付麗麗 那日 郭久峰 金晶

（內(nèi)蒙古大學(xué)自治區(qū)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021）

螺旋藻藻藍(lán)蛋白提取純化方法研究進(jìn)展

付麗麗 那日 郭久峰 金晶

（內(nèi)蒙古大學(xué)自治區(qū)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021）

藻藍(lán)蛋白具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗癌、抗炎及保肝護(hù)肝等諸多生理活性，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥等鄰域，其提取純化技術(shù)備受關(guān)注。列舉了近些年藻藍(lán)蛋白的提取純化技術(shù)，比較了一些主要的提取純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

螺旋藻；藻藍(lán)蛋白；提取純化

螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白是一種重要的捕光色素蛋白，在光合作用原初理論研究方面具有很重要的作用，具有更重要的開發(fā)利用價(jià)值［1］。藻藍(lán)蛋白（Phycocyanin，PC）具有抗癌、抗氧化、治療腦缺血損傷、提高機(jī)體免疫力等多種生理功能，有關(guān) PC的研究已經(jīng)成為天然海洋藥物的研究熱點(diǎn)［2］，PC 的提取分離技術(shù)也成為時(shí)下人們所關(guān)注的問題之一。傳統(tǒng)的PC分離提純技術(shù)一般通過超聲、反復(fù)凍融、酶解和高壓均質(zhì)等方法使細(xì)胞裂解獲得 PC 粗提物，然后將（NH4）2SO4沉淀法與多種色譜層析法結(jié)合使用［3］，此類方法存在步驟繁瑣、蛋白質(zhì)損失量較大、難以規(guī)模化推廣，且高于50%的生產(chǎn)成本用在純化的過程中等缺點(diǎn)［4］。近幾年不斷發(fā)展起來的新技術(shù)如雙水相萃取技術(shù)、反膠團(tuán)萃取技術(shù)、膨脹床吸附及其一些不同技術(shù)結(jié)合使用等為藻藍(lán)蛋白的規(guī)?；苽涮峁┝诵碌姆椒?。本文對(duì)上述傳統(tǒng)方法及其新技術(shù)進(jìn)行了綜述，比較了幾種主要的提取純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為藻藍(lán)蛋白的進(jìn)步研究與應(yīng)用提供參考資料。

1 螺旋藻藻藍(lán)蛋白的粗提取

藻藍(lán)蛋白的粗提取過程中細(xì)胞破碎是關(guān)鍵，細(xì)胞破碎方法的選擇是非常重要的［5］。張以芳等［6］用氯化鉀溶菌酶法或凍融法破碎螺旋藻細(xì)胞壁，應(yīng)用氯化鉀溶菌酶法破壁率高達(dá)95%以上，藻藍(lán)蛋白得率可達(dá)13.1%；凍融法破壁只適宜于處理少量樣品，大劑量螺旋藻樣品很難快速凍融，提取率達(dá)11.8%。表明酶法破壁適應(yīng)于大量藻藍(lán)蛋白制備，凍融法只適應(yīng)于小量制備。李冰等［7］用磷酸鹽緩沖液循環(huán)凍融聯(lián)合超聲波破碎法，提取率達(dá)到13.1%。金怡雯等［8］通過響應(yīng)曲面的方法，對(duì)螺旋藻藻藍(lán)蛋白的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，萃取時(shí)間和萃取溫度的交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響最為顯著；得到的最佳萃取工藝條件為：質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL、萃取時(shí)間為37.14 h、萃取溫度為25.61℃，在此萃取條件下得到的藻藍(lán)蛋白得率為13.66%。邵明飛等［9］采用響應(yīng)曲面法對(duì)超聲波破壁提取螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳工藝條件為：液料比為21 mL/g，超聲波功率為640 W，超聲時(shí)間為14 min，此條件下藻藍(lán)蛋白的得率為10.76%，與模型預(yù)測(cè)值10.77% 相近，對(duì)超聲波提取法、凍融法、恒溫浸提法進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，超聲波提取法用時(shí)短、藻藍(lán)蛋白得率高。

