陳建興，薩如拉，李　靜，康玉潔，馬曉東，王彩霞

（1.赤峰學(xué)院　生命科學(xué)院，內(nèi)蒙古　赤峰　024000；2.平度市農(nóng)業(yè)局，山東　青島　266700）

黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因生物信息學(xué)初步分析

陳建興1，薩如拉1，李靜1，康玉潔2，馬曉東1，王彩霞1

（1.赤峰學(xué)院生命科學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000；2.平度市農(nóng)業(yè)局，山東青島266700）

通過(guò)對(duì)黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor）纖溶酶基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃粉蟲(chóng)的纖溶酶基因共包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子.整個(gè)CDS區(qū)共翻譯出258個(gè)氨基酸，這些氨基酸以絲氨酸的比例最高，其次為甘氨酸，最低的為谷氨酸.黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因的編碼存在明顯的密碼子使用偏好，其偏倚程度從天冬酰胺（N）的0%到谷氨酸（E）的100%.預(yù)測(cè)黃粉蟲(chóng)纖溶酶肽鏈的等電點(diǎn)pI在8.34左右，相對(duì)分子質(zhì)量為26KD.黃粉蟲(chóng)纖溶酶多肽鏈?zhǔn)且杂H水區(qū)和疏水區(qū)相互交錯(cuò)出現(xiàn)構(gòu)成的.另外，黃粉蟲(chóng)纖溶酶蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)多為β折疊，其次為無(wú)規(guī)卷曲，螺旋結(jié)構(gòu)所占比重較輕.

黃粉蟲(chóng)；纖溶酶基因；生物信息學(xué)分析；密碼子使用偏好

黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor）俗稱(chēng)面包蟲(chóng)，屬于昆蟲(chóng)綱，鞘翅目，擬步甲科，粉甲屬.原本是一種倉(cāng)庫(kù)和貯藏害蟲(chóng)，但因其營(yíng)養(yǎng)成分高，營(yíng)養(yǎng)含量居各類(lèi)活體動(dòng)物蛋白飼料之首（被譽(yù)為“蛋白質(zhì)飼料寶庫(kù)”），被作為飼料或食品用蟲(chóng)為人工所飼養(yǎng).黃粉蟲(chóng)具有生存能力和適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)發(fā)育快、養(yǎng)殖成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)今世界上僅次于養(yǎng)蠶、養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展最快的養(yǎng)蟲(chóng)業(yè)之一.國(guó)內(nèi)外均有近百年的飼養(yǎng)記錄，是一種飼養(yǎng)技術(shù)較為成熟的昆蟲(chóng).近年來(lái)，黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)活蟲(chóng)逐步開(kāi)發(fā)為蝎子、守宮、蛙類(lèi)、禽類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等各種寵物飼料，幼蟲(chóng)干粉正在逐步替代家畜家禽飼料中的魚(yú)粉，也有部分被開(kāi)發(fā)為蛋白粉等適用于人類(lèi)的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)品等產(chǎn)品.

黃粉蟲(chóng)體內(nèi)不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸和其它小分子次生代謝物，同時(shí)還含有豐富的纖維蛋白溶解酶類(lèi)，分離純化這些纖溶活性蛋白并研究它們的性質(zhì)對(duì)于開(kāi)發(fā)新型溶栓藥物具有重要的意義.為研究昆蟲(chóng)類(lèi)胰蛋白酶的提取和性質(zhì)，黃明星分別從地鱉蟲(chóng)和黃粉蟲(chóng)體內(nèi)分離純化得到了各自的纖溶活性蛋白，并對(duì)這些蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究［1］.余磊和韓雅莉利用生物信息學(xué)方法分析了地鱉蟲(chóng)纖溶酶成熟肽編碼序列，模擬了該酶的三維結(jié)構(gòu)，為今后進(jìn)一步研究該類(lèi)酶的纖溶機(jī)理提供了一定的參考［2］.為了深入研究黃粉蟲(chóng)纖溶酶的作用機(jī)理，余磊和韓雅莉利用生物信息學(xué)方法對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)模擬與序列分析，認(rèn)為該酶的活性中心是His（組氨酸）、Ser（絲氨酸）和Asp（天冬氨酸）三個(gè)氨基酸殘基，底物結(jié)合部位是Ser（絲氨酸）、Asp（天冬氨酸）和Gly（甘氨酸），從微觀(guān)分子水平上確認(rèn)了該酶水解纖維蛋白的機(jī)理是催化Arg（精氨酸）-Lys（賴(lài)氨酸）肽鍵的水解［3］.冼永權(quán)等以干黑螞蟻為原料，通過(guò)（NH4）2SO4分段鹽析、離子交換和層析純化得到一種纖溶活性蛋白，并對(duì)該蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)研究［4］.葉韻等通過(guò)RT-PCR和RACE得到了黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)序列，為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的提取及深入研究奠定了基礎(chǔ)［5］.吳艷玲對(duì)分離純化得到的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)纖溶活性蛋白的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)該蛋白在體外能快速選擇性抑制腫瘤細(xì)胞A549的生長(zhǎng)［6］.張冰研究發(fā)現(xiàn)黃粉蟲(chóng)纖溶活性蛋白具有一定的免疫原性，并且在血栓模型小鼠體內(nèi)顯示出了良好的體內(nèi)抗血栓作用［7］.

