鄧耀，楊立亭，廖國(guó)周*（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明650201）

?

葡萄籽提取物中原花青素含量測(cè)定

鄧耀，楊立亭，廖國(guó)周*
（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明650201）

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合葡萄籽提取物的實(shí)際情況， 并參照國(guó)內(nèi)外最新的檢測(cè)分析方法， 建立了用HPLC對(duì)原花青素的含量進(jìn)行定性定量分析的檢測(cè)方法。方法：采用A流動(dòng)相乙腈，B流動(dòng)相2%乙酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，A從0到30%，進(jìn)樣量10μL，流速0.5ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。結(jié)果：尖峰葡萄籽提取物中各單體的含量沒(méi)食子酸為0.939mg/g，兒茶素為73.496mg/g，表兒茶素為17.071mg/g，表兒茶素沒(méi)食子酸酯為3.106mg/g，精確度RSD=2.9%，回收率為96%-109%，此法具有準(zhǔn)確、靈敏、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，該法必須具備所有被測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)品才能定性定量。

HPLC；葡萄籽提取物；原花青素

多酚類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，在苯環(huán)不同部位有羥基取代。葡萄中含有的豐富多酚類(lèi)物質(zhì)是葡萄重要的次生代謝產(chǎn)物。葡萄的各個(gè)部位都含有不同程度的多酚類(lèi)物質(zhì)。隨著研究的不斷深入，國(guó)內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)，葡萄籽里的多酚類(lèi)物質(zhì)不論是含量還是種類(lèi)都比其他部位豐富得多。

葡萄籽提取物（Grape Seed Extract）是從釀酒葡萄的種子中提取出來(lái)的一種多酚物質(zhì)混合物，其中的原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化性，是一種極強(qiáng)的體內(nèi)活性功能因子。其產(chǎn)品最基本的用途是做抗氧化劑，用來(lái)清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基，從而起到保健和防病的作用。近期的一些研究表明葡萄籽提取物中原花青素在一定條件下能夠抑制燒烤羊肉中雜環(huán)胺［1］的形成，具體機(jī)理還在研究中。葡萄籽提取物中的原花青素主要由沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯等這些種單體組成。原花青素是具有不同聚合度的一類(lèi)多酚物質(zhì)，聚合度不同，分子極性不一樣，用流動(dòng)相洗脫出現(xiàn)峰的時(shí)間也不一樣，根據(jù)此原理可以把具有相同極性的物質(zhì)通過(guò)HPLC分離開(kāi)來(lái)，葡萄籽提取物中所有的物質(zhì)在進(jìn)行HPLC分析的時(shí)候都有出峰，本次試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定峰面積和校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定各單體的含量。

1 、材料與方法

1.1 材料

葡萄籽提取物：天津尖峰生物科技研究公司。

1.2 儀器

安捷倫1200液相色譜儀器，色譜柱：Nova-Pak C-18，4.6×150mm，5μm，離心機(jī)，Amberlite XAD-16柱。

1.3 試劑

乙腈：色譜純（美國(guó)天地公司）乙酸：色譜純（美國(guó)天地公司），超純水，無(wú)水乙醇，甲醇，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司，純度99%；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司， 純度99%，表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品： sigma公司，純度99%；表兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品： sigma 公司，純度99%。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品配制

葡萄籽提取物以70%乙醇在60℃下提取2次，合并提取液，提取液減壓濃縮后以6000r/min，離心40min得上清液，上清液通過(guò)Amberlite XAD-16柱進(jìn)行分離，以不同配比的乙醇-水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液通過(guò)HPLC-DAD在線監(jiān)測(cè)，收集性質(zhì)相同的餾分。本試驗(yàn)中主要針對(duì)葡萄籽提取物中沒(méi)食子酸，（+）兒茶素，（-）表兒茶素，表兒茶素沒(méi)食子酸酯主要化學(xué)成分進(jìn)行分析和含量測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)品配制：精確稱取沒(méi)食子酸22mg，兒茶素12mg，表兒茶素沒(méi)食子酸酯12mg，表兒茶素10mg，放入250ml的容量瓶，先加入150ml甲醇超聲溶解10min，用超純水定容。按1：2，1：4，1：8，1：16，1：32配制濃度梯度備用。

1.4.2 流動(dòng)相條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，流速：0.5ml/min，進(jìn)樣量：10μL，柱溫：30℃，流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：2%乙酸水溶液，色譜柱型號(hào)：Nova-Pak C18，150×4.6mm，5μm，洗脫梯度條件如表1。

