任玲，張光哲，邢承忠

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科肛腸外科，遼寧 沈陽(yáng)　110001)

?

芬太尼抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

任玲，張光哲，邢承忠

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科肛腸外科，遼寧 沈陽(yáng)110001)

目的通過(guò)選擇10 nmol·L-1芬太尼作用于鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HONE1，研究芬太尼對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HONE1，選擇10 nmol·L-1芬太尼分別作用于鼻咽癌細(xì)胞系30 min和1 h，Western blot檢測(cè)p-Src和Src表達(dá)，Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；構(gòu)建Src過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞系，觀察鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果10 nmol·L-1芬太尼處理鼻咽癌細(xì)胞CNE2和HONE1 48 h后，細(xì)胞呈現(xiàn)出類(lèi)間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化的形態(tài)特征，同時(shí)，與對(duì)照組相比，加入芬太尼處理組的鼻咽癌細(xì)胞其遷移能力顯著降低；應(yīng)用芬太尼分別處理鼻咽癌細(xì)胞30 min和1 h后，p-Src水平顯著下調(diào)；此外，與轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Src的細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，而在過(guò)表達(dá)Src的細(xì)胞中同時(shí)聯(lián)合芬太尼處理后，細(xì)胞的遷移能力沒(méi)有被抑制。結(jié)論芬太尼可能通過(guò)抑制Src通路活化抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

鼻咽腫瘤;芬太尼;src族激酶類(lèi);腫瘤侵潤(rùn);腫瘤轉(zhuǎn)移;藥理作用分子作用機(jī)制

鼻咽癌是我國(guó)南方和東南亞地區(qū)最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤。盡管診療技術(shù)不斷進(jìn)步，但仍有60%以上的鼻咽癌患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[1]。因此，明確鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找新的有效治療靶點(diǎn),抑制轉(zhuǎn)移發(fā)生,是目前鼻咽癌治療所面臨的巨大挑戰(zhàn)。芬太尼是一類(lèi)阿片受體激動(dòng)劑，屬?gòu)?qiáng)效麻醉鎮(zhèn)痛藥，廣泛應(yīng)用于晚期鼻咽癌疼痛的患者。有研究證實(shí)，芬太尼可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[2]，影響實(shí)體腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，但其具體機(jī)制尚不清楚。本文將采用10 nmol·L-1芬太尼劑量，作用于體外培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞系，探討其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株鼻咽癌CNE2、HONE1細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。兩種細(xì)胞均培養(yǎng)于RPMI1640完全培養(yǎng)基(含100 mL·L-1滅活胎牛血清、10 g·L-1青霉素-鏈霉素混合抗生素溶液)中，置于37 ℃、50 mL·L-1CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞常規(guī)每2～3 d傳代一次。

1.1.2主要試劑芬太尼注射液購(gòu)自湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；1640培養(yǎng)基和滅活胎牛血清購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)；青霉素、鏈霉素和胰酶均購(gòu)自美國(guó)西格瑪-奧爾德里希公司(Sigma Aldrich)；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司(Corning)； RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗p-Src和Src抗體購(gòu)自Cell Signaling 公司；抗GAPDH抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；ECL試劑盒購(gòu)自于PIERCE公司。

1.1.3質(zhì)粒和菌株pcDNA3.1(+)購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司；Src基因表達(dá)載體pcDNA3.1-Src質(zhì)粒委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建；大腸桿菌Top10菌株、Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司； RNAiso購(gòu)自日本Takara公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1質(zhì)粒抽提和轉(zhuǎn)染取過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌Top10菌株50 mL至菌瓶?jī)?nèi)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增提取(北京天根生化科技有限公司)。最后應(yīng)用紫外分光光度儀檢測(cè)濃度和純度。利用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-Src質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CNE2細(xì)胞，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。Western blot方法檢測(cè)Src激酶的表達(dá)情況。

