王佳媚， 章建浩

(1.海南大學食品學院，海南海口 570228；2.國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，江蘇高校肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095； 3.常熟市屹浩食品包裝材料科技有限公司，江蘇常熟 215500)

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納米TiO2對雞肉源微生物的光催化抑菌效果研究

王佳媚1， 章建浩2,3*

(1.海南大學食品學院，海南?？?570228；2.國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，江蘇高校肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095； 3.常熟市屹浩食品包裝材料科技有限公司，江蘇常熟 215500)

[目的]研究不同作用因素對納米TiO2的光催化活性影響，為納米TiO2光催化殺菌技術的開發(fā)與應用提供參考。[方法] 以菌液初始濃度、光照強度和納米TiO2濃度為主要變量因素，研究不同因素條件下納米TiO2對雞肉源微生物P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用效果。[結果] 納米TiO2濃度增加對P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用呈先升高后降低的趨勢，最佳濃度值為0.4 g/L；增高光照強度，降低初始菌液濃度，納米TiO2的光催化抑菌效果增強；相同試驗條件下，納米TiO2對P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用一致，對M.caseolyticus的抑菌率始終低于P.fluorescens。[結論]M.caseolyticus對納米TiO2的光催化作用比P.fluorescens更加敏感。

納米TiO2; 光催化抑菌；M.caseolyticus；P.fluorescens

納米抑菌包裝是近幾年新興的包裝技術，此技術以納米材料的抑菌性為基礎。納米金屬氧化物納米TiO2、Fe2O3的抗菌性受到廣泛關注，納米TiO2在紫外光照下被激發(fā)產(chǎn)生活性，在常溫常壓下對微生物起作用。所以，開發(fā)光催化的納米抗菌材料，將會對抗菌包裝有重要意義。TiO2的光催化特點已經(jīng)在污水處理[1]、半導體電極應用[1]和光降解有機污染物[2]中有研究報道。

假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)是引起腐敗的主要菌屬，廣泛存在于腐敗畜禽肉[3-5]及相關制品中。已有多項研究證明，雞肉在冷凍有氧條件下貯藏主要以嗜冷菌的生長引起腐敗，其中主要的腐敗菌是假單胞菌，在其濃度達到108CFU/mL時發(fā)出典型的腐敗氣味[6]。據(jù)Arthur報道[7]，雞肉中的腐敗菌優(yōu)勢菌株以G-菌為主，只有少量的菌株屬于G+菌，球狀菌(Macrococcusspp.)是在雞肉中被發(fā)現(xiàn)的陽性菌屬之一，在鴨肉及其他禽肉中也有發(fā)現(xiàn)。目前，納米TiO2對腐敗雞肉來源菌株的光催化抑菌作用研究較少。

納米TiO2具有良好的光催化活性，在光照條件產(chǎn)生活性物質(zhì)，活性物質(zhì)與菌體作用，可引起細菌體發(fā)生變化，甚至死亡。不同的光照條件，對納米材料的活性有影響，而關于納米材料光催化抑菌的作用機理仍然存在爭議，沒有統(tǒng)一定論。筆者主要研究光照條件下納米TiO2對腐敗雞胴體中存在的革蘭氏陰性菌和陽性菌不同菌屬的抑制作用，以不同的光催化反應因素變化為主要因素，為開發(fā)適用于生鮮雞肉的非熱源殺菌包裝技術提供理論基礎和技術支撐。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與主要試劑。納米TiO2：P-25，晶體比例(銳鈦型∶金紅石= 80∶20)，粒子大小(20～30 nm),比表面積50 m2/g，購自Degussa公司；胰蛋白大豆肉湯(TSB)、胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSB)，BD Bacton，Dickinson and Company，USA；磷酸鹽緩沖液(PBS),Bio-Rad Laboratories Inc，CA，USA。