表1 洗脫梯度Table1 The elution gradient

得到的結(jié)果可用如下公式計(jì)算單體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：?jiǎn)误w質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）= （c×d×v）/w×100%。其中c表示濃度（mg/mL），d表示稀釋的倍數(shù)，v表示體積（mL），w表示質(zhì)量（mg）。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取沒(méi)食子酸22mg，兒茶素12mg，表兒茶素沒(méi)食子酸酯12mg，表兒茶素10mg，放入250ml的容量瓶，先加入150ml甲醇超聲溶解10min，用超純水定容，配制成不同濃度梯度，通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果以峰面積為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定及回歸方程

對(duì)四種單體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜，如圖一所示

圖1 四種標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of four standards

1.沒(méi)食子酸 2.兒茶素 3.表兒茶素 4.表兒茶素沒(méi)食子酸酯

從圖1看，根據(jù)單標(biāo)對(duì)比可知從左往右依次是溶劑峰，沒(méi)食子酸，兒茶素，表兒茶素，表兒茶素沒(méi)食子酸，保留時(shí)間分別為7.351，17.750，23.646，34.766. 以濃度c對(duì)峰面積A進(jìn)行回歸，所得4種單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1，4種單體在1μg-22μg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 回歸方程Table2 The regression equation

2.2 方法的精密度和回收率試驗(yàn)

2.2.1 精密度試驗(yàn)：取配制的樣品10μL連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分結(jié)果RSD.得RSD=2.9

2.2.2 回收率試驗(yàn)：分別稱取2份樣品各100mg放入10ml容量瓶，用甲醇溶解，向其中一瓶?jī)?nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品1mg，分別測(cè)定樣品的含量并計(jì)算回收率，重復(fù)5次，得到的回收率為96%-109%。

2.3 葡萄籽中各單體種類(lèi)及含量

圖2 GES液相色譜圖Figure 2 HPLC of GSE

圖1與圖2分別是標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的液相色譜圖，由圖1可知該方法可以準(zhǔn)確地分離和檢測(cè)原花青素中的幾種單體，且各組分峰尖銳、峰形對(duì)稱，40min左右原花青素可被全部洗脫。由圖2可知在與標(biāo)準(zhǔn)品相同的保留時(shí)間能均出現(xiàn)峰，分別對(duì)照1、沒(méi)食子酸2、兒茶素 3、表兒茶素4、表兒茶素沒(méi)食子酸酯。由圖2可知，在保留時(shí)間40分鐘后比較平穩(wěn)，無(wú)峰出現(xiàn)，取保留時(shí)間0-40min內(nèi)出現(xiàn)的峰圖表示該圖的結(jié)果是可靠的。

由圖1，圖2和表1可得到葡萄籽提取物中各單體的含量，沒(méi)食子酸為0.939mg/g，兒茶素為73.496mg/g，表兒茶素為17.071mg/g，表兒茶素沒(méi)食子酸酯為3.106mg/g。從圖2可以看出，葡萄籽提取物中多酚含量豐富，原花青素含量占總多酚含量的9.46%，與采用其他方法得出的結(jié)果相符合，樣品提取工藝和GSE的品種不同也會(huì)導(dǎo)致最后的結(jié)果有差異。

3 、結(jié)論與討論

原花青素的測(cè)定有很多種方法，其中鐵鹽催化比色法［6］次方法簡(jiǎn)便適用，對(duì)原花青素的選擇性反應(yīng)較好，主要適用于批量樣品的檢測(cè)；香草醛法［7］，采用香草醛法時(shí)，一般以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)物，以甲醇為溶解劑；紫外分光光度法［8］，此方法雖然方便簡(jiǎn)單，但只適用于原花青素含量純度特別高的產(chǎn)品。李奕［9］采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離并測(cè)定了10余種葡萄籽中的主要4個(gè)兒茶素類(lèi)化合物：兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯；此外還有鉬酸銨分光光度法［10，11］，流動(dòng)注射-抑制化學(xué)發(fā)光法，F(xiàn)olin-Ciocalteu法等方法，其中Folin-Ciocalteu法主要測(cè)定總多酚的含量。

