曹燁君，丁選勝

(1.常州市第四人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室,江蘇 常州　213001；2.中國(guó)藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室,江蘇 南京　 210009)

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葛根素注射液對(duì)糖尿病家兔溶血作用研究

曹燁君1，丁選勝2

(1.常州市第四人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室,江蘇 常州213001；2.中國(guó)藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室,江蘇 南京 210009)

目的研究葛根素注射液在正常和糖尿病家兔體內(nèi)給藥后的溶血規(guī)律，為臨床安全合理用藥提供依據(jù)。方法采用四氧嘧啶復(fù)制1型糖尿病家兔模型，并與正常健康家兔進(jìn)行對(duì)照，設(shè)置10、20、40 mg·kg-1體質(zhì)量三個(gè)劑量組，每周期給藥10 d，在給藥前以及每個(gè)給藥周期的第2、4、6、8、10天分別采血，觀察紅細(xì)胞形態(tài)并比較體外溶血差異。結(jié)果正常家兔和糖尿病家兔紅細(xì)胞在給藥后的溶血率較之給藥前均有升高，糖尿病組的溶血率高于正常組，在給藥后6～8 d溶血率升至最高。溶血率與給藥劑量和給藥時(shí)間成正相關(guān)。結(jié)論臨床使用葛根素注射液，給藥時(shí)間應(yīng)控制在8 d以內(nèi)，若需長(zhǎng)時(shí)間用藥，需要在每個(gè)用藥周期后間隔4～5 d的清洗期，以保證用藥安全性，避免發(fā)生溶血反應(yīng)。

葛根素/副作用;溶血;糖尿病,實(shí)驗(yàn)性;兔

葛根素注射液是臨床常用藥物之一，臨床上也發(fā)現(xiàn)其存在諸多不良反應(yīng)，其中比較嚴(yán)重的是溶血性反應(yīng)[1-4]，往往會(huì)導(dǎo)致患者死亡等嚴(yán)重后果。目前，針對(duì)藥物溶血反應(yīng)，主要采用健康正常動(dòng)物紅細(xì)胞體外溶血進(jìn)行評(píng)價(jià)，少見采用病理狀態(tài)下動(dòng)物體內(nèi)給藥，研究藥物溶血反應(yīng)。糖尿病及其并發(fā)癥作為葛根素注射液的主要適應(yīng)證之一，其主要患病人群為中老年人，正是葛根素注射液不良反應(yīng)發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)人群。在糖尿病病程中，紅細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列的病理改變，如紅細(xì)胞內(nèi)黏度增加，聚集性增強(qiáng)，最終血液黏度增高，流動(dòng)性降低，紅細(xì)胞變形能力下降。同時(shí)糖尿病患者的紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞形態(tài)和功能的損傷，可能會(huì)增加溶血發(fā)生的概率。在糖尿病患者中，尚缺乏藥源性溶血研究。糖尿病作為一種全身性質(zhì)的疾病，在進(jìn)展過程中對(duì)于各個(gè)系統(tǒng)及器官都有顯著的影響。因此，選用糖尿病動(dòng)物模型[5]來觀察葛根素注射液給藥后溶血反應(yīng)更符合臨床實(shí)際,可以更全面地分析葛根素對(duì)于紅細(xì)胞的作用[6]。本課題就葛根素注射液在正常和糖尿病家兔體內(nèi)給藥后的溶血規(guī)律加以研究，為臨床安全合理用藥提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)方法[7-10]

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品健康家兔36只，普通級(jí)，雌雄各半，由江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2013-0008。葛根素注射液：青島金峰制藥有限公司，規(guī)格：200 mg/4 mL,批號(hào)130810。

1.2糖尿病家兔模型復(fù)制用氯化鈉注射液配置5%四氧嘧啶溶液，家兔禁食12 h后按照130 mg·kg-1一次性耳緣靜脈注射四氧嘧啶溶液，注射后立即喂食并補(bǔ)充葡萄糖溶液，防止低血糖的發(fā)生。72 h后測(cè)定空腹血糖，2次血糖值>16.7 mmol·L-1時(shí)認(rèn)為糖尿病模型建立。

1.3家兔給藥方法正常及糖尿病家兔各分為3個(gè)劑量組，每組6只，經(jīng)耳緣靜脈，每日根據(jù)體質(zhì)量按照10、20、40 mg·kg-1分為低、中、高劑量組給藥。正常及糖尿病組家兔均分為1個(gè)給藥周期，每周期10 d。給藥前及每周期第2、4、6、8、10天給藥后24 h采血。

