沈加斌， 徐 攀， 李鑫雨， 張 立， 鄭海燕， 雍 彬

（四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101）

人胰島素原基因在大腸桿菌中的可溶性表達及分離純化研究

沈加斌， 徐 攀， 李鑫雨， 張 立， 鄭海燕， 雍 彬*

（四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101）

根據NCBI中的人胰島素原基因序列及大腸桿菌密碼子偏愛性設計特異引物，PCR擴增得到人胰島素原基因，構建該基因的原核表達質粒pET32-PI，重組質粒轉化大腸桿菌BL21 （DE3）。對重組菌進行溫度和IPTG濃度優(yōu)化，發(fā)現重組菌在30℃和終濃度為0.6 mmol/L的IPTG條件下表達效果最好且沒有包涵體，經SDS-PAGE和Westem blot檢測，表達蛋白的相對分子質量與理論相對分子質量一致且具有胰島素的免疫原性，證明胰島素原基因得到了正確表達。對重組菌進行流加發(fā)酵，發(fā)酵液離心收集菌體，破菌后上清液過親和層析柱和離子交換柱分離純化目的蛋白，透析后的樣品用腸激酶和羧肽酶酶切，利用親和柱去除融合蛋白與His標簽，最終分離胰島素樣品，利用免疫酶標法，l mL樣品測得活性92 μIU，證明實驗所得樣品具有人胰島素活性。

人胰島素原；大腸桿菌；發(fā)酵；分離純化

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是由于體內胰島素相對或絕對分泌不足，或因胰島素的生物效應降低，而引起糖、脂肪和蛋白質代謝異常的一種慢性終身性疾?。?-3］。20世紀80年代起重組DNA技術開始用于人胰島素的生產，目前人胰島素基因可在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈球菌、畢赤酵母及小鼠中表達，而主要的表達系統(tǒng)有兩個：大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)［4-10］。在酵母系統(tǒng)中胰島素的產量較低且成本高昂，大腸桿菌中表達產物有時容易形成包涵體，但是通過密碼子優(yōu)化、降低培養(yǎng)溫度、添加促溶標簽及更換誘導劑等條件可以減少包涵體生成，而且其生產成本較低、背景清楚等優(yōu)點使得大腸桿菌依然是胰島素表達的理想宿主，因此對于胰島素原基因序列及表達條件的優(yōu)化對于胰島素工業(yè)化生產具有重要的意義。作者對人胰島素原基因進行密碼子優(yōu)化，合成人胰島素原基因寡核苷酸片段，通過片段連接和PCR擴增得到人胰島素原基因，將優(yōu)化基因與原核表達載體pET32（a+）連接轉化大腸桿菌BL21（DE3），重組菌經過培養(yǎng)溫度和IPTG濃度的優(yōu)化，明顯降低了包涵體的產生，并通過親和層析和離子交換層析分離得到目的蛋白，酶切和純化后對得到的重組胰島素活力進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和培養(yǎng)基 大腸桿菌菌株E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）：購自北京天根生物科技公司；質粒 pET32a（+）：購自Novagen公司；質粒pMD18-T：購自大連寶生物公司；LB培養(yǎng)基（組分g/ L）：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，pH值7.0。種子培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，氨芐青霉素 0.1 mg；發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/ L）：蛋白胨1 g，Yeast Extract 0.5 g，Na2HPO4·12H2O 17.5 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，葡萄糖10 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，微量元素溶液 2.5 mL；補料培養(yǎng)基：葡萄糖 600 g，MgSO4·7H2O 17 g，微量元素溶液 2.5 mL；微量元素溶液：FeCl3·6H2O 27 g，ZnCl2·4H2O 2 g，CaCl2·6H2O 2 g，NaMoO4·2H2O 2 g， CuSO4·5H2O 1.9 g，H32BO30.5 g，CoCl2·6H2O 2 g，MnSO4·H2O 2.5 g。

