方亞男， 段敬霞， 張 玲， 楊海麟

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

3α-羥類固醇脫氫酶的親和純化及化學(xué)修飾提高酶穩(wěn)定性

方亞男， 段敬霞， 張 玲， 楊海麟*

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

研究了3α-羥類固醇脫氫酶（3α-HSD）經(jīng)化學(xué)修飾后的穩(wěn)定性變化。已構(gòu)建的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET28a-hsd經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、鎳柱親和純化得到電泳純的3α-HSD酶，酶蛋白得率是16.5%，活性回收率為64.7%，純化倍數(shù)約為3.8，15%SDS-PAGE結(jié)果顯示3α-HSD酶為單一條帶，相對(duì)分子質(zhì)量在28 000左右。采用鄰苯二甲酸酐（PA）作為修飾劑，對(duì)3α-HSD純酶進(jìn)行化學(xué)修飾，與對(duì)照組相比，修飾酶抵抗pH波動(dòng)的能力有所增強(qiáng)，50℃水浴10 min后酶的熱穩(wěn)定性明顯提高，37℃貯藏40 h后修飾酶的貯藏穩(wěn)定性比原酶提高9倍。

3α-羥類固醇脫氫酶；親和純化；鄰苯二甲酸酐；化學(xué)修飾；穩(wěn)定性

3α-羥類固醇脫氫酶 （3α-Hydroxysteroid dehydrogenase，3α-HSD，EC 1.1.1.50），可作用于多種類固醇基質(zhì)，可逆地催化C19～27類固醇3位羥基/酮基的氧化還原［1］。臨床上用3α-HSD作為工具酶來測定人血清中的總膽汁酸 （Total bile acids，TBA）濃度［2］。目前，TBA測定中所用的工具酶3α-HSD均從睪酮叢毛單胞菌中直接提取，但提取過程復(fù)雜、酶蛋白得率低，酶的穩(wěn)定性低，在一定程度上限制了TBA測定的臨床推廣［3］。因此，要使3α-HSD廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中，一方面需要尋求更簡單高效的提取純化方法，另一方面必須要提高3α-HSD酶的催化活性、穩(wěn)定性。

目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道木瓜蛋白酶、脂肪酶、辣根過氧化物酶（HRP）等多種酶經(jīng)小分子酸酐修飾后，其催化活性或穩(wěn)定性得到不同程度的提高［4-7］。鄰苯二甲酸酐是賴氨酸Lys的專一修飾劑，PA的羧基能與Lys殘基末端的ε-NH2生成酰胺鍵，能夠有效改善酶的性能。

利用重組菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-hsd表達(dá)純化得到融合蛋白，采用鄰苯二甲酸酐修飾對(duì)3α-HSD的Lys殘基進(jìn)行化學(xué)修飾，并對(duì)pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及貯藏穩(wěn)定性等進(jìn)行研究，并對(duì)修飾效果提出合理的解釋。

1 材料與方法

1.1 材料

重組菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-hsd：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。鄰苯二甲酸酐購自國藥化學(xué)試劑有限公司；卡那霉素、異丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）、咪唑、牛血清蛋白、透析袋：均購自上海生工；所有試劑均是分析純。

1.2 主要儀器

3 K-15臺(tái)式高速離心機(jī)：SIGMA公司產(chǎn)品；754UV紫外-可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠制造；蛋白電泳儀：美國BIO-RAD公司制造。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 融合蛋白 3α-HSD的表達(dá) 菌種發(fā)酵培養(yǎng)及融合蛋白3α-HSD的誘導(dǎo)表達(dá)見文獻(xiàn)［3］。離心收集細(xì)菌沉淀，超聲破碎后離心收集上清液，即獲得粗酶液。

1.3.2 融合蛋白3α-HSD的親和純化 將Ni-IDA瓊脂糖作為親和介質(zhì)裝柱后，用軟管與紫外檢測儀相連，先用平衡緩沖液（20 mmol/L，pH 7.5磷酸鹽緩沖液）以1 mL/min的流速平衡，將30 mL的粗酶液上樣，平衡緩沖液流洗至A280 nm處的吸光值不再變化，用100、200、300、400 mmol/L不同濃度的咪唑進(jìn)行洗脫，收集有酶活性的洗脫液，脫鹽后制樣品進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%SDS-PAGE電泳分離，檢測融合蛋白的純度［8-9］。