1.4采血及血樣處理家兔耳中動(dòng)脈采血4 mL，新鮮血液加入肝素(0.5 g·L-1血液)抗凝。抗凝血3 000 r·min-1離心10 min，取上層清液即為血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆?；下層紅細(xì)胞用8～10倍生理鹽水洗滌2～3次，1 500 r·min-1離心15 min，至上層清液無色透明，離心后棄上層液，按所得紅細(xì)胞體積加入生理鹽水配置5%紅細(xì)胞懸液，搖勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5家兔紅細(xì)胞與葛根素注射液體外溶血實(shí)驗(yàn)取玻璃試管10支，編號(hào)，按照表1所示加樣，其中1～8號(hào)管為樣品管，9號(hào)為陰性對(duì)照管，10號(hào)為陽性對(duì)照管。各管依次加入葛根素注射液、0.9%生理鹽水或蒸餾水，最后加入5%紅細(xì)胞懸液，試管內(nèi)葛根素終濃度為0.4、0.8、2、4、6、8、10、12 g·L-1。各試管搖勻后于37 ℃孵育3、6 h，孵育結(jié)束后1 500 r·min-1離心15 min，于545 nm處，1 cm光徑測(cè)吸光度，并按照以下公式計(jì)算溶血率：溶血率(%)=(OD待測(cè)-OD陰性)/(OD陽性-OD陰性)×100%。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1低劑量葛根素注射液給藥后家兔體外溶血規(guī)律

2.1.1正常家兔低劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規(guī)律正常家兔紅細(xì)胞與不同濃度葛根素注射液體外孵育后溶血率結(jié)果顯示，在葛根素終濃度為0.4～4 g·L-1的范圍內(nèi)，隨著葛根素濃度升高溶血率逐漸增大；而在葛根素終濃度為4～12 g·L-1范圍內(nèi)，隨著葛根素濃度升高溶血率有所下降。在給藥周期中，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度點(diǎn)的溶血率較之未給藥組均有所升高，在給藥第6天溶血率達(dá)到最大值。體外孵育3 h時(shí)，給藥6 d的溶血率在葛根素終濃度為0.4、0.8、6、8、10、12 g·L-1的溶血率與未給藥及給藥4 d相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外孵育6 h，給藥6 d時(shí)紅細(xì)胞的體外溶血率高于其他天數(shù)給藥組，與未給藥組在葛根素終濃度為2、6、8、10、12 g·L-1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢娫诮o藥6 d時(shí)，溶血率較之其他時(shí)間有明顯增高,見表2，3。

2.1.2糖尿病家兔低劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規(guī)律糖尿病組家兔紅細(xì)胞與不同濃度葛根素注射液體外孵育后溶血率結(jié)果顯示，在葛根素終濃度為0.4～4 g·L-1范圍，溶血率逐漸升高；在葛根素終濃度為4～12 g·L-1范圍內(nèi)，溶血率先下降后略升高。低劑量葛根素注射液給藥后，糖尿病家兔紅細(xì)胞體外溶血率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)及濃度點(diǎn)較正常家兔有所升高，但大部分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在給藥第4天時(shí)，各濃度點(diǎn)的溶血率較其他天數(shù)有所增大，在給藥4 d后溶血率較之前略降低。孵育6 h的溶血率高于孵育3 h，溶血率隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)而升高，第4天達(dá)到最大值，之后逐漸降低。體外孵育6 h的溶血曲線與3 h相比略有不同，在給藥第6天和第8天時(shí)，葛根素終濃度為8 g·L-1的溶血率略升高。見表4，5。

表1　葛根素注射液體外溶血實(shí)驗(yàn)加樣表/mL

表2　低劑量組不同給藥時(shí)間正常家兔紅細(xì)胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表3　低劑量組不同給藥時(shí)間正常家兔紅細(xì)胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表4　低劑量組不同給藥時(shí)間糖尿病家兔紅細(xì)胞孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05。

2.2中劑量葛根素注射液給藥后家兔體外溶血規(guī)律

2.2.1正常家兔中劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規(guī)律中劑量葛根素注射液給藥后，正常家兔紅細(xì)胞與不同濃度葛根素體外孵育后，溶血率高于低劑量組給藥的溶血率。隨著給藥天數(shù)的延長(zhǎng)，紅細(xì)胞體外孵育3 h的溶血率逐漸升高，在給藥第8天時(shí)達(dá)到最大值，而后略有下降。孵育6 h的溶血率在第2天和第4天時(shí)有所增高，后逐漸下降，但仍高于未給藥組。在孵育6 h時(shí)，第4天和第6天溶血曲線的最高點(diǎn)出現(xiàn)在2 g·L-1的葛根素終濃度點(diǎn)上，曲線的走勢(shì)略有不同。 見表6,7。