1.1.2主要儀器。85-2 型單頭磁力攪拌器，常州國華儀器有限公司；飛利浦 365 nm 紫外線燈(8 W)、LUYOR-340紫外線光強度計，上海路陽儀器有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰公司； TGL-64 高速離心機，湖南湘儀儀器有限公司；恒溫搖床，上海世平儀器有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱，上海一恒儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1雞肉腐敗菌分離。菌種分離純化方法參照Arthur等的方法從腐敗雞胴體中分離腐敗菌[7]。屠宰后除去頭、雞爪子和內(nèi)臟的未冷卻新鮮雞胴體，從屠宰線上取樣放在無菌的塑料袋中，取樣品放在干凈的取樣箱中，帶回實驗室。去掉雞脖子，待雞胴體冷卻后將袋子口輕輕封住，保持塑料袋不會完全敞開即可，包裝后一起放在4 ℃的冷庫中放置自然腐敗，10、14 d分別取樣進行菌種分離。從4 ℃冷庫中取出樣品，將整只雞胴體轉移到新的無菌塑料袋中，加入200 mL 無菌0.1%的蛋白胨溶液，封閉塑料袋，將塑料袋一起放在振蕩器中振蕩2 min。取出全部液體作為分析樣品。液體樣品使用0.1%的無菌蛋白胨溶液進行梯度稀釋，取100 μL進行平板涂布，在不同的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基種類：Fe 瓊脂培養(yǎng)基、STAA培養(yǎng)基、Pseudomonas 瓊脂培養(yǎng)基、Levine EMB 培養(yǎng)基、Staphylococcus 培養(yǎng)基，涂布之后在適宜溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，從培養(yǎng)基上挑取單菌落進行劃線培養(yǎng)，直至得到均勻的形狀一致的單一菌落，然后再繼續(xù)劃線培養(yǎng)3次，得到菌落形態(tài)一致的菌落。挑取單一菌落使用MIDI Sherlock MICROBIAL Identification system (MIS) 進行菌株鑒定。同一種培養(yǎng)基使用多個平板作為平行樣品，系統(tǒng)通過定性和定量分析細胞膜的脂肪酸，與數(shù)據(jù)庫中已知菌株進行對比分析，判斷得出細菌的菌株類型。鑒定出的菌株分別進行菌種保藏，備用。

1.2.2納米TiO2光催化抑菌反應裝置。光催化抑菌反應試驗采用自制光催化裝置在密閉箱體中進行。反應裝置主要有磁力攪拌器、紫外燈和無菌燒杯組成，反應溶液與催化劑加入無菌燒杯中，無菌燒杯放在磁力攪拌器上，用紫外燈(UVA)從上面垂直照射，光照強度根據(jù)試驗需要進行設定調(diào)節(jié)，光照強度使用數(shù)顯照度計直接測定。

1.2.3反應菌液制備。用接種環(huán)分別挑取少量P.fluorescens和M.caseolyticus菌落接種至無菌胰蛋白大豆肉湯(TSB)中，分別在適宜溫度下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)好的新鮮菌液50 mL，在6 500 r/min離心10 min，去掉上層液體培養(yǎng)基，用無菌PBS清洗菌體2次，保證徹底除去培養(yǎng)基。使用50 mL無菌PBS重新懸浮細菌體，菌懸液備用。

1.2.4光催化抑菌試驗。納米TiO2用無菌蒸餾水配成所需濃度的懸浮液，取45 mL納米TiO2懸浮液與5 mL菌懸液至250 mL無菌燒杯中，然后將燒杯放在磁力攪拌器上，置于紫外燈下照射處理。處理過程中持續(xù)攪拌，每隔一段時間取樣檢測。

1.2.5細菌菌落計數(shù)方法。取出的樣品用無菌PBS溶液進行10倍系列梯度稀釋，選擇相鄰的3個梯度進行計數(shù)培養(yǎng)，計算菌落數(shù)量變化。

取100 μL系列稀釋好的菌液在胰蛋白大豆培養(yǎng)基(TSA)進行涂布，涂布均勻的平板，置于適宜溫度下培養(yǎng)一定時間(P.fluorescens和M.caseolyticus在37 ℃培養(yǎng)24 h)，對平板上的菌落進行計數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析該試驗數(shù)據(jù)為重復數(shù)據(jù)的平均值，使用origin 9.0進行作圖和數(shù)據(jù)分析，使用SAS 8.2 進行方差分析(ANOVA)及多方差檢驗(Tukey’s multiple range test,P<0.05)