1.3.3 酶活性的測定 按Boyer等人的方法測定酶活性［1］。

1.3.4 蛋白質(zhì)濃度的測定 采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)［10］。

1.3.5 3α-HSD酶的化學(xué)修飾 取10 mL，10 mmol/ L預(yù)先配制好的鄰苯二甲酸酐溶液，與10 mL，1 mg/ mL 3α-HSD酶混合，在4℃下恒溫磁力攪拌1 h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入預(yù)先處理好的透析袋中，在4℃下，用20 mmol/L pH 7.5的磷酸緩沖液透析若干小時(shí)，以除去未參加反應(yīng)的修飾劑［6］。

1.3.6 酶穩(wěn)定性測定 將修飾酶和原酶分別與不同pH范圍6.0～11.0磷酸緩沖液混合，25℃水浴30 min。將修飾酶和原酶分別在25、30、35、40、45、50、55、60℃水浴中保溫10 min后測酶活。同時(shí)將修飾酶和原酶分別在37℃水浴中放置40 h，每隔一段時(shí)間取樣，按1.3.3方法測酶活，計(jì)算相對(duì)殘余酶活。以上每個(gè)樣品的穩(wěn)定性測定均做3次平行試驗(yàn)取平均值，并計(jì)算相對(duì)殘余酶活［11］。

2 結(jié)果與討論

2.1 融合蛋白3α-HSD的親和純化

pET28a作為載體所表達(dá)的重組蛋白在其N端有一個(gè)6個(gè)His組成的“標(biāo)簽”。故利用Ni2+-IDA瓊脂糖作為親和介質(zhì)，組氨酸與Ni2+之間形成配位相互作用，選擇性地將融合蛋白3α-HSD吸附在鎳柱上，再用0.1～0.4 mol/L不同濃度咪唑進(jìn)行洗脫，最終分離純化出3α-HSD純酶。

將Ni-IDA瓊脂糖作為親和介質(zhì)裝柱，平衡緩沖液平衡柱床，粗酶液上樣后平衡緩沖液流洗至A280處吸光值為定值。用100、200、300、400 mmol/L不同濃度咪唑進(jìn)行洗脫，蛋白洗脫曲線如圖1所示。在0～50 min時(shí)間內(nèi)，大部分雜蛋白沒有吸附到親和層析柱上，其他雜蛋白在51～90 min時(shí)間段隨著低濃度咪唑的洗脫而被分離出來，而含有酶活的3α-HSD酶在90～104 min內(nèi)被300 mmol/L濃度的咪唑洗脫下來。

收集3α-HSD純化過程中的洗脫峰，測定3α-HSD酶活力及蛋白含量，計(jì)算比酶活及蛋白回收率，結(jié)果如表1所示：親和純化后3α-HSD酶蛋白得率是16.5%，活性回收率為64.7%，純化倍數(shù)約為3.8。

取適量粗酶液經(jīng)鎳柱純化后，將收集到純酶制備樣品，考馬斯亮藍(lán)染色后，進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，300 mmol/L咪唑洗脫下來的3α-HSD為單一條帶，相對(duì)分子質(zhì)量在28 000左右，與文獻(xiàn)［8］中報(bào)道一致。

圖1 3α-HSD酶的親和純化洗脫曲線Fig.1 Elution curve of affinity purification of 3α-HSD

圖2 純酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%SDS-PAGE分析Fig.2 15%SDS-PAGE analysis of purified 3α-HSD

表1 3α-HSD酶的分離純化結(jié)果Table1 Purification results of 3α-HSD

2.2 原酶與修飾酶的pH穩(wěn)定性比較

通常，酶分子經(jīng)過小分子化學(xué)修飾后，其耐酸耐堿能力會(huì)發(fā)生變化。圖3顯示化學(xué)修飾對(duì)3α-HSD的pH穩(wěn)定性影響。與原酶相比較，修飾酶對(duì)pH波動(dòng)表現(xiàn)了更好的抵抗能力。在pH=6和pH=7時(shí)，原酶的相對(duì)殘余酶活低于20%，而在pH 6.0～11.0的范圍內(nèi)，修飾酶的相對(duì)殘余酶活都大于50%。3α-HSD經(jīng)鄰苯二甲酸酐修飾后pH穩(wěn)定性得到一定提高。

圖3 3α-HSD原酶與修飾酶的pH穩(wěn)定性比較Fig.3 pH stability comparison of native and PA modified 3α-HSD