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法初步分析了黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因的序列特征、密碼子使用、氨基酸構(gòu)成、肽鏈?zhǔn)杷?、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)等信息，為深入研究該酶奠定了一定的基礎(chǔ).

1　數(shù)據(jù)與方法

1.1數(shù)據(jù)

本研究應(yīng)用的數(shù)據(jù)是從GenBank中查找到的黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因序列信息：GenBank Accession Number:JN662461［5］.

1.2方法

本研究采用DNAMAN軟件，分析黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因序列的密碼子使用情況、氨基酸構(gòu)成和各氨基酸位點(diǎn)的疏水性情況，并對(duì)該基因編碼多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè).

2　結(jié)果和分析

2.1黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因基本構(gòu)成

圖1　黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因和mRNA結(jié)構(gòu)模式圖［3］

黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因的外顯子和內(nèi)含子的大小構(gòu)成情況如圖1，從圖中可看出，黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因共包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，CDS區(qū)共編碼258個(gè)氨基酸.另外，圖1中顯示出了72（His）、117（Asp）、212（Ser）這三個(gè)Active sites（活性部位）和207（Asp）、228（Ser）、230（Gly）這三個(gè)Substrate binding sites（底物結(jié)合部位）.

2.2黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因的密碼子使用情況分析

通過(guò)對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因密碼子使用情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因CDS區(qū)共翻譯出由258個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，圖2中共含有259個(gè)密碼子，包含一個(gè)終止密碼子UAA.從圖2可看出，除UAG、UGA兩個(gè)終止密碼子未被使用外，亮氨酸的兩個(gè)密碼子（UUA和CUA）、蘇氨酸的兩個(gè)密碼子（ACA和ACG）、精氨酸的兩個(gè)密碼子（CGA和CGG）、脯氨酸的一個(gè)密碼子（CCG）、谷氨酸的一個(gè)密碼子（GAA）、絲氨酸的一個(gè)密碼子（AGU）和甘氨酸的一個(gè)密碼子（GGG）也未被使用.而這幾種氨基酸都是由其余密碼子進(jìn)行編碼的，說(shuō)明黃粉蟲(chóng)纖溶酶的編碼存在明顯的密碼子使用偏好.除這幾種明顯的密碼子使用偏倚外，其余密碼子的使用上也存在不同程度的偏好.在其余52個(gè)使用過(guò)的密碼子中，使用次數(shù)最多的是編碼甘氨酸（G）的GGU 15次（58‰），其次為編碼絲氨酸（S）的AGC和編碼甘氨酸（G）的GGA都為12次（46‰），而出現(xiàn)次數(shù)最少的是編碼精氨酸（R）的AGA、丙氨酸（A）的GCA（G）、纈氨酸（V）的GUG、谷氨酸（E）的GAG、組氨酸（H）的CAU（C）、賴(lài)氨酸（K）的AAG、谷氨酰胺（Q）的CAG和苯丙氨酸（F）的UUU，都分別為1次（4‰）.單純從各密碼子占同義密碼的百分率來(lái)看，甲硫氨酸（M）和色氨酸（W）都是單密碼子編碼，必然都為100%，但僅存的一個(gè)谷氨酸（E）由GAG來(lái)編碼，則其也占100%；其次為編碼谷氨酰胺（Q）的CAA，占91%.除了單密碼子的M和W，其余18種氨基酸用偏倚值即各自密碼子的最高百分率減去最低百分率來(lái)度量密碼子使用偏倚程度，發(fā)現(xiàn)偏倚最小的是天冬酰胺（N），兩種密碼子各占50%，偏倚值為0%，偏倚最大的即為谷氨酸（E），偏倚值為100%.

