和基因間隔區(qū)）和核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）［12，13］因其功能上的限制較少，所以進化速率比編碼區(qū)快，因此很適合用于種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。本研究從分子遺傳學的角度研究雙花木屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為后續(xù)深入研究雙花木屬的譜系地理等科學問題提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用樣本均來自雙花木屬在自然分布區(qū)采集的16個居群共384個個體的葉片樣本，每個居群24個個體，分別采集新鮮嫩葉，分裝于裝有硅膠塑料袋內(nèi)進行快速烘干，并帶回實驗室冰箱保存。

表1 材料的來源、海拔及每一居群的樣品數(shù)目

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴增和測序 采用改良的CTAB法［14］提取葉片總DNA，PCR引物序列如下：

rps16F：5'-GTGGTAGAAAGCAACGTGCGACTT -3'；rps16R2：5'-TCGGGATCGAACATCAATTGCAAC-3'［15］。

psbA：5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'；trnH：5'-CGCGCATGGTGGATTCACCCAATCC-3'［16］。

psaA-ycf3-F：5'-CATTCCTCGAACGAAGTTTTTACGGGATCC-3'；psaA-ycf3-R：5'-TCCCGGTAATTATATTGAAGCGCATAATTG-3'［17］。

PCR反應(yīng)在PTC-200（MJ Research，USA）熱循環(huán)儀上來進行。20 μL PCR反應(yīng)體系如下：10 μL 2×Taq PCRMixC（北京博邁德生物技術(shù)有限公司），DNA模板1 μL，引物0.2 μL，加ddH20補至20 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃加熱變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后在72℃延伸10 min。

擴增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠上檢測，用溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察有無擴增產(chǎn)物并拍照留記錄，若擴增電泳條帶整齊單一，亮度較高，則將擴增產(chǎn)物送到北京華大基因生物有限公司進行純化并測序。部分樣本引物擴增效果，見圖1。

圖1 長柄雙花木部分個體cpDNA psaA-ycf3序列擴增產(chǎn)物電泳圖

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 測序獲得的序列先用contig軟件進行正反拼接，獲得原始數(shù)據(jù)，再用clustalX軟件進行序列比對，對有差異的位點在Chromas軟件中對應(yīng)原始峰形圖確認是否為真實變異位點，最后在BioEdit 7.0.9［18］軟件對不準確位點進行手工校正，保存獲得最終數(shù)據(jù)文件。利用DnaSP5.0［19］軟件對cpDNA單倍型、序列變異位點（Polymorphic）以及簡約信息位點（Parsimony informativesites）等參數(shù)進行統(tǒng)計。用DIVA-GIS7.5.0軟件和ArcMaplO繪制單倍型分布圖。

1.2.3 居群遺傳結(jié)構(gòu)分析 用軟件PERMUT計算居群cpDNA序列的遺傳多樣性（Ht）和居群內(nèi)平均遺傳多樣性（Hs），居群間遺傳分化系數(shù)Gst以及Nst值，計算時進行1 000次的置換檢驗。計算Gst值時只考慮單倍型頻率，其計算公式為Gst=（Ht-Hs）/Ht。用ARLEQUIN 3.0［20］軟件包中的分子變異分析（AMOVA）檢測組間、組內(nèi)居群間和居群內(nèi)的遺傳差異以及居群內(nèi)，居群間單倍型分布的分子變異分析（Fst）［21］，并在ARLEQUIN中計算每個居群的單倍型多態(tài)性（Hd）和核苷酸多態(tài)性（π）［22］。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 用PAUP4.0聚類和Bayesian方法對所得葉綠體單倍型進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。先用MODELTEST 3.06［23］搜索最適合當前數(shù)據(jù)的模型和各種參數(shù)。在PAUP*4.0bl0［24］軟件下，構(gòu)建最大簡約樹（Most parsimony，MP），其中，空位或缺失在分析之前進行替代處理。在MrBayes軟件［25］分析中，在一條冷鏈和連續(xù)遞增的三條熱鏈下共運行了1×107代，其中每2 500代保存一顆樹，最后獲得4 000顆樹，本文中在計算多數(shù)一致性樹及各分枝的后驗概率均舍棄了前2 500棵樹。

2 結(jié)果

2.1 cpDNA序列變異和居群分布

從雙花木屬自然地理分布區(qū)16個居群的164個個體中檢測了3個cpDNA片段，分別為：psbA-trnH、rps16F-R2和psaA-ycf3。序列經(jīng)比對后長度分別為：321 bp、601 bp及611 bp，其中psbA-trnH片段檢測出3種單倍型，rps16F-R2片段檢測出6種單倍型，psaA-ycf3片段檢測出5種單倍型。基于cpDNA無重組、單親遺傳的特點，我們可以把3個葉綠體片段串聯(lián)起來分析，串聯(lián)后共檢測出11種單倍型（H1-H11）（表2），串聯(lián)序列總長度為1 553 bp，包含22個變異位點，其中12個是簡約信息位點。