1.1.2 主要儀器和試劑 5415D離心機、5810R冷凍離心機：購自德國Eppendorf公司；UV-250 IPC分光光度計：購自日本島津公司；凝膠成像系統(tǒng)：購自德國UVP公司；TC-25/H PCR儀：購自杭州大和熱磁電子有限公司；5L BIOFLOⅢ生物發(fā)酵罐：購自美國NBS公司；超聲細胞粉碎器：購自美國Heat Sys-Ultrasonics公司；限制性核酸內切酶Kpn I、EcoR I，DNA聚合酶 rTaq，核酸相對分子質量Marker DL2000： 購自大連寶生生物公司；T4 Polynucleotide Kinase、T4 DNA Ligase：購自美國NEB公司；鼠抗insulin抗體：購自美國NEB公司；堿性磷酸酶標記的羊抗鼠二抗及堿性磷酸酶顯色底物：購自美國KPL公司；PVDF膜：購自美國Milliopore公司；質粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒：購自美國Omega Bio-tek公司；其他化學試劑（進口或國產分析純）成都化學試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據Genebank中公布的人胰島素原基因的序列 （Accession number：BT006808）為模板，同時利用Java Codon Adaptation Tool軟件［13］中的大腸桿菌氨基酸密碼子的偏嗜性對人胰島素基因進行密碼子優(yōu)化，利用優(yōu)化后的序列和pET32a （+）載體序列進行引物設計，共合成14條引物用于該基因的合成（見表1）。

1.2.2 引物磷酸化與連接反應 將合成的14條引物片段分別取1 μL加入EP管中，使用T4 Polynucleotide Kinase在37℃溫育1.5 h進行磷酸化反應，將以上磷酸化的引物片段用PCR純化試劑盒純化，純化后的片段使用T4 DNA Ligase在16℃下連接過夜并再次純化，得到DNA連接片段。

1.2.3 人胰島素原基因克隆 以連接后的片段為模板，根據該基因的序列設計引物，引物序列如下所示：PIF1E：5’-GTCGGTACCGACGACGACGACA AGTTCGTTAACCAGCACCTG-3’，PIR7E：5’-TAAG AATTCTTATTAGTTGCAGTAGTTTTCCAG-3’。通過PCR的方法進行人胰島素原基因的擴增，PCR反應條件如下：94℃預變性3 min，94℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸25 s，72℃延伸7 min，反應后放置于4℃保存。將以上PCR反應后的產物，經1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，瓊脂糖凝膠回收PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，并使用氨芐抗性的LB平板進行篩選，挑取單菌落進行PCR與酶切驗證，并送至北京六合華大基因公司進行測序，最終得到pMD18-T-PI質粒。

表1 磷酸化反應所用引物Table1 Sequence of the primers used in phosphorylation reaction

1.2.4 表達載體構建 pMD18-T-PI與pET32（+）載體分別用KpnI和EcoR I進行雙酶切，37℃酶切3～4 h，1 g/dL瓊脂糖電泳鑒定酶切產物，對目的基因片段和載體片段進行膠回收和純化，使用T4 DNA Ligase對酶切后的PI基因片段和pET32（+）載體片段進行連接，連接后的產物轉化大腸桿菌BL21（DE3），獲得轉化子，對轉化子進行菌液PCR驗證。

1.2.5 人胰島素原基因的誘導表達及 Western Bloting驗證 挑取陽性菌株E.coli BL21/pET32-PI接種于2 mL含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、250 r/min搖床中培養(yǎng)12 h，將500 μL菌液接入含有50 mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，分別在37、32、30、28和25℃等5個溫度條件下進行培養(yǎng)，當A600 nm為0.6左右時進行蛋白誘導表達，研究溫度對PI基因表達的影響。在30℃培養(yǎng)條件下，分別使用終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的IPTG（異丙基-β-D硫代半乳糖苷）誘導，分析誘導劑濃度對PI基因表達的作用，確定最適誘導劑濃度。將IPTG誘導表達的菌體及破菌后上清和沉淀的樣品經SDS-PAGE電泳轉移至PVDF膜后，用鼠抗人胰島素單克隆抗體作為一抗，磷酸酶（Ap）標記的羊抗豚鼠IgG作為二抗，進行Western Blotting印跡分析。