2　結果與分析

2.1TiO2濃度對P.fluorescens與M.casolyticus的光催化抑菌作用由圖1可見，納米TiO2含量為0.2 g/L 時，對P.fluorescens的抑制作用顯著低于M.caseolyticus(P< 0.05)。在150 min 內(nèi)P.fluorescens的活菌菌落數(shù)量比值(C/C0)降低至～10-3，而M.caseolyticus的比值降低至10-7。納米TiO2含量增加到0.4 g/L時，對2種細菌的抑制效果都增強，對P.fluorescens的抑制作用明顯低于M.caseolyticus(P<0.05)。150 min時，P.fluorescens的活菌菌落數(shù)量比值(C/C0)低于10-4，而M.caseolyticus的比值在90 min時低于10-5。TiO2含量增加到0.8 g/L時，對2種菌株間的光催化抑菌效果差異顯著(P< 0.05)，但低于0.4 g/L 時的效果。150 min 時P.fluorescens的活菌濃度比值降至10-4，而M.caseolyticus的值(C/C0)在90 min時已低于10-4。

不同濃度TiO2在試驗過程中都可以顯著抑制M.caseolyticus的生長(P< 0.05)，導致其濃度快速降低，150 min 內(nèi)不同濃度的TiO2都能殺死全部M.caseolyticus的生長。當濃度為0.2 g/L時，TiO2的作用效果最弱，120 min時使M.caseolyticus濃度降低至2.26 log，全部殺死細菌需要150 min。當濃度從0.2 g/L增加至0.4 g/L時，TiO2抑制全部M.caseulyticus生長的時間從150 min縮短至120 min。當濃度增大至0.8 g/L 時，TiO2對細菌的作用不再繼續(xù)增加，其作用效果與0.4 g/L時相似，到120 min時不再有細菌生長。表明在光照強度下，TiO2濃度對一定初始濃度的M.caseolyticus的抑制作用有適宜值。在0.2～0.8 g/L的范圍內(nèi)，不同濃度TiO2的作用呈先增強后減弱的趨勢。

2.2光照強度對TiO2抑菌作用由圖2可見，當光照強度為300 μW/cm2時，納米TiO2對P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌速率呈現(xiàn)不同的下降速度，P.fluorescens的活菌數(shù)量比值(C/C0)降低緩慢，其數(shù)量比值顯著高于M.caseolyticus(P<0.05)。150 min時，P.fluorescens的濃度值(C/C0)降至10-3，而M.caseolyticus的濃度值(C/C0)接近10-7。在0～30 min 時，二者的濃度值相近，從60 min開始，M.caseolyticus的濃度值快速下降，其降低速度顯著高于P.fluorescens(P< 0.05)。在120～150 min 時，P.fluorescens的濃度降低速度緩慢。

當光照強度為400 μW/cm2時，P.fluorescens的濃度比值(C/C0)150 min后降低至10-4，從90 min開始濃度降低速度放緩。M.caseolyticus的濃度值在120 min時降低至10-7。當光照強度為500 μW/cm2時，TiO2對2種細菌的光催化效果增強，對M.caseolyticus的抑菌效果顯著高于P.fluorescens(P< 0.05)。P.fluorescens的濃度比值在0～120 min 時快速下降，120～150 min時緩慢降低，150 min后濃度值低于10-5。M.caseolyticus的濃度值(C/C0)在0～90 min時下降快速，濃度低于10-6，而 90 min 時P.fluorescens的比值(C/C0)為10-3。

注：TiO2含量A為0.2 g/L， B為0.4 g/L，C為0.8 g/L；光照強度 400 μW/cm2，菌體初始濃度 107CFU/mL。Note:A.0.2 g/L; B.0.4 g/L; C.0.8 g/L.Light intensity was 400 μW/cm2，and the initial concentration of bacteria was 107CFU/mL.圖1　TiO2含量對P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用影響Fig.1　Photocatalytica inactivation effect of various concentrations of TiO2 on both P.fluorescens and M.caseolyticus