分析得到雙花木屬所有序列單倍型多態(tài)性（Hd）為0.679 77，總核昔酸多態(tài)性（π）為0.002 52。檢測的11種單倍型中，H1和H3為廣布單倍型（圖3），其中單倍型H1分布最廣，中國的長柄雙花木大多數(shù)居群共享這種單倍型，為85個個體所共有。此外，日本的雙花木群體除了gs居群只有單一的一種單倍型外，其他居群都檢測到兩種或兩種以上的單倍型；中國的長柄雙花木群體則所有居群都只檢測到單一的一種單倍型，且除了官山（GS）和井岡山（JG）有獨享單倍型外，其他居群都共享單倍型H1。

表2 每個居群的cpDNA單倍型統(tǒng)計

圖2 雙花木屬樣品居群和cpDNA單倍型分布圖

2.2 cpDNA遺傳多樣性、居群遺傳結(jié)構(gòu)

雙花木屬每個居群的cpDNA單倍型多態(tài)性（Hd）、核苷酸多態(tài)性（π）及核苷酸差異數(shù)（k）等遺傳多樣性參數(shù)見表3。結(jié)合表2可以看出，日本的居群QF的單倍型種類最多，有4種單倍型（H2、H3、H4和H5），其單倍型多態(tài)性（Hd）為0.490 91。在所有居群中cpDNA遺傳多樣性（Hd）范圍在0-0.533 33，核苷酸多態(tài)性（π）的范圍為0-0.002 01，最高的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性存在于日本本州島中部的CY居群和JH居群中，分別為0.533 33和0.002 01。在所有16個居群中，居群間總的遺傳多樣性Ht（0.725）高于居群內(nèi)平均遺傳多樣性場Hs（0.148）。由表4可知，居群間遺傳分化系數(shù)Gst為0.796，在1 000次置換檢驗中，950次的置換結(jié)果Nst（0.900）大于Gst，即Nst＞Gst（P＜0.05），說明親緣關(guān)系較近的單倍型發(fā)生在同樣居群中的概率較高，且存在著顯著的譜系地理學結(jié)構(gòu)；在1 000次置換檢驗中，990次的置換結(jié)果Nst（0.905）也大于Gst，即Nst＞Gst（P＜0.01），說明雙花木屬植物親緣關(guān)系較近的單倍型發(fā)生在同樣居群中的概率極高，且存在著極顯著的譜系地理學結(jié)構(gòu)。基于cpDNA單倍型的AMOVA分析結(jié)果（表5）顯示，雙花木屬的變異主要來自群體間，即中國和日本的兩個群體分化明顯，變異占53.08%，組內(nèi)居群間的變異占24.11%，來自個體間的變異為22.80%。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

本研究選用蕈樹（Altingia chinensis）為外類群，是與雙花木屬同為金縷梅科的蕈樹屬（Altingia），基于PAUP的最大簡約法（Most parsimony tree，MP）和貝葉斯模型（Bayesian）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用1 000次重復的自展分析做可靠性檢驗，其中，空位或缺失在分析之前進行替代處理。兩種方法構(gòu)樹得到的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致，結(jié)構(gòu)如圖3所示。從圖中可以看到雙花木屬分為明顯的中國和日本兩大支系，一支來自中國居群所屬的單倍型H1、H10和H11，MP支持率為86%，Bayesian后驗概率PP值為1；一支來自日本居群所屬的單倍型H2-H9，MP支持率為95%，Bayesian后驗概率PP值為1。其中，日本的雙花木群體又分為兩組支系，支系的MP支持率為80%，Bayesian后驗概率PP值為1。兩組支系一組來自日本本州島的中部（居群QF、CY），所在單倍型為H2和H5；另一組來自日本本州島的西南部（居群gz、gd和JH），所在單倍型為H3、H4和H9。中國的長柄雙花木則所有居群擁有的單倍型以平行單支系的方式聚在一起，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果揭示了雙花木屬植物中國與日本兩亞種間發(fā)生了遺傳分化。

表3 雙花木屬各居群的cpDNA片段遺傳多樣性統(tǒng)計

表4 雙花木屬cpDNA片段遺傳分化系數(shù)Nst和Gst的U統(tǒng)計（1 000次置換檢驗）

表5 雙花木屬cpDNA片段AMOVA分析

圖3 基于PAUP和MrBayes的雙花木屬cpDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 居群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)

