周 榮， 羅綠花， 麥然標， 余婉嫻， 賀曉燕， 紀紅美， 石俊松， 王青來，蔡更元,2，吳珍芳,2*

(1.廣東溫氏食品集團股份有限公司國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東新興527439；2.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州510642)

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Vc對豬體細胞克隆胚胎體外及體內(nèi)發(fā)育的影響

周 榮1， 羅綠花1， 麥然標1， 余婉嫻1， 賀曉燕1， 紀紅美1， 石俊松1， 王青來1，蔡更元1,2，吳珍芳1,2*

(1.廣東溫氏食品集團股份有限公司國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東新興527439；2.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州510642)

[目的]提高克隆豬的大批量生產(chǎn)效率，優(yōu)化體外與體內(nèi)培養(yǎng)體系。[方法]將所獲得的豬體細胞克隆胚胎用含不同Vc濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)，比較體外囊胚發(fā)育力和囊胚細胞數(shù)，篩選出合適的培養(yǎng)濃度，然后用此濃度培養(yǎng)后的胚胎進行體內(nèi)手術(shù)移植，統(tǒng)計克隆豬的分娩率和產(chǎn)仔情況。[結(jié)果]克隆胚胎在激活后用40 μg/mL Vc處理22 h，體外培養(yǎng)未顯著增加囊胚率，但顯著提高了囊胚細胞數(shù)。體內(nèi)移植結(jié)果顯示，添加Vc未提高妊娠率，但增加了窩均總仔數(shù)，克隆效率差異顯著。[結(jié)論]Vc處理有利于增強體細胞克隆胚的體內(nèi)和體外發(fā)育能力。

Vc；豬；克隆胚胎；發(fā)育

克隆胚胎必須在體外培養(yǎng)一段時間后，選擇在合適的發(fā)育階段移植到受體母豬體內(nèi)。雖然體外培養(yǎng)取得了一些成果，但體外培養(yǎng)條件仍不能與體內(nèi)相比[1]。目前關(guān)于改善體外培養(yǎng)條件的研究很多，如氣象環(huán)境[2]、培養(yǎng)液成分[3]等。ROS是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧族，對于體內(nèi)正常卵母細胞的成熟和胚胎的發(fā)育是必需的，它對胚胎的氧化損傷決定于其生產(chǎn)和清除之間的平衡[4]。近年來，已有研究在胚胎體外培養(yǎng)過程中添加小分子抗氧化物質(zhì)，以降低因過氧化反應(yīng)應(yīng)激造成的早期胚胎損傷，有一些抗氧化劑已被用于胚胎的體外培養(yǎng)，包括維生素E[5-6]、谷胱甘肽(GSH)[7]、L-肉堿[8]、和維生素C[9-10]等。Vc又稱抗壞血酸，在清除細胞內(nèi)自由基和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原平衡方面具有重要作用[11]，在ROS對胚胎的保護方面，可以通過減少氧化應(yīng)激和表觀遺傳修飾調(diào)控，促進小鼠和豬早期胚胎體外發(fā)育效率[9-10,12]。筆者在胚胎培養(yǎng)液中添加不同濃度Vc，比較不同濃度Vc對克隆胚胎體外發(fā)育和體內(nèi)移植效果的影響，旨在為提高克隆豬的實際生產(chǎn)效率提供參考。

1　材料與方法

1.1材料豬卵巢采自廣州某屠宰場，豬成體成纖維細胞分離自新興縣水臺原種場優(yōu)秀種公豬。細胞培養(yǎng)相關(guān)耗材為Corning公司產(chǎn)品；卵母細胞成熟及胚胎培養(yǎng)耗材為NUNC公司產(chǎn)品。

1.2主要試劑卵母細胞培養(yǎng)用試劑均購自Sigma(美國)公司，供體成纖維細胞培養(yǎng)用試劑購自life(美國)公司，胎牛血清(GIBCO，美國)，生理鹽水(紫光古漢集團衡陽制藥有限公司)。