從上述3種因素的結果可以得出，相同條件下M.caseolyticus比P.fluorescens更容易被殺死，表現(xiàn)為其濃度比值快速減少，降低趨勢比P.fluorescens更明顯。相同條件下，TiO2對P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用存在差異。菌液初始濃度增加，TiO2對二者的作用差異時間延長。在相同試驗條件下，P.fluorescens的生存能力比M.caseolyticus強，不同菌屬(G-和G+)之間，細菌自身的差異可能是導致此種差異存在的主要因素。此外，也與菌體自身的修復或抵御外界環(huán)境變化的能力不同有關。

注：光照強度A為300 μW/cm2，B為400 μW/cm2，C為500 μW/cm2；TiO2含量為0.4 g/L，菌液初始濃度 107CFU/mL 。Note:A.300 μW/cm2; B.400 μW/cm2; C.500 μW/cm2.TiO2 content was 0.4 g/L，and the initial concentration of bacteria was 107CFU/mL.圖2　光照強度對P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌效果Fig.2　Photocatalytica inactivation effect of TiO2on both P.fluorescens and M.caseolyticus under various conditions of light intensity

2.3納米TiO2對不同初始濃度P.fluorescens與M.casolyticus的光催化抑菌作用由圖3可見，當初始菌液濃度為107CFU/mL時，相同試驗處理條件下，納米TiO2對P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用趨勢。M.caseolyticus的初始濃度值雖略高于P.fluorescens，反應過程中M.caseolyticus的濃度降低速率快于P.fluorescens。30～150 min時，P.fluorescens的濃度值顯著高于M.caseolyticus(P< 0.05)。90 min后M.caseoyticus的濃度降低至102CFU/mL，而P.fluorescens的濃度在150 min 時仍為103CFU/mL，120 min降低速率明顯減弱。

當初始濃度為106CFU/mL時，P.fluorescens和M.caseolyticus在150 min后檢測不到活菌生長。60 min后，M.caseolyticus的濃度降至102CFU/mL，而P.fluorescens的濃度仍高達104CFU/mL，P.fluorescens的濃度在90 min后才降低至102CFU/mL。在30～90 min時，P.fluorescens的濃度值顯著高于M.caseolyticus(P< 0.05)，90 min之后二者濃度無明顯差異(P> 0.05)。

當菌液初始濃度為105CFU/mL時，M.caseolyticus和P.fluorescens二者濃度都快速下降，在60 min內(nèi)二者濃度都降至不可檢測范圍。30 min時，M.caseolyticus的濃度降至102CFU/mL，而P.fluorescens的濃度為104CFU/mL，顯著高于M.caseolyticus(P< 0.05)。隨后30 min，P.fluorescens的濃度快速將至可檢測范圍以下。

3　結論與討論

TiO2光催化作用機制由在TiO2表面生成的自由基起作用，此作用受不同物理因素作用影響，如光照強度、TiO2用量、初始菌液濃度等[8]。該研究發(fā)現(xiàn)，G-和G+菌對所用的催化劑(TiO2)，以及光催化影響因素的反應是一致的，再次證明G-和G+2種微生物的抑菌作用機制基本一致，受作用因素的影響情況相似，如催化劑含量和光照強度對2種微生物的影響一致，此2種因素主要對·OH的產(chǎn)生起作用[9]。

注：初始濃度 A為107 CFU/mL；B.106 CFU/mL；C為105 CFU/ mL; 光照處理條件的光強 400 μW/cm2; TiO2含量0.4 g/L。Note:A.107CFU/ mL; B.106 CFU/ mL; C.105 CFU/ mL.Light intensity was 400 μW/cm2，and TiO2content was 0.4 g/L.圖3　菌液初始濃度對P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌效果Fig.3　Photocatalytica inactivation effect of TiO2on both P.fluorescens and M.caseolyticus under various initial concentrations of bacteria

光照強度不僅會影響光照過程中對菌體的作用，而且會影響光照結束后的作用，光照強度對P.fluorescens和M.caseolyticus的作用趨勢一致，隨著光照強度的升高，對2種菌株的作用增強。催化劑TiO2含量增加對2種細菌的作用都呈現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢，盡管2種菌株間的作用效果存在差異，M.caseolyticus比P.fluorescens更容易被殺死。