本研究中通過對雙花木屬cpDNA 3個基因片段序列的聯(lián)合分析，得到雙花木屬總單倍型多態(tài)性（Hd）為0.679 77，總核苷酸多態(tài)性（π）為0.002 52，日本群體的遺傳多樣性高于中國群體，單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性最高的居群存在于日本本州島的中部的CY居群和JH居群，分別為0.533 33和0.002 01，結(jié)合野外采集樣品的調(diào)查結(jié)果，分析造成這一結(jié)果的原因可能是由于生境地人為的破壞，如當?shù)鼐用袼烈獾目撤ァＴ谥袊牡乩矸植紖^(qū)，除了在保護區(qū)的居群以外，其他居群都受到不同程度的人為砍伐，當?shù)鼐用裼脕懋敳窕鹗褂?，而在日本的自然地理分布區(qū)，幾乎沒有被人為破壞的痕跡。

AMOVE分析結(jié)果顯示，雙花木屬的變異主要來自中國和日本兩個群體間，變異占53.08%，而組內(nèi)居群間的變異只占24.11%，來自個體間的變異也只有22.80%。該結(jié)果與PERMUT計算結(jié)果相符，雙花木屬中國和日本兩個群體間遺傳分化系數(shù)Gst為0.796，且Nst（0.905）＞ Gst（P＜0.01），說明雙花木屬植物親緣關(guān)系較近的單倍型發(fā)生在同樣居群中的概率極高，且存在著極顯著的譜系地理學結(jié)構(gòu)。與Enstrand和Elam［26］認為Gst＞0.1意味居群間分化程度較高的研究結(jié)果一致。葉綠體DNA（cpDNA）是母系遺傳，因此在探討造成居群間遺傳分化的因素時主要考慮種子的傳播。雙花木屬種子僅靠蒴果開裂時的彈力傳播［27］，且種子的萌發(fā)受自身因素限制和外界條件的干擾較大，該屬種子發(fā)育不良，空殼多且種皮厚，不利于種子發(fā)芽，存在“花多果少”和嚴重的“大小年”結(jié)果現(xiàn)象［28］。另外，該屬植物種子萌發(fā)對溫度、光照及水分等環(huán)境因素敏感，自然條件下種子的繁殖率極低［29］。因此，當種子通過風力傳播到較遠的地方時，由于環(huán)境的改變影響了種子的萌發(fā)，使得種子成活率較低，導致在兩個亞種間缺乏基因交流產(chǎn)生了遺傳分化。其次，該屬植物兩個亞種間存在的地理隔離屏障可能是造成其較高遺傳分化水平的另一個原因。雖然在末次冰期，中國東海可能作為連接中國大陸與日本的陸橋，但是雙花木屬植物對環(huán)境的依賴性較強，當?shù)谒募o末次冰期氣候來臨時，暴露的陸橋地區(qū)沒有適合雙花木屬生長的環(huán)境，因此阻礙了該物種的遷移和傳播，致使了兩個亞種間的遺傳分化。另外，雙花木屬為較原始的類群，所以在漫長的進化歷史過程中，兩個地區(qū)間的雙花木屬群體在分子遺傳上積累了大量可以有效區(qū)分彼此的核苷酸變異，導致兩個亞種間的遺傳分化。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過cpDNA 3個片段的聯(lián)合分析，基于PAUP和Bayes的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果都支持日本的D. Cercidifolius和中國的D. cercidifolius subsp. Longipes為單系類群，且結(jié)果進一步支持日本群體分為兩個地理組，一個來自日本本州島的中部（居群QF、CY），一個是來自日本本州島的西南部（居群gz、gd和JH）。系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果顯示，日本的6個居群分化較中國的居群明顯，日本的6個居群除了gs居群只有單一的一種單倍型外，其他居群都檢測到兩種或兩種以上的單倍型；中國的長柄雙花木群體則所有居群都只檢測到單一的一種單倍型，且除了官山（GS）和井岡山（JG）有獨享單倍型外，其他居群都共享單倍型H1，兩個群體間無共享單倍型，因此，盡管兩個亞種在形態(tài)學上的差異有限，差異有限的原因推測與中國-日本具有相似的地質(zhì)因素有關(guān)，兩個地區(qū)之間的個體是否能夠進行雜交以及雜交成種后的生存和繁育情況有待進一步研究，但是本研究的結(jié)果從分子遺傳學的角度有力的支持了兩個亞種的分類地位。雙花木屬中-日間斷分布格局形成的原因可以用地理隔離假說［30］解釋，在地理隔離情況下，兩個群體被隔離后，基因流消失，隨著突變和遺傳漂變的積累，群體間產(chǎn)生分化。而新產(chǎn)生的單倍型不能擴張到被隔離的另一個地區(qū)，最終導致群體間無共享單倍型。雖然Harrison等的研究結(jié)果表明，在末次冰期，中國與日本地區(qū)之間可能被一條狹長連續(xù)的落葉林所覆蓋，存在著可能的陸橋連接著這兩個地區(qū)，有望為這兩個地區(qū)的雙花木屬群體提供基因交流的機會。但是，本研究的結(jié)果表明，雙花木屬中國和日本的兩個群體間無共享單倍型，且產(chǎn)生了較大的遺傳分化水平，說明兩者在該時期未能出現(xiàn)這個假設(shè)的情況?？赡艿慕忉尀檎f明該陸橋連接存在局部地區(qū)生境片段化現(xiàn)象，阻礙了兩個群體之間的基因流。類似的情況已有研究報道，孫逸［31］對東亞特有瀕危植物黃山梅屬（Kirengeshoma）的親緣地理學研究結(jié)果表明，黃山梅屬種下中國和日本兩個地區(qū)的黃山梅在2.71個百萬年開始分化，即上新世晚期（Lower Pliocene），提出上新世中期氣候的波動可能是黃山梅群體中-日間斷分布的原因，末次冰期存在的可能的陸橋未能給兩個群體提供基因交流的機會。祁新帥［30］對東亞間斷分布植物蛛網(wǎng)萼（Platycrater arguta Sieb. et Zucc）的生物地理學研究中，提出中國東海的冰期陸橋功能并不廣泛適用于陸橋兩側(cè)的所有落葉林地植物這一觀點，陸橋的存在對中-日間斷分布的蛛網(wǎng)萼植物幾乎沒有起到任何作用，本研究的結(jié)果從側(cè)面支持了以上學者的研究結(jié)果。