洗卵液：DPBS+1%PVA液。卵母細胞成熟培養(yǎng)液：TCM-199+10%豬卵泡液(PFF)+10%FBS+10 IU/mL PMSG+10 IU/mL HCG+0.1 μg/mL半胱氨酸+10 ng/mL表皮生長因子(EGF)。體外操作液HN：無鈣的H-NCSU-23。融合激活液F：0.25 mol/L Mannitol，0.1 mmol/L CaCl2·2H2O，0.1 mmol/L MgCl2·6H2O，0.5 mmol/L HEPES，0.01% PVA(W/V)。胚胎培養(yǎng)液：PZM-3豬合子培養(yǎng)液。囊胚染色液：含5 μg/mL Hoechst33342的DPBS液。供體成纖維細胞培養(yǎng)液：DMEM+10%FBS。

1.3方法

1.3.1卵母細胞收集及體外成熟培養(yǎng)。豬卵巢采自廣州某屠宰場，用剪刀去除輸卵管等組織后，將卵巢置于含抗生素的37 ℃生理鹽水中，保溫3 h運回實驗室。用含抗生素的生理鹽水沖洗3～5次后，用配有18 G針頭的10 mL注射器抽取直徑2～6 mm的卵泡，卵泡液置于37 ℃水浴保溫的50 mL離心管中。靜置15～20 min后去上清，洗卵液稀釋后在體視顯微鏡下用自制撿卵針撿取胞質(zhì)完整及包裹3層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復(fù)合體(Cumulus oocyte complexes，COCs)。用洗卵液沖洗3次，再用成熟培養(yǎng)液沖洗2次，然后放入已在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)平衡4 h以上的成熟培養(yǎng)液中。在39 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)42～44 h。

1.3.2供體細胞培養(yǎng)。在新興縣水臺原種場采集優(yōu)秀種公豬耳樣，經(jīng)含有雙抗的生理鹽水沖洗，保存到含雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，用冰盒帶回實驗室。耳樣在實驗室制成細胞懸液，培養(yǎng)細胞，冷凍保存。進行核移植操作前7～14 d，用DMEM+10%FBS將供體細胞復(fù)蘇培養(yǎng)。將傳代至5～6代的成纖維細胞培養(yǎng)至100%匯合，再接觸抑制2 d后，常規(guī)消化，離心洗滌，最后用操作液將細胞沉淀重懸，用做核供體。

1.3.3克隆胚胎的生產(chǎn)。將成熟培養(yǎng)42～44 h后的卵母細胞與1 mg/mL透明質(zhì)酸酶混合，用移液槍反復(fù)吹打除去卵丘細胞，以胞質(zhì)均勻、第一極體排出為成熟標志挑選出成熟的卵母細胞，放至操作液滴中備用。采用盲吸去核法構(gòu)建體細胞克隆胚胎：在顯微操作儀上用固定針將卵母細胞固定，去核針撥動使極體處于5：00位置，用去核針將卵母細胞內(nèi)的極體及附近1/3胞質(zhì)去除并將體細胞注進透明帶內(nèi)，使其與胞質(zhì)緊密貼近。將構(gòu)建好的重構(gòu)胚恢復(fù)30 min后做融合激活：先用融合激活液F洗滌3～5次，再移至已鋪滿融合激活液的融合槽中，調(diào)整重構(gòu)胚的位置使供體細胞與卵母細胞膜的接觸面與電場方向垂直，進行電融合激活。電融合儀型號為BLS-150B，設(shè)置參數(shù)：場強為80 V，脈沖時間80 μs，脈沖次數(shù)2 DC，一次可同時操作15個左右卵母細胞。經(jīng)過胚胎培養(yǎng)液PZM洗滌3遍后轉(zhuǎn)移至添加5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX的胚胎培養(yǎng)液中輔助激活處理4 h，再在體視鏡下判定融合。

1.3.4克隆胚胎的體外培養(yǎng)。 將融合后的克隆胚置于不同Vc濃度(0、20、40 μg/mL)的胚胎培養(yǎng)液中，在39 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h。22 h時換成不含Vc的胚胎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在48和168 h時觀察記錄卵裂率和囊胚形成率。

1.3.5囊胚細胞染色計數(shù)。取出培養(yǎng)168 h的囊胚，在含有3.7%多聚甲醛的DPBS 中洗滌2遍后固定10 min，將固定好的囊胚轉(zhuǎn)移至含10 μg/mL Hoechst33342的DPBS中避光染色5 min，將染好的囊胚用操作液洗3遍，轉(zhuǎn)移至載玻片上，盡量少帶液體，用礦物油在載玻片的四角點四個柱，再輕壓蓋玻片(圖1)。然后在Olympus 熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)下觀察拍照，細胞計數(shù)(圖2)。