1.2.6 流加發(fā)酵 挑取陽性克隆菌落至40 mL種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度37℃，振蕩培養(yǎng)12 h。然后再轉接于400 mL種子培養(yǎng)基中，接種后培養(yǎng)直至pH和溶解氧均突然急劇上升，表示葡萄糖已耗盡，開始進入補料分批培養(yǎng)階段，此時按指數流加模式流加補料培養(yǎng)基，然后將溫度降到30℃，加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG誘導培養(yǎng)，補料速度以維持大腸桿菌的比生長速率為0.1 h-1左右為準。誘導3～4 h后離心收菌。使用美國NBS公司BIOFLOⅢ5 L工作體積發(fā)酵罐發(fā)酵。起始工作體積4 L，溫度：生長期為37℃，誘導期為30℃；自動流加體積分數28%的氨水使pH值控制在7.0；溶氧（DO）保持在30%左右，補料速度按照下面公式估算［14］

其中F為補料速度（mL/h），X0為補料時細胞干重（g/L），V為補料初期的體積（L），μ為比生長速率（h-1），t為時間 （h），S0為補料液中葡萄糖的質量濃度（g/L），YX/S為大腸桿菌對葡萄糖的產率（g/g）。通過試驗，對于以上參數初始補料時約為X0=2.6 g/L，V=3 L，S0=0.5 g/L，YX/S=0.36 g/g，u=0.3 h-1。

從發(fā)酵開始，每隔1 h取樣，測定其A600 nm，同時用GOD-POD法測定葡萄糖濃度。另外無菌取樣，用滅菌的LB液體培養(yǎng)基做適當的稀釋，接種于不含氨芐的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，然后從上面隨機挑取100個單克隆接種在含氨芐的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，記數菌落數，按照下面公式計算質粒穩(wěn)定性。質粒穩(wěn)定性（%）=（含氨芐的LB平板菌落數/ 100）×100

1.2.7 蛋白純化 將5 L發(fā)酵罐發(fā)酵后收集的菌體取適量加入Tris-HCl緩沖液 （20 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MDTT）中，分別用最高壓力45 MPa破菌6次、最高壓力55 MPa破菌5次和最高壓力65 MPa破菌4次，處理菌液，將沉淀和上清一起進行SDS-PAGE電泳，找出破菌的最合適的壓力和次數。將破菌后的樣品首先進行親和層析，用5倍以上柱體積起始緩沖液 （pH 7.8，20 mmol/L Tris-HCl）平衡層析柱，以l mL/min流速上樣，依次用10、30、50、100 mmol/L咪唑洗脫，洗脫時用紫外檢測儀在線檢測，收集洗脫峰；將親和柱純化后的樣品液以l mL/min的流速過離子交換柱，連接紫外檢測儀在線檢測，分別用含 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl作為洗脫緩沖液階梯洗脫，連接紫外檢測儀在線檢測，收集洗脫峰。

1.2.8 成熟胰島素制備及活力測定 酶切反應：將酶切緩沖液 （25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，l mmol/L CaCl2，0.1%Tween-20，1 mmol/L DTT）與經過透析后的樣品液按1∶9混合均勻，按照測定的蛋白濃度加入EK酶和羧肽酶，恒溫25℃酶切12 h。將酶切后的樣品先過親和柱，除去硫氧還蛋白和組氨酸標簽，收集穿透液過sephadexG-50凝膠層析，分離胰島素與連接肽，流動相為去離子水，流量為1 mL/ min，檢測波長280 nm，收集洗脫峰。收集得到的胰島素樣品送北京市德易臨床檢驗所用免疫酶標法對胰島素活性進行測定。

圖1 人胰島素原基因序列與優(yōu)化后序列的比較Fig.1 Comparison of native and optimized PI gene sequence

2 結果與討論

2.1 基因克隆

首先將經密碼子優(yōu)化后（如圖1所示）合成的胰島素原基因引物片段進行磷酸化處理，并使用T4 DNA Ligase連接，經純化后做為模板進行PCR擴增，1 g/dL瓊脂糖電泳結果發(fā)現在290 bp處有清晰條帶（如圖2（a）所示），與預期擴增的基因大小基本相符。將擴增得到的基因片段首先連接到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌JM109，構建得到pMD18-PI質粒。對該質粒進行雙酶切（如圖2（b）所示），結果表明PI基因成功連接到pMD18-T載體上，將質粒送至華大基因公司進行測序。