以上粗提取過程中主要采用了溶菌酶法，反復(fù)凍融，超聲波破碎法等方法，對(duì)其進(jìn)行列表（表1）比較，可根據(jù)其實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)奶幚矸椒ā?/p>

表1 PC粗提取細(xì)胞破碎處理方法比較

2 螺旋藻藻藍(lán)蛋白的純化技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)方法純化藻藍(lán)蛋白

傳統(tǒng)的分離技術(shù)純化藻藍(lán)蛋白如離心、硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析、羥基磷灰石層析等［10］。林紅衛(wèi)等［11］在硅藻土545柱上分級(jí)洗脫，進(jìn)一步經(jīng) DEAE-纖維素柱純化，其純度達(dá)到了4.1。另有殷鋼等［12］為發(fā)展新型海洋藥物，采用Sephacryl S-200凝膠層析和羥基磷灰石柱層析對(duì)人工養(yǎng)殖鈍頂螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白進(jìn)行分離和純化，得到了藻藍(lán)蛋白純品。隨之韋萍［13］采用自制羥基磷灰石二次上柱可得試劑級(jí)的藻藍(lán)蛋白，一次上柱后PC純度為2.80，二次上柱后純度為4.18。其次，許寶青［14］采用DEAE-SepharoseFastFlow結(jié)合羥基磷灰石柱層析法分離純化人工養(yǎng)殖鈍頂螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白，經(jīng)脫鹽、冷凍干燥后得到具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藻藍(lán)蛋白純品純度為7.25。李冰等［7］把粗蛋白提取液經(jīng)過兩次羥基磷灰石柱（HA）層析和凝膠層析對(duì)其純化，純度達(dá)到4.71。于光等［15］把固體硫酸銨沉淀鹽澤螺旋藻藻膽蛋白經(jīng)羥基磷灰石柱分離純化具光敏效應(yīng)的藻藍(lán)蛋白純度達(dá)4.7。邵明飛等［16］在磷酸鹽緩沖體系下藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng) 1.25 mol/L 硫酸銨鹽析處理后離心脫氣，只需采用一步疏水層析，藻藍(lán)蛋白的純度可提高到 4.017，回收率為 19.38%。邵明飛等［16］通過六部最佳鹽析（25%除雜，55%沉淀）（5%除雜，35%沉淀）（23%除雜，35%沉淀）操作后，藻藍(lán)蛋白純度為3.61，回收率為47.13%，經(jīng)過反復(fù)鹽析（23%除雜，35%沉淀）后，藻藍(lán)蛋白最高純度達(dá)到3.92，回收率為9.66%。這些方法耗時(shí)、復(fù)雜，難以大規(guī)模制備藻藍(lán)蛋白［17］。

2.2 新技術(shù)規(guī)?；苽湓逅{(lán)蛋白

2.2.1 反膠團(tuán)萃取純化藻藍(lán)蛋白 反膠團(tuán)是指非極性溶劑中表面活性劑分子濃度超過臨界膠束濃度引發(fā)形成的表面活性劑的極性頭朝內(nèi)、非極性頭朝外的具有極性內(nèi)核的多分子聚集體［18］。丁晧［19］等構(gòu)建了CTAB/正辛烷-正戊醇反膠束體系，通過研究此體系中水合物生成對(duì)其中的藻藍(lán)蛋白的萃取作用及純化效果，獲得反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白的動(dòng)力學(xué)規(guī)律及溫度、壓力、CTAB濃度和初始含水量等對(duì)反膠束水合萃取藻藍(lán)，研究表明，在初始溫度3℃，初始?jí)毫? MPa，CTAB濃度0.10 mol/L，初始含水量40的條件下，水合萃取藻藍(lán)蛋白的萃取率可達(dá)81.3%，表明該條件時(shí)的萃取效果比較好。反膠束水合萃取完成了萃取、反萃取及純化過程的有效耦合，相對(duì)于加鹽反萃取操作難度有所下降，但此方法仍不成熟，有部分藻藍(lán)蛋白流失。另外，劉楊等［20］研究了CTAB/正戊醇-正辛烷反膠團(tuán)溶液萃取分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白的性能，結(jié)果表明，0.04mol/L CTAB/正戊醇-正辛烷（體積比1∶4）的反膠團(tuán)體系用于萃取pH7.0，包含0.1 mol/L KCl的螺旋藻細(xì)胞破碎液，藻藍(lán)蛋白萃取率達(dá)96.3%，分配系數(shù)打26.0；用pH5.0，包含2 mol/L KBr 的反萃液反萃藻藍(lán)蛋白，反萃取率可達(dá)90.6%。