表5　低劑量組不同給藥時(shí)間糖尿病家兔紅細(xì)胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表6　中劑量組不同給藥時(shí)間正常家兔紅細(xì)胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表7　中劑量組不同給藥時(shí)間正常家兔紅細(xì)胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

2.2.2糖尿病家兔中劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規(guī)律糖尿病家兔紅細(xì)胞體外溶血率在葛根素終濃度為0.4～4 g·L-1范圍內(nèi)隨濃度升高而增大；而在4～12 g·L-1濃度范圍內(nèi)，溶血率先逐漸降低而后又略微升高。在中劑量葛根素注射液給藥后，糖尿病家兔紅細(xì)胞體外孵育3 h溶血率隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，給藥6 d后達(dá)到最大值，之后略微下降，但仍高于給藥前。體外孵育6 h溶血率高于孵育3 h組，且隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)溶血率升高，在第6天達(dá)到最大值，之后略微下降。見表8,9。

2.3高劑量葛根素注射液給藥后家兔體外溶血規(guī)律

2.3.1正常家兔高劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規(guī)律正常家兔紅細(xì)胞與不同濃度葛根素注射液體外孵育3 h，在葛根素終濃度為0.4～4 g·L-1范圍內(nèi)，隨葛根素濃度升高溶血率逐漸增大；而在葛根素終濃度為4～12 g·L-1范圍內(nèi)，溶血率隨濃度升高而降低。體外孵育6 h，溶血曲線與3 h相比略有不同，在葛根素終濃度為0.4～2 g·L-1范圍內(nèi)，溶血率隨葛根素濃度升高而增大；而在葛根素終濃度為2～12 g·L-1范圍內(nèi)，溶血率隨濃度升高而降低。高劑量葛根素注射液給藥1周期后，體外孵育3 h各濃度點(diǎn)溶血率隨著給藥天數(shù)延長(zhǎng)而升高，在第6天達(dá)到最大值，隨后略有下降。體外孵育6 h的溶血率較之孵育3 h有明顯升高，給藥后溶血率隨給藥天數(shù)延長(zhǎng)而升高，同樣在第6天達(dá)到最大值，隨后有所降低。低濃度范圍內(nèi)，體外孵育6 h各時(shí)間點(diǎn)的溶血率與未給藥時(shí)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表10,11。

2.3.2糖尿病家兔高劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規(guī)律糖尿病家兔紅細(xì)胞體外溶血率整體高于正常家兔紅細(xì)胞。在高劑量葛根素注射液第1給藥周期，家兔紅細(xì)胞體外孵育3 h各濃度點(diǎn)的溶血率隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，給藥第8天達(dá)到最大值，之后略有降低。

糖尿病家兔紅細(xì)胞體外孵育6 h，溶血率在葛根素終濃度為4 g·L-1達(dá)到最大值，各濃度點(diǎn)的溶血率同樣隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在第6天時(shí)達(dá)到最大值，之后略有降低。給藥早期，高濃度葛根素(6～12 g·L-1)的溶血率較之正常高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表12,13。

表8　中劑量組不同給藥時(shí)間糖尿病家兔紅細(xì)胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05。

表9　中劑量不同給藥時(shí)間糖尿病家兔紅細(xì)胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05。

表10　高劑量組不同給藥時(shí)間正常家兔紅細(xì)胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表11　高劑量組不同給藥時(shí)間正常家兔紅細(xì)胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表12　高劑量組不同給藥時(shí)間糖病家兔紅細(xì)胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05。

3　討論

家兔靜脈注射給予葛根素注射液后，會(huì)在一定程度上引起紅細(xì)胞的損傷，主要表現(xiàn)為家兔紅細(xì)胞體外溶血實(shí)驗(yàn)中溶血率的增大，以及紅細(xì)胞形態(tài)的變化(出現(xiàn)皺縮、破裂、大小不均一)。不同劑量葛根素注射液都會(huì)引起家兔紅細(xì)胞體外溶血率的增大，且增大的趨勢(shì)與劑量成正相關(guān)性。同時(shí)，溶血率的變化與給藥天數(shù)相關(guān)，在給藥6～8 d后，溶血率出現(xiàn)峰值，隨后緩慢恢復(fù)。有研究結(jié)果表明，葛根素注射液體內(nèi)給藥后，會(huì)導(dǎo)致免疫性溶血的發(fā)生，在連續(xù)給藥的過程中，體內(nèi)的抗體逐漸累積，在給藥第8天時(shí)呈現(xiàn)最大值。葛根素作為小分子的半抗原，在進(jìn)入體內(nèi)后與體內(nèi)的大分子結(jié)合形成抗原，進(jìn)而結(jié)合在紅細(xì)胞表面上，形成免疫復(fù)合物，改變紅細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，致使紅細(xì)胞更易發(fā)生破裂。