圖1　囊胚白光Fig.1　Blastocyst white light

圖2　囊胚熒光Fig.2　Blastocyst fluorescence

1.3.6手術(shù)移植。以體外培養(yǎng)效果較好的Vc濃度培養(yǎng)克隆胚胎22 h后直接進行手術(shù)移植。即將融合后的克隆胚置于含40 μg/mL Vc的胚胎培養(yǎng)液中，在39 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h，22 h后直接將克隆胚移植至同期發(fā)情的受體母豬子宮內(nèi)，妊娠到期后統(tǒng)計分娩率、窩均總仔數(shù)及克隆效率(出生總仔數(shù)/移植胚胎數(shù))。手術(shù)具體操作方法：手術(shù)當天對母豬禁食，手術(shù)前簡單保定母豬，對豬進行全身靜脈麻醉。手術(shù)部位選擇在倒數(shù)第二對乳頭中間部位，先用清水清洗手術(shù)部位及四周，擦干后先用碘酒大范圍消毒，再用75%乙醇脫碘。蓋上手術(shù)布同時暴露手術(shù)部位，沿腹中線切開皮膚、皮下肌肉，然后分離皮下脂肪和腹膜，手探入腹腔，慢慢牽引出子宮和輸卵管，檢查排卵情況。將裝有胚胎的吸胚管從輸卵管傘口插入，小心將胚胎吹入。然后恢復(fù)子宮和輸卵管到腹腔內(nèi)。常規(guī)手術(shù)縫合，術(shù)后連續(xù)4 d抗生素消炎。術(shù)后記錄受體豬的生理情況，并做好B超妊娠檢測和受體豬飼養(yǎng)管理工作。

1.4統(tǒng)計分析表1的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±SD表示，采用SPSS的卡方進行分析。表2的數(shù)據(jù)用平均數(shù)表示，采用單因素方差分析，P<0.05時差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1胚胎培養(yǎng)中添加Vc對克隆胚胎體外發(fā)育的影響利用含有不同Vc濃度(0、20、40 μg/mL)的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)克隆胚胎22 h后換成不含Vc的胚胎培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至168 h。結(jié)果見表1。由表1可知，克隆胚的卵裂率和體外囊胚發(fā)育之間差異不顯著，但Vc添加組的囊胚率比對照組高。Vc添加組的囊胚細胞數(shù)明顯高于對照組，差異顯著；而40 μg/mL濃度組高于20 μg/mL濃度組，但差異不顯著。說明添加Vc有利于克隆胚胎的體外發(fā)育。

2.2胚胎培養(yǎng)中添加Vc對克隆胚體內(nèi)發(fā)育的影響從手術(shù)移植效果看，Vc添加組與對照組分娩率相同，均為57.14%。Vc添加組的窩均總仔與對照組相比差異不顯著，但明顯高于對照組,特別Vc添加組的克隆效率顯著高于對照組。說明添加Vc對于克隆胚胎在體內(nèi)發(fā)育是有利的。

3　結(jié)論與討論

該研究比較了在克隆胚胎的體外培養(yǎng)體系中添加Vc對克隆胚胎的體外發(fā)育和體內(nèi)發(fā)育潛能的影響,結(jié)果表明，體外培養(yǎng)168 h未顯著增加囊胚發(fā)育率，但顯著提高了囊胚細胞數(shù)和克隆胚的體外發(fā)育能力。體內(nèi)移植結(jié)果顯示，添加Vc也有利于克隆胚胎的體內(nèi)發(fā)育，雖然未提高分娩率，但增加了窩均總仔數(shù)和顯著提高了克隆效率。

表1　胚胎培養(yǎng)中添加Vc對克隆胚胎體外發(fā)育的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercases in the same column indicated significant difference between the treatments (P<0.05).

表2　胚胎培養(yǎng)中添加Vc對克隆胚胎移植效果的影響

注：克隆效率=出生的克隆仔豬數(shù)/每頭受體的移植，同列不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著(P<0.05)。

Note:Cloning efficiency = Number of born cloned piglets/Number of cloned embryos received by all used recipient sows.Different lowercases in the same column indicated significant difference between the treatments (P<0.05).