研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽多酚類(lèi)物質(zhì)無(wú)論是含量還是種類(lèi)都比葡萄皮和果肉豐富得多，并且這些多酚物質(zhì)有著極強(qiáng)的抗氧化能力。因此，以釀酒過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄籽為原料，提取富含多酚類(lèi)物質(zhì)的葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE），不僅能為葡萄的綜合利用開(kāi)辟新途徑，而且還可帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。葡萄籽中原花青素的含量在不同的廠家有著明顯差異，質(zhì)量也因?yàn)槠咸炎旬a(chǎn)地和加工方法的不同也存在差異，采用高效液相色譜法可以較快評(píng)定葡萄籽提取物中總多酚含量和主要單體含量，得出的結(jié)果與采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定葡萄籽提取物中的總多酚有一定的差異，主要原因是由于品種和提取工藝的不同。

多酚類(lèi)物質(zhì)的總量測(cè)定一般采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定，此類(lèi)方法操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低，精確度較高，但不能對(duì)單體進(jìn)行定量測(cè)定。采用液相高效色譜可以根據(jù)需要精確測(cè)定各個(gè)單體的含量，靈敏度高，精準(zhǔn)，能滿實(shí)驗(yàn)需求。

目前市面上的葡萄籽提取物因?yàn)槠贩N地方性特征而沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)格，對(duì)里面的成分含量不明確，通過(guò)此方法不失為一種可行的方法。

［1］ 廖國(guó)周，王桂瑛，徐幸蓮，周光宏.葡萄籽提取物對(duì)烤羊肉中雜環(huán)胺形成的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（6）：248-251.

［2］ 李華，袁春龍，王蔚新；葡萄籽提取物（葡萄籽提取物）有效成分的分析［J］：1673-1689（2006）05-00010

［3］ 陳召桂，盧艷花，魏東芝；HPLC測(cè)定葡萄籽提取物中原花青素B2的含量［J］；中成藥，100121528 （2007） 1121645203

［4］ 馮建光， 陳利瓊；葡萄籽提取物中OPC的測(cè)定［J］；中國(guó)食品添加劑；1006-2513（2007） 04-0156-04

［5］ 左媛，王曉聞；葡萄籽提取物研究進(jìn)展綜述［J］；百業(yè)科技；1004—6429（2010）03-0138—02

［6］ 傅武勝，蔡一新，林明玉，等。鐵鹽催化比色法測(cè)定葡萄籽提取物中的原花青素［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（10）：57-61

［7］ 孫蕓，谷問(wèn)英。硫酸-香草醛法測(cè)定葡萄籽原花青素含量［J］食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（9）：43-46

［8］ 何強(qiáng)，呂遠(yuǎn)平，姚開(kāi)，等。兒茶素的分析比較研究［J］，食品科學(xué)，2003，24（2）：114-116

［9］ 李奕，高軍濤，張志玲等。毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)定葡萄籽中兒茶素類(lèi)化合物［J］，色譜，2000，18（6）：491-494

［10］ 馬亞軍.葡萄籽功效成分-原花青素分析測(cè)定方法的研究（D）.西北大學(xué)碩士論文，2003

［11］ 馬亞軍，楊秉勤，郎惠云.酸銨分光光度法測(cè)定葡萄籽提取物中的原花青素［J］.中國(guó)油脂，2003，28（3）：63-65

［12］ 盧翠英.流動(dòng)注射-抑制化學(xué)發(fā)光法測(cè)定葡萄籽提取物中原花青素［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2004，23（2）：75-77

Grape seed extract Determination of Proanthocyanidin

Deng-Yao Yang-Litin Liao-Guozhou*
（ College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， 650201， China）

In this experiment， combined with the actual situation of grape seed extract， and the detection of the new analysis method， established the detection method of the qualitative and quantitative analysis of procyanidins content by HPLC. Method：Using A mobile phase acetonitrile and mobile phase B of 2% acetic acid solution by gradient elution， A from 0 to 30%， sample volume 10 L， rate of 0.5ml/min， column temperature of 30， the detection wavelength of 280nm. The results show that the gallic acid content in grape seed extract for 0.939mg/g，catechin is 73.496mg/g， catechin， epicatechin is 17.071mg/ g， epicatechin gallate is 3.106mg/g， the accuracy of RSD=2.9%， the average recovery was 96%-109%. This method is accurate，sensitive， the advantages of wide application range， it must have all the measured components of the standard to the qualitative and quantitative.

HPLC；Grape Seed Extract；Proanthocyanidins