表13　高劑量組不同給藥時(shí)間糖尿病家兔紅細(xì)胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

糖尿病家兔紅細(xì)胞體外溶血率較之正常家兔有所升高，在葛根素注射液給藥后溶血率的變化趨勢(shì)與正常家兔類似。由于糖尿病家兔的紅細(xì)胞在體內(nèi)高糖環(huán)境下變形指數(shù)下降，紅細(xì)胞的剛性指數(shù)上升，血液流變學(xué)指標(biāo)增大，紅細(xì)胞膜上膜蛋白表達(dá)改變，脂質(zhì)過氧化，膽固醇/磷脂比例的改變，同時(shí)還伴隨有Na+/K+-ATPase的活性改變[11-12]，這些因素都影響著紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能。因此，糖尿病家兔的紅細(xì)胞較之正常家兔紅細(xì)胞對(duì)于藥物作用更加敏感，直接表現(xiàn)為體外溶血率的升高。同時(shí)，葛根素在糖尿病家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)較之正常家兔有顯著的變化，藥物清除速率降低，在體內(nèi)蓄積的藥物濃度增大，體內(nèi)紅細(xì)胞處在一個(gè)相對(duì)較高的葛根素濃度中，葛根素對(duì)其的作用更加顯著，紅細(xì)胞的損傷疊加，體外溶血率升高。

由于臨床用藥中患者處于病理狀態(tài)，紅細(xì)胞的各項(xiàng)功能都有所改變，采用糖尿病模型動(dòng)物紅細(xì)胞研究葛根素注射液的體外溶血作用更加符合臨床實(shí)際。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在糖尿病狀態(tài)下，紅細(xì)胞的體外溶血率較之正常狀態(tài)有顯著升高，但整體的溶血率變化趨勢(shì)與正常家兔相同。在糖尿病狀態(tài)下，紅細(xì)胞的剛性指數(shù)、變形能力以及紅細(xì)胞脆性等指標(biāo)較之正常狀態(tài)有了顯著的變化，導(dǎo)致紅細(xì)胞在藥物作用下更容易破裂，導(dǎo)致溶血反應(yīng)。

綜上所述，在臨床用藥過程中，要注意在給藥6～8 d后患者的基本狀況，若出現(xiàn)肌肉酸痛、腰痛、尿潛血等狀況時(shí)，應(yīng)考慮葛根素導(dǎo)致溶血的可能。同時(shí)應(yīng)注意藥物的用量，在藥品說明書規(guī)定范圍內(nèi)合理用藥。若需長(zhǎng)時(shí)間用藥，要分周期給藥，每個(gè)給藥周期間間隔4～5 d作為清洗期，避免長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)用藥導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)發(fā)生。

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Hemolytic effect of puerarin injection on normal and diabetic rabbits

CAO Yejun1,DING Xuansheng2

(1.No.4HospitalofChangzhou,Changzhou,Jiangsu213001,China;2.DepartmentofClinicalPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu210009,China)

ObjectiveTo study the rule of puerarin injection hemolysis on normal and diabetic rabbits,and provide evidence for clinical rational administration of drug.MethodsThis study established type 1 diabetic rabbits model by alloxan,comparing to healthy rabbits.The dosages of treatment were 10,20,40 mg·kg-1,respectively.The treatment of healthy and diabetic rabbits was divided into 2 periods.Every period had 10 days.Before and during the treatment blood was collected for observation of red cell morphology and comparison of in vitro hemolysis.ResultsThe study showed that after treatment,the hemolysis rate increased in healthy and diabetic rabbits.In 6～8 d,the hemolysis rate reached highest in diabetic rabbits,which was higher than healthy rabbits.The hemolysis rate had a positive correlation with dosage and time.ConclusionsIn clinical practice,the treatment should be controlled within 8 days.If the patients need a long time of treatment,it must be divided into several periods,which has 4 to 5 days as an interval.That would ensure drug safety and avoid hemolytic reaction.

Puerarin/adverse effects;Hemolysis;Diabetes mellitus,experimental;Rabbits

國(guó)家自然科學(xué)基金(81073145)

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.004

2016-03-08，

2016-06-15)