陳苗苗， 董金杰， 杜 平

(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司， 甘肅蘭州 730046)

?

低血清培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞染色體遺傳穩(wěn)定性分析

陳苗苗， 董金杰， 杜 平

(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司， 甘肅蘭州 730046)

[目的]對(duì)一種商業(yè)化的低血清培養(yǎng)基適應(yīng)BHK21細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并分析該細(xì)胞染色體的變異穩(wěn)定性，以判定其質(zhì)量。[方法]采用直接法制備4個(gè)代次BHK21細(xì)胞的染色體標(biāo)本，用常規(guī)Giemsa染色，在1 000倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)中期分裂相染色體數(shù)目，并進(jìn)行核型分析。[結(jié)果]BHK21為亞二倍體或亞四倍體細(xì)胞系，亞二倍體總數(shù)為42，亞四倍體細(xì)胞總數(shù)為72～74，該細(xì)胞系染色體的畸變率在各代次所占比例為0～2%，均較低。[結(jié)論]該細(xì)胞系的遺傳學(xué)特性相對(duì)穩(wěn)定，各代次間無(wú)本質(zhì)差異，可候選為制苗用細(xì)胞。

低血清；BHK21；染色體；遺傳穩(wěn)定性

BHK21細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒敏感，且又是口蹄疫病毒很好的宿主細(xì)胞，在口蹄疫疫苗生產(chǎn)中，均使用BHK21細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒進(jìn)行繁殖。無(wú)論是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝還是懸浮培養(yǎng)工藝，都以貼壁的BHK21細(xì)胞為馴化對(duì)象，由權(quán)威機(jī)構(gòu)ATCC保存的BHK21細(xì)胞，此傳代細(xì)胞遺傳上具有一定的變異性。為了保證口蹄疫病毒生產(chǎn)的高效性，保證宿主細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性則是重中之重。目前檢測(cè)細(xì)胞變異系數(shù)的有效方法是核型分析，這是細(xì)胞遺傳學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的核心技術(shù)之一。該技術(shù)可用于研究細(xì)胞和組織及個(gè)體的特異性鑒定、遺傳變異和種屬進(jìn)化關(guān)系。

目前，醫(yī)院常采用外周血、骨髓、羊水制備染色體診斷染色體上的疾病[1-2]。關(guān)于傳代細(xì)胞的核型分析技術(shù)研究很少。傳代細(xì)胞具有馴化成熟、人為控制性強(qiáng)的特點(diǎn)，在實(shí)際科研、檢驗(yàn)、疫苗生產(chǎn)以及生物制品研發(fā)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。筆者以低血清培養(yǎng)適應(yīng)的BHK21細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，染色體標(biāo)本制備參考翁炳煥等[3]提出的考評(píng)標(biāo)準(zhǔn)，其中，可分析分裂相的要求為數(shù)目明確、全部染色體集中但不重疊、染色體伸展適度、著絲粒清晰、染色清晰[4]，取4個(gè)代次400個(gè)中期分裂相的染色體進(jìn)行分析，判定該細(xì)胞系的畸變率，以此為依據(jù)篩選優(yōu)良的細(xì)胞株。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑。秋水仙素;卡諾氏固定液，甲醇∶冰醋酸=3∶1；吉姆薩染色液；25 g/L胰蛋白；胎牛血清；KCl。

1.1.2細(xì)胞BHK21。細(xì)胞BHK21購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司質(zhì)量保證部保存，按常規(guī)組織培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。

1.1.3培養(yǎng)基。MEM細(xì)胞培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，MEM SLM低血清細(xì)胞培養(yǎng)基為北京清大天一生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，新生牛血清為蘭州民海生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)。將復(fù)蘇的BHK21細(xì)胞在T75培養(yǎng)瓶中適應(yīng)低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)32代，其中，F(xiàn)1～F8代為傳統(tǒng)201培養(yǎng)液+10%血清培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞，F(xiàn)9～F16代為商業(yè)化低血清培養(yǎng)基+5%血清培養(yǎng)的BHKL21細(xì)胞，F(xiàn)17～F25代為商業(yè)化低血清培養(yǎng)基+4%血清培養(yǎng)的BHKL21細(xì)胞，F(xiàn)26～F32代為商業(yè)化低血清培養(yǎng)基+3%血清培養(yǎng)的BHKL21細(xì)胞。