1.2.2Western blot檢測(cè)蛋白變化收集細(xì)胞，4 ℃ PBS洗2～3次后加入RIPA細(xì)胞裂解液80～100 μL,冰上裂解30 min，之后高速離心(12 000 r·min-1)30 min，取上清。采用Lowry法進(jìn)行蛋白定量。將樣品與3×上樣緩沖液(北京索萊寶公司)混合后，煮沸5 min，于10%的SDS-聚丙烯凝膠中電泳，隨后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，采用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗p-Src、Src或GAPDH 4 ℃孵育過(guò)夜。1×TBST溶液(北京索萊寶公司)清洗4次，每次10 min，隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h，TBST清洗4次，每次10 min，ECL發(fā)光法顯色，采用GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)成像并分析處理。

1.2.3Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2和HONE1細(xì)胞，胰酶消化，采用無(wú)血清的RPIM1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至每毫升1×105個(gè)細(xì)胞；Transwell小室上室每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，加或不加芬太尼注射液(10 nmol·L-1)，下室中加入500 μL含2.5%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；第2天取出小室，用脫脂棉擦去小室內(nèi)殘留的液體和濾膜表面的細(xì)胞，清水清洗側(cè)壁2次，37 ℃風(fēng)干20 min，結(jié)晶紫染色2 h，清水沖洗，風(fēng)干；切下小室底膜，底面向上置于載玻片上，蓋玻片覆蓋固定，顯微鏡下觀察遷移的細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)3次取均值。

2　結(jié)果

2.1芬太尼注射液誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)改變10 nmol·L-1芬太尼處理鼻咽癌細(xì)胞CNE2和HONE1 48 h后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。如圖1所示，連接松散、多角形的類(lèi)間質(zhì)化的鼻咽癌細(xì)胞在經(jīng)芬太尼處理48 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬?duì)致密且呈島狀生長(zhǎng)的類(lèi)上皮型細(xì)胞，并且部分細(xì)胞的偽足消失。

注：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HONE1，10 nmol·L-1芬太尼處理48 h后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

圖1芬太尼誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)改變

2.2芬太尼注射液抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力Transwell法檢測(cè)CNE2和HONE1細(xì)胞體外遷移能力。如圖2所示，與對(duì)照組相比，加入芬太尼處理組的鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力顯著降低。

2.3芬太尼注射液抑制鼻咽癌細(xì)胞Src通路的激活與對(duì)照組相比，鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HONE1在經(jīng)芬太尼注射液分別處理30 min和1 h后，p-Src水平顯著下調(diào)(圖3)。結(jié)果提示，芬太尼注射液可能抑制了鼻咽癌細(xì)胞系中Src通路的內(nèi)在活化，從而抑制了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

注：鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HONE1，加或不加芬太尼10 nmol·L-1處理過(guò)夜，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。與對(duì)照組相比較，*P<0.05。

圖2芬太尼抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力

注：鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HONE1，加或不加芬太尼10 nmol·L-1分別處理30 min和1 h，Western blot檢測(cè)Src和p-Src的表達(dá)情況。

圖3芬太尼抑制鼻咽癌細(xì)胞Src通路的活化

2.4過(guò)表達(dá)Src激酶可以抵消芬太尼對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系遷移能力的抑制經(jīng)構(gòu)建Src過(guò)表達(dá)的pcDNA3.0-Src質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞系CNE2，再通過(guò)Transwell小室檢測(cè)芬太尼處理或不處理的CNE2細(xì)胞系的遷移能力。結(jié)果如圖4所示，Src過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，Src通路激活；與轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Src的CNE2-pcDNA3.0(+)細(xì)胞系的遷移能力明顯增強(qiáng)；而在過(guò)表達(dá)Src的細(xì)胞中同時(shí)聯(lián)合芬太尼處理后，較轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的對(duì)照組相比，CNE2-pcDNA3.0(+)細(xì)胞的遷移能力并沒(méi)有被明顯抑制。以上結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)Src激酶可以抵消芬太尼對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系遷移能力的抑制。

注：A.構(gòu)建Src過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞系CNE2，Western blot檢測(cè)Src和p-Src的表達(dá)水平；B.構(gòu)建Src過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞系CNE2，Transwell小室檢測(cè)芬太尼處理或不處理CNE2細(xì)胞后遷移能力的變化。 轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒組，處理芬太尼后與對(duì)照組相比較，*P<0.05；轉(zhuǎn)染Src過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒組相比較，**P<0.05；轉(zhuǎn)染Src過(guò)表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合芬太尼處理組對(duì)比單純轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒組，***P<0.05。