4 結(jié)論

基于PAUP和Bayes的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)一致，結(jié)果都支持日本的D. Cercidifolius和中國的D. cercidifolius subsp. Longipes為單系類群，兩個群體間無共享單倍型，缺乏有效的基因交流，且結(jié)果進一步支持日本群體分為兩個地理組，一個來自日本本州島的中部（居群QF，CY），一個是來自日本本州島的西南部（居群gz、gd和JH）。

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（責任編輯狄艷紅）

An Analysis of Phylogenetic Relationship of the Genus Disanthus Distributed Disjunctively in China and Japan Based on cpDNA Sequences

LI Li-ka1LI Xiang-qin1XIE Guo-wen1LI Hai-sheng2ZHENG Yi-sheng1TENG Jie-hua1GAO Jin-wei1
（1. School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006；2. School of Biology and Food Engineering，Guangdong University of Education，Guangzhou 510303）

Disanthus is an endemic and endangered genus in East Asia and distributed disjunctively in China and Japan. In this project，we conducted the phylogenetic study of 164 individual plants in 16 natural populations of Disanthus based on the 3 fragments（psbA-trnH，rps16F-R2， and psaA-ycf3）of chloroplast DNA（cpDNA）. The results of the phylogenetic relationship confirmed that Disanthus gercidifolius in Japan and Disanthus cercidifolius subsp. Longipes in China were monophyletic groups， and they had no share of haploid type. Furthermore，Japanese populations could be divided into 2 geographical branches， one from the center of Honshu（population QE and CY）， and the other from the southwestern Honshu（population ga， gd and JH）. PERMUT analysis showed that total genetic diversity（Ht = 0.725）of Disanthus between populations was higher than the average genetic diversity（Hs = 0.148）within populations. Regarding the genetic difference between populations， Nst（0.905）was larger than Gst（0.976；P ＜ 0.01）， demonstrating that there were significantly geographical structure of pedigree. AMOVA results further revealed that genetic variation occurred mainly between populations（53.08%）， while 24.11% among populations within a group and 22.80% among individuals within a population. These results indicated that the genetic differentiation within Disanthus between Chinese and Japanese subspecies were obvious.

Disanthus；endangered；phylogenetic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.013

2015-03-30

國家自然科學基金資助項目（31270259，30970191，30470146）

李麗卡，女，碩士研究生，研究方向：植物學及保護生物學；E-mail：421106575@qq.com

謝國文，男，教授，研究方向：植物系統(tǒng)進化與物種多樣性保護；E-mail：xieguowen126@126.com