2.2.2 雙水相萃取純化藻藍(lán)蛋白 雙水相萃取原理主要是在一定濃度下，兩種水溶性不同的聚合物或者一種聚合物和無機(jī)鹽的混合溶液體系會(huì)自然分成互不相容的兩相，形成雙水相體系，被分離物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，在表面性質(zhì)、電荷間作用和各種作用力等因素的影響下，兩相間的分配系數(shù)不同，導(dǎo)致上下相的濃度不同而達(dá)到分離的目的［21］。劉楊等［22］采用PEG/硫酸鈉雙水相體系，經(jīng)一次萃取從鈍頂螺旋藻細(xì)胞破碎液中富集分離藻藍(lán)蛋白，結(jié)果顯示，萃取最適宜的條件為12% PEG4000，15% Na2SO4，1% KCl，藻藍(lán)蛋白收率為91.2%，分配系數(shù)達(dá)到8.01，分離因數(shù)達(dá)到6.33。隨后，王巍杰等［23］對(duì)構(gòu)成雙水相體系中不同分子量PEG和酒石酸鉀鈉濃度的影響進(jìn)行了分析。 確定了雙水相組成體系為 16%的 PEG2000（W/W）和 25%的酒石酸鉀鈉（W/W），pH值為6.0，在此體系中藻藍(lán)蛋白主要分布在上相，最高純度3.69，分配系數(shù)20.7，回收率94.56%。多次雙水相萃取有利于藻藍(lán)蛋白純度提高，3次雙水相萃取后，藻藍(lán)蛋白純度高達(dá)4.15。另外，于淑坤等［24］對(duì)聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取螺旋藻藻藍(lán)蛋白進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，對(duì)于藻藍(lán)蛋白含量為0.282 mg/mL的螺旋藻細(xì)胞破碎液，10% PEG2000與20%的硫酸銨雙水相體系萃取藻藍(lán)蛋白的效果最佳，經(jīng)2次萃取，藻藍(lán)蛋白總萃取率為96.1，藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到1.2。其次，齊清華［25］采用14% MgSO4、6% PEG2000、0.5% KC1的雙水相體系萃取后收集上相，再采用12% PEG、6% MgSO4的雙水相體系對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行反萃取，藻藍(lán)蛋白回收率達(dá)92.66%，藻藍(lán)蛋白純度由1.42提高到2.64?？芍?，雙水相萃取法具有節(jié)省操作時(shí)間、簡(jiǎn)化操作過程、降低能耗和成本及易于工藝放大等優(yōu)點(diǎn)。

2.2.3 膨脹床吸附純化藻藍(lán)蛋白 膨脹床吸附色譜技術(shù)是一種介于固定床吸附和流化床之間的一種新型的吸附色譜技術(shù)，可以作為實(shí)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白規(guī)?；蛛x純化的較好選擇［5］。郭靜［26］通過自制的膨脹床對(duì)螺旋藻藻藍(lán)蛋白的粗提液進(jìn)行分離富集，藻藍(lán)蛋白的純度可由粗提液的0.23 最高提高至2.02，藻藍(lán)蛋白濃度從粗提液的0.17 mg/mL 提高為 2.15 mg/ mL，膨脹床分離富集藻藍(lán)蛋白的回收率為 59.45%。然后，在ADS-7 固定床上對(duì)膨脹床純化樣品進(jìn)行層析去除雜蛋白。在優(yōu)化的條件下，獲得的藻藍(lán)蛋白層析樣品的藻藍(lán)蛋白純度為 2.20，藻藍(lán)蛋白濃度為 0.87 mg/mL，藻藍(lán)蛋白回收率為58.81%。整個(gè)偶聯(lián)分離純化過程耗時(shí) 7.0 h，藻藍(lán)蛋白總回收率為34.96%。此外，Niu等［17］將通過硫酸銨沉淀后的藻蛋白粗提液通過裝有 50 mL苯基-Sepharose 吸附劑的膨脹床，用大體積上樣，體積為298-340 mL的藻蛋白粗提液，采用0.5 mol/L硫酸銨進(jìn)行脫附，收集流出液。結(jié)果表明，通過一步膨脹床吸附，藻藍(lán)蛋白的純化因子從0.69 提高到3.0左右，且分別得到了 29.9-51.0 g 的藻藍(lán)蛋白。