圖4過(guò)表達(dá)Src激酶逆轉(zhuǎn)芬太尼對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系遷移能力的抑制

3　討論

芬太尼同嗎啡類(lèi)似，均是強(qiáng)效的μ受體激動(dòng)劑，是臨床常用的麻醉性鎮(zhèn)痛藥，適用于創(chuàng)傷性、手術(shù)后以及癌性疼痛等。除了強(qiáng)效鎮(zhèn)痛外，近年來(lái)諸多的腫瘤基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼相關(guān)的阿片類(lèi)藥物具有較強(qiáng)抗腫瘤作用，其抗腫瘤機(jī)制主要?dú)w納為以下兩個(gè)方面：首先是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。有研究報(bào)道[2]，芬太尼可抑制胃癌MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并改變E2F-1、p53基因的表達(dá)。此外，嗎啡可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[3-5]，并能抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[6]；其次，芬太尼類(lèi)藥物可以通過(guò)影響細(xì)胞因子的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼可以抑制大鼠腦缺血再灌注中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)，啟動(dòng)機(jī)體的免疫調(diào)控機(jī)制，從而發(fā)揮抗腫瘤機(jī)制[7-8]。除了周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡機(jī)制外，芬太尼可以通過(guò)抑制實(shí)體腫瘤細(xì)胞遷移能力從而發(fā)揮抗腫瘤功能，但芬太尼抑制腫瘤細(xì)胞遷移的具體分子機(jī)制仍不明確。本文首次在人類(lèi)鼻咽癌細(xì)胞系中證實(shí)了芬太尼可以抑制腫瘤細(xì)胞遷移，并對(duì)其分子機(jī)制做了深入探討。

Src是一類(lèi)癌基因，屬于非受體蛋白酪氨酸激酶家族成員之一，主要以兩種形式存在：病毒癌基因表達(dá)蛋白v-Src和細(xì)胞癌基因表達(dá)蛋白c-Src。c-Src蛋白的表達(dá)和活性異常參與了很多惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及耐藥等過(guò)程[9-13]。c-Src的抑制劑達(dá)沙替尼能在體外明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞通路的活性和FAK蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，具有高遷移能力的鼻咽癌細(xì)胞CNE2和HONE1都具有c-Src激酶的自身活化；芬太尼注射液處理后的鼻咽癌細(xì)胞其遷移能力顯著下降；同時(shí)，處理過(guò)芬太尼的兩種鼻咽癌細(xì)胞其c-Src通路被明顯抑制；而過(guò)表達(dá)c-Src的鼻咽癌細(xì)胞系可以抵消芬太尼對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的抑制作用。以上結(jié)果提示，c-Src激酶的自身活化是導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞遷移的關(guān)鍵因子，而芬太尼可以通過(guò)抑制c-Src通路活化降低鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了芬太尼可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力，并證實(shí)了c-Src激酶是參與芬太尼抑制鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控基因。這些結(jié)果為明確阿片類(lèi)藥物抑制鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。然而，阿片類(lèi)藥物與腫瘤的關(guān)系相對(duì)復(fù)雜，其如何在鎮(zhèn)痛作用以外發(fā)揮抗腫瘤功能的機(jī)制仍需要深入研究。因此，加深對(duì)癌性鎮(zhèn)痛藥物的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制研究，可以為惡性腫瘤的臨床治療提供新的思路和方向。

[1]Wu S,Xia B,Han F,et al.Prognostic nomogram for patients with nasopharyngeal carcinoma after intensity-modulated radiotherapy[J].PLoS One,2015，10(8):e0134491.

[2]廖淳杰,覃怡,唐小曼,等.芬太尼對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞E2F-1、p53基因表達(dá)的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2012,28(1):63-64.

[3]Singleton PA,Moss J.Effect of perioperative opioids on cancer recurrence:a hypothesis[J].Future Oncol,2010,6(8):1237-1242.