圖2　黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因密碼子使用情況

由表1可以看出，密碼子3個(gè)位置各個(gè)堿基所占的比例差異較大，密碼子第一位以G的比例最大（35%），C的比例最?。?6%）；密碼子第二位以C的比例最大（30%），A比例最小（18%）；密碼子第三位以C的比例最大（40%），G比例最?。?2%）.

表1　密碼子各位置堿基使用統(tǒng)計(jì)（%）

2.3黃粉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸構(gòu)成分析

從表2可看出，黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因翻譯的氨基酸種類(lèi)中絲氨酸（Ser）的比例最高（17.05%，出現(xiàn)44次），其次為甘氨酸（Gly，13.56%，出現(xiàn)35次），最低的為谷氨酸（Glu，0.39%，出現(xiàn)1次）.作為水溶性球形蛋白，親水值較低的氨基酸，趨向于堆積在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，親水值較高的氨基酸，趨向于構(gòu)成蛋白質(zhì)的外部.預(yù)測(cè)的黃粉蟲(chóng)纖溶酶的相對(duì)分子質(zhì)量（MW）為26093.2（≈26KD），等電點(diǎn)pI為8.34，在人體內(nèi)正常生理環(huán)境下，該酶帶正電，而纖維蛋白通常帶負(fù)電荷，所以黃粉蟲(chóng)纖溶酶很容易靠近纖維蛋白，并與之結(jié)合.因此，黃粉蟲(chóng)纖溶酶對(duì)血栓有一定的靶向作用.

表2　黃粉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸構(gòu)成情況

2.4黃粉蟲(chóng)纖溶酶疏水性分析

對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因編碼的258個(gè)氨基酸進(jìn)行了疏水性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，纖溶酶的多肽鏈?zhǔn)且杂H水區(qū)和疏水區(qū)相互交錯(cuò)出現(xiàn)構(gòu)成的.考慮到纖溶酶是一種水溶性蛋白，疏水性較高的區(qū)域估計(jì)趨向于堆積在蛋白質(zhì)內(nèi)部，疏水性較低的區(qū)域，趨向于構(gòu)成蛋白質(zhì)的外部.

圖3　黃粉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列各位點(diǎn)的疏水性

2.5黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖4　黃粉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列的二級(jí)機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)

從圖4可看出，在對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，β片層結(jié)構(gòu)（Strands，圖4中藍(lán)色曲線(xiàn)）占的比重明顯較高，并且，其概率值普遍較高，多數(shù)在8分以上；其次為紅色的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（Coils，圖4中紅色曲線(xiàn)），而出現(xiàn)頻率最小的是α螺旋結(jié)構(gòu)（Helices，圖4中黑色曲線(xiàn)）.

3　討論和結(jié)論

3.1討論

纖溶酶（plasmin）是一種能夠?qū)Ｒ唤到饫w維蛋白凝膠的蛋白水解酶，是纖溶系統(tǒng)中的一個(gè)重要組份.體內(nèi)凝血和纖溶兩系統(tǒng)是相互依存緊密相聯(lián)的.機(jī)體一旦產(chǎn)生凝血反應(yīng)，也幾乎同時(shí)激活了纖溶系統(tǒng)，使體內(nèi)多余的血栓移去，從而避免纖維蛋白的過(guò)多凝聚，從而引起血栓.本研究主要是通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因的相關(guān)信息.核酸序列分析是生命科學(xué)研究中的重要部分.利用生物信息學(xué)對(duì)核酸序列的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，可以充分利用現(xiàn)有的核酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的龐大資源，并能夠有效減少進(jìn)一步試驗(yàn)的盲目性.