1.2.2染色體標(biāo)本制備。參照《四種動(dòng)物傳代細(xì)胞染色體遺傳變異率分析》中染色體標(biāo)本制備的方法。將5代、10代、20代、30代作為細(xì)胞染色體分析的代次，于細(xì)胞終止培養(yǎng)前5～6 h，在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入適量的秋水仙素溶液，使秋水仙素的終濃度為0.01 μg/mL培養(yǎng)液，以便阻止細(xì)胞有絲分裂至中期，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，傾棄培養(yǎng)液加入適量25 g/L胰蛋白酶消化液對(duì)細(xì)胞單層進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，再加入預(yù)熱至37 ℃的75 mmol/L KCl溶液5～6 mL，室溫下低滲30 min，離心傾棄上清液；然后加入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)5 mL固定30 min后，800～1 000 r/min離心10 min，重復(fù)固定1次，置于4 ℃過(guò)夜，次日離心傾棄上清液，沉淀加1 mL新配制的固定液制成細(xì)胞懸浮液，在冰水浸泡的干凈玻片上滴加細(xì)胞懸浮液3～4滴，室溫下晾干，即制成培養(yǎng)細(xì)胞有絲分裂中期的染色體玻片標(biāo)本。

1.2.3染色體的Giemsa染色[5]。染色體玻片標(biāo)本于室溫下放置7 d，或37 ℃干燥2～4 h后，即可進(jìn)行染色體的Giemsa染色，用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液配成100 g/L的Giemsa染色液，滴在染色體玻片標(biāo)本上，染色30 min，蒸餾水沖洗干凈，晾干。

注：a.F4在201培養(yǎng)液+10%血清中的細(xì)胞形態(tài)；b.F9在MEM SLM+5%血清中的細(xì)胞形態(tài);c.F18 在 MEM SLM+4%血清中的細(xì)胞形態(tài)；d.F27在MEM SLM+3%血清中的細(xì)胞形態(tài)?！ote: a. Cell morphology of F4 (201 culture liquid + 10% serum); b. Cell morphology of F9 (MEM SLM + 5% serum); c. Cell morphology of F18 (MEM SLM + 4% serum); d. Cell morphology of F27 (MEM SLM + 3% serum). 圖1　馴化穩(wěn)定4個(gè)代次BHK21細(xì)胞48 h培養(yǎng)形態(tài)Fig. 1　Cultivation morphology of four generations of BHKL21 cells at 48 h after stable domestication

1.2.4染色體的觀察與分析。每個(gè)代次選擇100個(gè)中期分裂相細(xì)胞，在油鏡(10×100)下計(jì)數(shù)染色體數(shù)目，并觀察記錄畸變?nèi)旧w，計(jì)算出染色體的畸變率，每種血清含量培養(yǎng)的細(xì)胞選擇1個(gè)分裂良好的中期分裂相拍攝顯微照片，并進(jìn)行核型分析。

2　結(jié)果與分析

細(xì)胞馴化過(guò)程中，每個(gè)代次BHK21細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定，形態(tài)良好(圖1)。BHK21是源于幼倉(cāng)鼠腎的一種傳代細(xì)胞系[6-7]。共計(jì)數(shù)了BHK21細(xì)胞系的5代、10代、20代和30代400個(gè)中期分裂相的染色體，染色體數(shù)目分布見(jiàn)表1。由表1可知，BHK21屬于亞二倍體和亞四倍體系，5代、10代和30代主要是亞二倍體細(xì)胞系，其中，亞二倍體細(xì)胞染色體數(shù)目32～67，所占比例分別為76%、80%和79%，亞四倍體細(xì)胞染色體數(shù)目為68～87，所占比例分別為23%、20%和20%。20代主要是亞四倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目為68～87，所占比例為68%。染色體的畸變率在各代次所占比例為0～2%，染色體畸變率很低。因此，該細(xì)胞經(jīng)馴化，用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，不同的血清用量，各代次之間無(wú)本質(zhì)差異，遺傳學(xué)特性相對(duì)穩(wěn)定，故可候選為制苗用細(xì)胞。4個(gè)代次細(xì)胞中期分裂相見(jiàn)圖2。