2.3 原酶與修飾酶的熱穩(wěn)定性比較

由圖4可知，在溫度超過45℃時(shí)，修飾酶與原酶的相對(duì)殘余酶活顯著的降低。50℃水浴10 min后，原酶的相對(duì)殘余酶活僅僅15.4%，而修飾酶的相對(duì)酶活值高達(dá)64.5%。60℃水浴10 min后，原酶完全失活，修飾酶有少量酶活。這與其他研究者報(bào)道的結(jié)果一致。如劉建忠［6］等人用鄰苯二甲酸酐修飾辣根過氧化物酶（HRP）后熱穩(wěn)定性比原酶提高10倍。仝艷軍［11］等人曾用EDC活化后的聚賴氨酸修飾肌氨酸氧化酶表面的羧基，能有效的提高該酶的熱穩(wěn)定性。

圖4 3α-HSD原酶與修飾酶的熱穩(wěn)定性比較Fig.4 Thermal stability comparison of native and PA modified 3α-HSD

2.4 原酶與修飾酶的貯藏穩(wěn)定性比較

原酶與修飾酶在37℃水浴中放置40 h，每隔一定時(shí)間取樣測酶活。由圖5可知，隨著時(shí)間的延長，酶的活性呈下降趨勢，但與原酶相比，修飾酶的酶活降低幅度小。當(dāng)放置40 h時(shí)，修飾酶的酶活約是原酶酶活的9倍。

經(jīng)鄰苯二甲酸酐修飾后，3α-HSD的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及貯藏穩(wěn)定性得到不同程度的提高。這種現(xiàn)象可能是：鄰苯二甲酸酐與酶表面賴氨酸Lys的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺鍵，中和部分3α-HSD酶表面的電荷，使酶在水溶液中的穩(wěn)定性提高。同時(shí)，中和部分電荷也減少酶分子內(nèi)同種電荷間的排斥，使得酶分子形成更緊密的結(jié)構(gòu)，對(duì)酶在酸堿條件下的穩(wěn)定性有積極作用［12-13］。關(guān)于化學(xué)修飾提高酶穩(wěn)定性的原因，也可能是酶分子與修飾劑之間共價(jià)連接后，使酶分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的“剛性”，而變得更加有序和致密，從而提高酶的穩(wěn)定性［14］。

圖5 3α-HSD原酶與修飾酶的貯藏穩(wěn)定性比較Fig.5 Storage stability comparison of native and PA modified 3α-HSD

3 結(jié)語

重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)后，鎳柱親和純化分離得到3α-HSD純酶。酶蛋白得率是16.5%，活性回收率為64.7%，純化倍數(shù)約為3.8。采用鄰苯二甲酸酐對(duì)純酶進(jìn)行化學(xué)修飾，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及貯藏穩(wěn)定性得到不同程度的提高。如修飾酶對(duì)pH波動(dòng)表現(xiàn)了更好的抵抗能力。由此可見，鄰苯二甲酸酐修飾是改善3α-HSD酶性質(zhì)的一種溫和、有效的方法。改善的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)3α-HSD酶在醫(yī)藥，環(huán)保等行業(yè)的應(yīng)用有一定的促進(jìn)作用。

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Affinity Purification of 3α-Hydroxysteriod Dehydrogenase and Enzyme Stability Improvement by Chemical Modification

FANG Yanan， DUAN Jingxia， ZhANG Ling， YANG Hailin*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The stability change of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase（3α-HSD）after chemical modification was studied.The purified 3α-HSD was obtained by a induced expression of constructed genetic engineering bacteria E.coli BL21 （DE3）/pET28a-hsd at first and then by an affinity purification using Ni2+-Sepharose column with 16.5%of protein yield，64.5%of recovery yield and 3.8 times of specific activity.The SDS-PAGE （15%，reducing conditions）analysis showed that 3α-HSD was composed of a single polypeptide of～28 kDa.The chemical modification of 3α-HSD was done using phthalic anhydride（PA）.After modification，the pH stability of 3α-HSD increased within pH 6.0～pH 11.0 compared with the control group and its heat stability significantly increased after incubation at 50℃for 10 min.When stored at 37℃for 40 h，the storage stability of modified 3α-HSD was improved about 9-fold than that of native enzyme.

3α-hydroxysteroid dehydrogenase，affinity purification，phthalic anhydride，chemical modification，stability

Q 55

A

1673—1689（2016）07—0747—05

2015-01-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （31301540；21306064）；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 （BE2011625）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012119）。

楊海麟（1971—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，副教授，主要從事發(fā)酵工程和酶工程研究。E-mail：673179850@qq.com