圖2 pMD18-PI質粒構建的凝膠電泳Fig.2 Construction of replication plasmid pMD18-PI

圖3 pET32-PI表達載體的構建Fig.3 Construction of the expression vector pET32-PI

2.2 重組表達質粒的構建

對pMD18-PI和pET32a（+）分別使用Kpn I與EcoR I進行雙酶切處理，膠回收片段大小為290 bp 的PI基因片段以及5 900 bp的pET32a（+）線性片段，并使用T4 DNA Ligase過夜連接得到重組質粒（如圖3所示），連接產物轉化大腸桿菌JM109，在抗性平板上挑取陽性克隆菌落，將提取得到的重組質粒進行PCR（如圖4所示）和測序鑒定，最終得到表達質粒pET32-PI。

圖4 pET32-PI質粒PCR驗證結果Fig.4 PCR results of pET32-PI

圖5 不同濃度的IPTG誘導對目的蛋白表達的影響Fig.5 Effect of the different IPTG density on target protein expression

2.3 誘導表達

將表達質粒pET32-PI轉入BL21，挑取單菌落進行蛋白誘導表達，分別使用終質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的IPTG進行誘導表達，結果發(fā)現IPTG濃度從0.2 mmol/L到0.6 mmol/L蛋白表達量持續(xù)增加，而0.6 mmol/L與0.8 mmol/L時表達量相差不大，因此選擇0.6 mmol/L IPTG作為誘導表達濃度（如圖5所示）。重組菌使用25、28、32、37℃進行溫度梯度誘導表達（圖6（a）），結果發(fā)現在25℃和28℃誘導表達時融合蛋白存在于上清溶液中，而在32℃條件下誘導表達時，表達產物有部分出現在沉淀中；在37℃誘導表達時，表達的融合蛋白大部分出現在沉淀中。在30℃條件下誘導表達，結果表達產物基本都出現在上清（圖6（b）），且表達量較高，因此選擇30℃為誘導溫度。

圖6 不同溫度誘導對目的蛋白表達的影響Fig.6 Effect of different temperature on target protein expression

2.4 流加發(fā)酵

大腸桿菌首先在分批發(fā)酵的條件下生長5.5 h，A600 nm即達28左右，此時加入誘導劑IPTG開始誘導，并且控制μ為0.25左右，4 h后A600 nm達到58左右。通過對發(fā)酵液中菌體的質粒穩(wěn)定性測試，發(fā)現發(fā)酵11 h后質粒的穩(wěn)定性為95%，表明該表達質粒在大腸桿菌中保持了較高的穩(wěn)定性。

2.5 蛋白純化

作者用含 20 mmol/L NaCl、pH 7.8、1 mmol/L DTT、20 mmol/L Tris-HCl作為緩沖液，最高壓力分別選擇450、550、650 MPa進行破菌，發(fā)現在最高壓力為650 MPa破菌4次，表達的融合蛋白完全在上清液中。破菌后的樣品使用親和柱純化，洗脫緩沖液分別用10、30、50、100 mmol/L咪唑洗脫，收集洗脫液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖8所示10 mmol/L咪唑洗脫時有部分目的蛋白被洗脫下來，30 mmol/L咪唑幾乎全部洗下柱子上的目的蛋白，50 與100 mmol/L咪唑洗脫時目的蛋白很難被洗下，因此采用30 mmol/L咪唑進行洗脫。從電泳圖來看，經過親和層析后的目的蛋白還含有少量雜質，需進一步純化處理。因此將親和層析后的樣品，經過透析處理后使用離子交換柱再次純化，用不同濃度NaCl洗脫，從0.1 mol/L開始階段洗脫，直到無洗脫峰出現。如圖9所示，以0.2 mol/L濃度NaCI洗脫時紫外吸收示數可達最高，最高值為0.8，最終得到純度較高的蛋白樣品。