2.2.4 不同技術(shù)結(jié)合純化藻藍(lán)蛋白 劉清新等［27］采用鹽析和雙水相萃取相結(jié)合的方法分離純化螺旋藻中藻藍(lán)蛋白，鹽析法采用飽和度35%-75%的硫酸銨沉淀藻藍(lán)蛋白，飽和度10%-30%的硫酸銨去除螺旋藻雜蛋白；雙水相萃取法采用8%PEG4000、16%檸檬酸鈉和4%氯化鉀組成的雙水相系統(tǒng)分離純化鹽析后的藻藍(lán)蛋白。結(jié)果表明經(jīng)6步不同飽和度硫酸銨鹽析后的藻藍(lán)蛋白純度為3.1，再經(jīng)雙水相系統(tǒng)分離純化可使藻藍(lán)蛋白純度達(dá)4.0，此種方法可大幅提高藻藍(lán)蛋白的純度，為大規(guī)模生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。另外，螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白由于存在重金屬和微囊藻毒素污染風(fēng)險(xiǎn)，使其相關(guān)產(chǎn)品的安全性受到考驗(yàn)。胡梁斌等［28］采用雙水相萃取和等電點(diǎn)沉淀對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行分離純化，最終獲得的藻藍(lán)蛋白中重金屬Cd的質(zhì)量濃度從2 μg/mL減少到0.002 3μg/mL，藻毒素的質(zhì)量濃度則都從3.5 μg/mL降到檢測(cè)限以下，其安全性可以得到保障。此外，廖曉霞等［3］采用殼聚糖親和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25 柱層析三步法分離純化藻藍(lán)蛋白，可得到高純度藻藍(lán)蛋白，純度達(dá)4.3，與傳統(tǒng)方法相比，具有成本低、耗時(shí)短、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)。

以上介紹了近幾年適用于規(guī)模化制備PC的新方法，這些方法中各有其優(yōu)缺點(diǎn)（表2），實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)考慮其具體情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

3 結(jié)語(yǔ)

在藻藍(lán)蛋白粗提取方面，人們大多采用反復(fù)凍融和超聲破碎法。純化則采用兩種以上的色譜技術(shù)相結(jié)合的方法，但其步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低不適合規(guī)模化生產(chǎn)；雙水相萃取、反膠團(tuán)萃、膨脹床吸附等方法適合規(guī)模化分離純化，但也存在其相應(yīng)的缺點(diǎn)。因此，具有低成本易操作、高提取率高純度、適合于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)的分離純化方法將具有廣闊的前景。

表2 PC規(guī)模化分離純化技術(shù)方法比較

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（責(zé)任編輯狄艷紅）

Research Progress on the Extraction and Purification of Phycocyanin from Spirulina

FU Li-li NA Ri GUO Jiu-feng JIN Jing
（College of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）

Phycocyanin has been widely used in food， cosmetics， and medicine due to its physiological properties such as anti-oxidant，improving the body’s immunity， anti-cancer， anti-inflammatory and protecting hepatocyte. Its extraction and purification technology has attracted wide attentions. This work lists several extraction and purification technologies of phycocyanin in recent years， and compares the merits and drawbacks of the major methods.

spirulina；phycocyanin；extraction and purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.011

2015-04-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（50267014）

付麗麗，女，碩士研究生，研究方向：實(shí)驗(yàn)生物物理；E-mail：359654412@qq.com