[4]Gach K,Szemraj J,Wyrebska A,et al.The influence of opioids on matrix metalloproteinase-2 and -9 secretion and mRNA levels in MCF-7 breast cancer lines[J].Mol Biol Rep,2011,38(2):1231-1236.

[5]覃怡,利莉,林育南,等.嗎啡對(duì)胃癌細(xì)胞 Survivin 和Caspase-9 表達(dá)的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,28(10):1705-1706.

[6]管恩健,覃怡,利莉,等.嗎啡和芬太尼對(duì)人胃癌 MGC-803 細(xì)胞遷移能力的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2012,29(11):2178-2179.

[7]Oh WS.Effect of fentanyl on TNF-alpha and IL-1beta levels during global ischemia/reperfusion in rats[J].Int J Tissue React,2002,24(1):11-21.

[8]Narahara H,Kadoi Y,Hinohara H,et al.Comparative effects of flurbiprofen and fentanyl on natural killer cell cytotoxicity,lymphocyte subsets and cytokine concentrations in post-surgical intensive care unit patients:prospective,randomized study[J].J Anesth,2013,27(5):676-683.

[9]Yang Y,Bai ZG,Yin J,et al.Role of c-Src activity in the regulation of gastric cancer cell migration[J].Oncol Rep,2014,32(1):45-49.

[10] Kim WG,Guigon CJ,Fozzatti L,et al.SKI-606,a Src inhibitor,reduces tumor growth,invasion,and distant metastasis in a mouse model of thyroid cancer[J].Clin Cancer Res,2012,18(5):1281-1290.

[11] Xu L,Qu X,Li H,et al.Src/caveolin-1-regulated EGFR activation antagonizes TRAIL-induced apoptosis in gastric cancer cells[J].Oncol Rep,2014,32(1):318-324.

[12] Lee M,Choy WC,Abid MR.Direct sensing of endothelial oxidants by vascular endothelial growth factor receptor-2 and c-Src[J].PLoS One,2011,6(12):e28454.

[13] Samarakoon R,Chitnis SS,Higgins SP,et al.Redox-induced Src kinase and caveolin-1 signaling in TGF-β1-initiated SMAD2/3 activation and PAI-1 expression[J].PLoS One,2011,6(7):e22896.

Mechanism of fentanyl inhibiting invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma cells

REN Ling,ZHANG Guangzhe,XING Chengzhong

(DepartmentofAnusAndintestineSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversiry,Shenyang,Liaoning110001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of fentanyl on nasopharyngeal carcinoma cells(NPC) metastasis by treating NPClines CNE2 and HONE1 with fentanyl (10 nmol·L-1) in this study.MethodsNasopharyngeal carcinoma cells (CNE2 and HONE1) in logarithmic growth phase were pretreated with fentanyl (10 nmol·L-1) for 30 min and 1 hour.Western blot was used to test the expression levels of p-Src and Src and Transwell test was used to evaluate cell metastatoc ability.Src over-expression plasmid was constructed and transfected into NPC cell lines and NPC cellular morphology and metastatic ability were observed.ResultsNPC cell lines (CNE2 and HONE1) exhibited mesenchymal-to-epithelial like transformation;furthermore,the metastatic ability of NPC cells decreased obviously compared with control group 48 hours after fentanyl treatment.The p-Src expression level was down-regulated after fentanyl treatment for 30 min and 1 hour.However,over-expressive Src enhanced the metastatic ability of NPC cells obviously,and in combination with fentanyl treatmentover-expressive Src plasmid transfection did not inhibit the metastatic ability of NPC cells.ConclusionsFentanyl may inhibit nasopharyngeal carcinoma cells by inhibiting Src pathway invasion and metastasis.

Nasopharyngeal neoplasms;Fentanyl;Src-family kinases;Neoplasm invasiveness;Neoplasm metastasis;Molecular mechanisms of pharmacological action

邢承忠，男，教授,博士生導(dǎo)師，研究方向：胃腸惡性腫瘤的發(fā)病與治療，E-mail:174012200@qq.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.051

2016-05-16，

2016-06-15)