對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因的研究雖然已有相關(guān)的生物信息學(xué)研究報(bào)道，但他們研究的重點(diǎn)在黃粉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并進(jìn)行了該酶作用機(jī)理的研究［3］，本研究重在分析黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因的密碼子使用情況、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等分析.

通過(guò)對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因密碼子使用情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因存在明顯的密碼子使用偏倚，其偏倚程度為天冬酰胺（N）的0%到谷氨酸（E）的100%.驢生長(zhǎng)激素基因密碼子編碼的偏倚程度為半胱氨酸（C）的20%到異亮氨酸（I）、組氨酸（H）和天冬酰胺（N）的100%［8］；驢另一個(gè)基因朊蛋白基因密碼子編碼的偏倚程度為苯丙氨酸（F）的0%到半胱氨酸（C）和天冬氨酸（D）的100%［9］.說(shuō)明基因密碼子使用偏倚不僅與物種有關(guān)，而且與基因也有關(guān)系.

黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因翻譯的氨基酸種類(lèi)中絲氨酸（Ser）的比例最高（17.05%，出現(xiàn)44次），其次為甘氨酸（Gly，13.56%，出現(xiàn)35次），這與余磊和韓雅莉［3］認(rèn)為該酶的活性中心是His、Ser和Asp三個(gè)氨基酸殘基，以及底物結(jié)合部位是Ser、Asp和Gly不謀而合.

3.2結(jié)論

黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因共包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，CDS區(qū)共編碼258個(gè)氨基酸.黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因的編碼存在明顯的密碼子使用偏好，其偏倚程度從天冬酰胺（N）的0%到谷氨酸（E）的100%.黃粉蟲(chóng)纖溶酶基因編碼的氨基酸以絲氨酸的比例最高，其次為甘氨酸，最低的為谷氨酸.黃粉蟲(chóng)纖溶酶的等電點(diǎn)為8.34，相對(duì)分子質(zhì)量為26KD.黃粉蟲(chóng)纖溶酶多肽鏈?zhǔn)且杂H水區(qū)和疏水區(qū)相互交錯(cuò)出現(xiàn)構(gòu)成的.黃粉蟲(chóng)纖溶酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式以β片層結(jié)構(gòu)為主，其次為無(wú)規(guī)卷曲，螺旋結(jié)構(gòu)所占比重較輕.

〔1〕黃明星.地鱉蟲(chóng)和黃粉蟲(chóng)纖溶活性蛋白的分離純化、性質(zhì)研究及其基因克隆［D］.廣州：廣東工業(yè)大學(xué)，2012.

〔2〕余磊，韓雅莉.地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)模擬與序列分析［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（5）:1185-88.

〔3〕余磊，韓雅莉.黃粉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)模擬與序列分析［J］.化學(xué)與生物工程，2013，30（9）:32-34，50.

〔4〕冼永權(quán)，譚竹鈞，韓雅莉.黑螞蟻纖溶活性蛋白的分離純化及其性質(zhì)研究［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（2）: 284-289.

〔5〕葉韻，韓雅莉，黃明星，等.黃粉蟲(chóng)胰蛋白酶樣酶基因TMTLSP全長(zhǎng)cDNA的克隆和序列分析［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012，28（2）:169-176.

〔6〕吳艷玲.黃粉蟲(chóng)纖溶活性蛋白的酶學(xué)性質(zhì)和抑癌作用研究［D］.廣州：廣東工業(yè)大學(xué)，2011.

〔7〕張冰.黃粉蟲(chóng)纖溶活性蛋白免疫原性與抗血栓作用的研究［D］.廣州：廣東工業(yè)大學(xué)，2014.

〔8〕陳建興，孫玉江，潘慶杰，等.驢生長(zhǎng)激素基因序列初步分析［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（7）:1751-1754.

〔9〕陳建興，王銀朝，張慶蛟，等.驢朊蛋白基因序列分析［J］.赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30（12）:14-16.

Q967

A

1673-260X（2016）07-0005-03

2016-03-24

馬曉東主持2014年赤峰學(xué)院實(shí)踐創(chuàng)新教育項(xiàng)目（1402382）