提高克隆胚胎質(zhì)量、改善體外培養(yǎng)體系對于體外胚胎的生產(chǎn)至關(guān)重要。體外培養(yǎng)體系面臨的一個重要問題是氧分壓對卵母細胞和胚胎的影響。為了改善這種情況，可以采用5%O2低氧培養(yǎng)[13]或者添加抗氧化劑[5,7-10]。其中，Vc對于豬而言是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是一種有效的抗氧化劑，添加到培養(yǎng)液中可以保證適當?shù)腞OS水平，同時保護細胞免受氧化性損傷和細胞凋亡。Jeong等[4]在豬核移植胚胎和體外受精胚胎培養(yǎng)液中添加Vc，降低了體外培養(yǎng)胚胎的凋亡指數(shù)，提高了囊胚細胞總數(shù)。Huang等[9]在培養(yǎng)液中添加適量的Vc,降低了胚胎內(nèi)的氧自由基，增加了囊胚形成率和囊胚細胞數(shù)，降低了細胞凋亡數(shù)。Michel等[14]也證實Vc可以提高細胞內(nèi)谷氨酰胺水平和降低氧自由基濃度，從而提高豬孤雌胚和核移植胚的發(fā)育能力，結(jié)果差異顯著。而在Li等[15]對牛的研究中，得到了不同結(jié)果，即添加Vc后可以增加桑葚胚率但降低了囊胚孵化率。

該研究選用的濃度顯著提高了體外培養(yǎng)的囊胚細胞數(shù)，由于體內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境更好，體內(nèi)移植的克隆胚胎囊胚細胞總數(shù)可能也有一個大的提高，表現(xiàn)在克隆動物出生后窩均總仔也有明顯提高。但也不可添加過量，Jeong等[4]證實了抗氧化劑Vc和Ve添加于體外培養(yǎng)液中，存在劑量依賴性，且不能同時添加。因為ROS是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧族，對于體內(nèi)正常卵母細胞的成熟和胚胎的發(fā)育都是必需的，它對胚胎的氧化損傷決定于其生產(chǎn)和清除之間的平衡，若超過臨界值，抗氧化劑也會有負面影響。具體的分子機制也有一些相關(guān)的報道，Huang等[9]用Vc處理可以顯著提高體外囊胚發(fā)育率，處理胚胎中的組蛋白H4賴氨酸5的乙?；缴?，囊胚中的Oct4、Sox2和Kif4的表達量升高。也有可能是通過H3K36me2/3來建立組蛋白去甲基酶與Vc介導的重編程之間的聯(lián)系[16]。Esteban等[17]研究表明,Vc可以提高小鼠和人誘導多能干細胞iPS產(chǎn)生效率,促進部分重新編程iPS細胞過度至完全重編程狀態(tài),且可能是通過減少細胞內(nèi)抑癌基因p53的完全表達來提高細胞重編程效率。Vc作為一種抗氧化劑用于改善豬克隆胚胎的體外和體內(nèi)發(fā)育質(zhì)量均是可行的，但具體機制還有待于進一步研究。

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Effects of Vitamin C on the Development of Porcine Somatic Cloned Embryosinvitroandinvivo

ZHOU Rong1,LUO Lu-hua1,MAI Ran-biao1,WU Zhen-fang1,2*

(1.Guangdong Wen’s Food Group Co.,Ltd.,National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry，Xinxing,Guangdong 527439; 2.College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong 510642)

[Objective] To improve the ability to generate cloned pigs and to optimize the culture systeminvitroandinvivo.[Method] The porcine SCNT embryos were cultured in the medium with different vitamin C concentrations.Then the blastocyst formation rate and cell number per blastocyst were compared.Proper concentration was screened,which was used to treat cloned embryos.After surgery transfer,farrowing rate and litter size were calculated.[Result] After stimulation,cloned embryos were treated by 40 μg/mL Vc for 22 h; cultureinvitrodid not significantly enhance the blastocyst rate,but the blastocyst cell number was significantly increased.Results ofinvivotest showed that adding Vc did not significantly enhance the pregnancy rate,but increased the average litter size.There were significant differences in the cloning efficiency.[Conclusion] Vc treatment is beneficial to the development of porcine SCNT embryos bothinvivoandinvitro.

Vitamin C; Porcine; Cloned embryos; Development

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育項目(2016ZX08006002；2016ZX08006003)。

周榮(1983-)，女，湖北荊門人，碩士，從事體細胞克隆技術(shù)研究。*通訊作者，教授，從事豬的分子遺傳與動物育種研究。

2016-05-31

S 188

A

0517-6611(2016)23-090-03