表14個(gè)代次染色體數(shù)目分布

Table 1Distribution of four generations of chromosome number

細(xì)胞代次Cellge-neration染色體數(shù)目范圍Rangeofchromosomenumber∥個(gè)各范圍所占細(xì)胞數(shù)Cellpopulationineachrange∥個(gè)所占比率Percentage%畸變率Deformationrate∥%532～505252051～672424068～87232301091111032～506060051～672020068～87202002032～501212051～6788068～8768680112～1142223032～506161051～671818068～8720200121111

3　結(jié)論

用商業(yè)化的代血清培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)BHK21細(xì)胞，逐漸降低培養(yǎng)液中的血清含量，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過(guò)選取不同代次細(xì)胞的染色體進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明，該細(xì)胞系的遺傳學(xué)特性相對(duì)穩(wěn)定，各代次間無(wú)本質(zhì)差異，可候選為制苗用細(xì)胞。

[1] 張桂林，衛(wèi)小靜，鄭梅玲.918例孕中期羊水細(xì)胞染色體核型分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2012,29(1)：102-104.

[2] 張旺東，王秋菊.染色體核型分析在白血病分型診斷和預(yù)后判斷中的臨床意義[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010,31(12)：1359-1363.

[3] 翁炳煥，任宇珂，朱瑞建，等.染色體制備及核型分析室內(nèi)控制標(biāo)準(zhǔn)及其考評(píng)標(biāo)準(zhǔn)的探討[J].中國(guó)產(chǎn)前診斷雜志，2013,5(2)：40-44.

[4] 黃燕，陳紹坤.動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備失敗的原因分析[J].生物學(xué)通報(bào)，2006,42(1)：52-54

[5] 郭健民,張耀平,劉瑞清，等.常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤染色體的研究[J].遺傳學(xué)報(bào),1980，7(4):376-381.

[6] UMENE K, NISHIMOTO T. Replication of herpes simplex virustype 1 DNA is inhibited in a temperature-sensitive mutant of BHK-21 cells lacking RCC1(regulator of chromosome condensation)and virus DNA remains linear[J].J Gen Virol,1996，77(10):2261-2270.

[7] ISLAM M Q，ISLAM K，LEVAN G，et al. Monochromosome transfers to syrian hamster BHK cells via microcell fusion provide functional evidence for suppressor genes on human chromosome 9 both for anchorage independence and for tumorigenicity [J].Genes Chromosomes Cancer,1995，13(2):112-115.

Chromosome Genetic Stability Analysis of BHK21 Cells with Low Serum Culture

CHEN Miao-miao, DONG Jin-jie, DU Ping

(China Agricultural VET. BIO. Science and Technology Co., Ltd., Lanzhou, Gansu 730046)

[Objective] To analyze a commercialization low serum medium, which was suitable for subculture of BHK21 cells, to analyze the variation stability of the cell chromosome to determine its quality. [Method] Direct method was used to prepare chromosome specimens of 4 four generations BHK21 cells. Conventional Giemsa staining was adopted. The number of metaphase mitotic chromosomes was counted by 1 000 times of optical microscope, so as to find the rate of chromosome mutation, and to carry out karyotype analysis. [Result] BHK21 was a sub diploid or tetraploid cell line. The hypodiploid mode was 42, hypotetraploid cell mode was 72-74 .The chromosome aberration rate of the cell line was 0-2%., which was lower than that of the generation. [Conclusion] The genetic characteristics of the cell line are relatively stable, there is no essential difference between the generations, and it can be used as a candidate for the production of cells.

Low-serum; BHK21; Chromosome; Genetic stability

國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(“863”計(jì)劃 2011AA10A211)。

陳苗苗(1980- ),女，四川廣元人，助理研究員，碩士，從事生物制品研發(fā)工作。

2016-07-06

S 188

A

0517-6611(2016)23-097-02