圖7 親和柱階段洗脫樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.7 Analysis of SDS-PAGE on step-wise affinity elution samples

圖8 離子交換層析階段洗脫曲線Fig.8 Step-wise elution curves of ion exchange

2.6 Western Blot鑒定

將純化后的胰島素原蛋白樣品經SDS-PAGE電泳轉移至PVDF膜后，以鼠抗人胰島素單克隆抗體作為一抗，磷酸酶（Ap）標記的羊抗豚鼠IgG作為二抗進行Western Blot印跡分析。如圖9所示，蛋白質免疫印跡的PVDF膜的有明顯的條帶，這表明重組PI蛋白可以與抗體雜交，因此純化得到的PI蛋白具有免疫活性。

2.7 酶活力測定

將純化后的胰島素原蛋白使用EK酶去除硫氧還蛋白和組氨酸標簽，用羧肽酶水解胰島素原蛋白得到成熟胰島素。洗脫圖譜如圖10所示，凝膠層析出現兩個洗脫峰，收集第一個洗脫峰即為重組人胰島素樣品液，最終得到純化的胰島素與連接肽。將分離純化后的樣品送北京市德易臨床檢驗所用免疫酶標法對胰島素活性進行測定，檢測結果為l mL樣品液中胰島素活性為92 μIU，證明作者所制備的樣品具有胰島素活性。

圖9 Western Blot檢測重組PI蛋白Fig.9 Western Blot analysis of the recombinant PI

3 結語

圖10 酶切后凝膠層析圖譜Fig.1 0 Profile of Sephades G-50 gel chromatography after enterokinase

糖尿病的治療藥物有很多種，I型糖尿病由于是體內胰島素的絕對缺乏造成的，所以胰島素類藥物是治療I型糖尿病的必需特效藥物；II型糖尿病患者出現胰島素缺乏時，也需要胰島素治療［15-16］。因此胰島素在糖尿病的治療中有著舉足輕重的地位和廣闊的開發(fā)前景。作者對人胰島素原基因進行密碼子優(yōu)化，與pET32a（+）質粒連接后實現了該基因在大腸桿菌BL21中的成功表達，作者對胰島素原基因的誘導表達條件進行了探索，發(fā)現了誘導最適溫度和誘導劑濃度，并通過親和層析和離子交換層析成功得到了較純的胰島素原蛋白，酶切純化后的胰島素經活力測定具有一定的胰島素活性。在樣品制備過程中由于緩沖液條件與生理條件不同或者其他因素的影響，而導致樣品中部分胰島素生物活性的喪失，今后可以對胰島素原及成熟胰島素的純化條件進一步探索以保證胰島素的活性及穩(wěn)定性。

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Soluble Expression and Purification of Human Proinsulin in Escherichia coli.

SHEN Jiabin， XU Pan， LI Xinyu， ZHANG Li， ZHENG Haiyan， YONG Bin*
（College of Life Science Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China）

The human proinsulin gene（PI）was cloned by PCR using specific primers designed according to the PI gene sequcence in NCBI and codon in Escherichia coli.The expression plasmid pET32-PI was constructed to express fusion protein of PI in E.coli BL21（DE3）.The recombinant PI protein in E.coli exhibited the best expression at an optimized condition of 30℃and 0.6 mmol/L Isopropyl β-D-Thiogalactoside （IPTG）.The results of SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that the PI protein was successfully expressed at the same molecular weight as the known PI protein.After the Fed-batch fermentation and centrifugation，this protein was purified to homogeneity using the Ni-NTA affinity chromatography and ion exchange chromatography，respectively.Proinsulin was converted to mature insulin through the digestion of enterokinase and carboxypeptidase.The digested product was purified by Ni-NTA affinity chromatography.The enzyme activity of recombinant insulin was 92 μlU/mL and the product was proved to possess theactivity of human insulin.

proinsulin，Escherichia coli，ferment，separation and purification

Q 789

A

1673—1689（2016）07—0721—07

2015-01-01

國家自然科學基金項目（21472132）

雍 彬（1973—），男，四川南充人，理學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事微生物基因工程研究。

E-mail：binyong1225@163.com