納米TiO2光照下能夠被激發(fā)，在表面產(chǎn)生活性自由基，自由基團對細菌體產(chǎn)生作用。根據(jù)Sunada等對于光催化機理的解釋，在材料表面產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)首先對細胞的外膜產(chǎn)生一定程度的破壞，引起膜的通透性發(fā)生改變或者是破壞，導致更多的ROS 進入胞內(nèi)膜引起細胞分解死亡[10]。因此，細菌的死亡是ROS對細胞壁膜的攻擊作用的結果，這攻擊作用是一系列的ROS攻擊作用累積的結果[11]。同時，細胞數(shù)量多少對催化劑表面產(chǎn)生的活性自由基(ROS)間存在競爭關系[12]，細菌數(shù)量越多，競爭增強。

Van Grieken認為，盡管革蘭氏陽性菌和陰性菌的結構不同，但是它們的光催化抑菌機理似乎是一致的[9]。革蘭氏陰性菌細胞壁的肽聚糖層比陽性菌薄，但是其最外層的磷脂雙分子層，使它們的抗氧化作用更加復雜[13]。有人認為革蘭氏陰性菌外層的磷脂層更加致密，使其不易受到氫氧自由基等活性物質(zhì)的攻擊[14-17]。同時，革蘭氏陽性菌具有厚細胞壁雖然不易受到氫氧自由基的攻擊，但是缺少外層的磷脂層導致其內(nèi)部的DNA類物質(zhì)容易受到破壞，從而導致其更易于死亡[9]。相反，有人認為革蘭氏陽性菌的細胞壁厚，需要更多量的氫氧自由基攻擊才能完全破壞其細胞壁[18-22]，所以革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更不易被殺死。Chung等認為，E.coli陰性菌的細胞壁比較薄，保護作用相對弱從而易于被殺死[18]。

盡管G-和G+的細胞壁不同，G-的細胞壁要復雜得多[23]，因此，如果光催化是需要對細胞壁產(chǎn)生相同的總效果，G-需要更長的氧化時間和更多的催化劑，這種說法是G+(M.caseolyticus)比G-(P.fluorescens)更容易被殺死的原因，此前已經(jīng)有類似報道[24]。但有研究表明，光催化抑菌動力學結果顯示G-比G+的更快，他們假設細胞壁結構沒有發(fā)生明顯的變化[18]。因此，光催化抑菌機理仍然存在一定爭議。

納米TiO2對P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用效果趨勢相同，菌株間存在差異，但在150 min內(nèi)，納米TiO2使M.caseolyticus和P.fluorescens菌落數(shù)量分別減少7 log和4 log。光照強度增加200 μW/cm2時，納米TiO2抑制同樣數(shù)量細菌生長所需時間縮短了近60 min，納米TiO2的最佳作用濃度為0.4 g/L。

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Photocatalytic Disinfection Effect of Nano-TiO2on Spoilage Bacteria Isolated from Chicken

WANG Jia-mei1，ZHANG Jian-hao2,3*

(1.College of food Science and Technology，Hainan University，Haikou，Hainan 570228;2.National Center of Meat Quality and Safety Control，Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control of Ministry of Agriculture,Jiangsu Innovation Center of Meat Production and Processing，College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095;3.Yihao Food Packaging Material Technology Company，Changshu，Jiangsu 215500)

[Objective] To study the effect of different factors on the photocatalytic activity of nano-TiO2to provide

for the development and application of photocatalytic decontamination technology of nano-TiO2.[Method] Photocatalytic activity of nano-TiO2was studied as main reactive parameters such as initial concentration of bacteria，light intensity and nano-TiO2concentration varied，and disinfection effects of nano-TiO2on spoilage bacteria isolated from chicken (P.fluorescensandM.caseolyticus) were studied under different conditions.[Result] The disinfection effects of nano-TiO2on bothP.fluorescensandM.caseolyticusincreased firstly and then decreased with the increase of nano-TiO2concentration，and the disinfection effects were the best when nano-TiO2concentration was 0.4 g/L; to increase the light intensity and reduce the initial concentration of bacteria were helpful to the increase in the disinfection effect of nano-TiO2.It showed a similar disinfection effect trend of nano-TiO2onP.fluorescensandM.caseolyticusunder the same conditions.The reduction rate of concentration ofM.caseolyticuswas always lower than that ofP.fluorescens.[Conclusion]M.caseolyticuswas more sensitive to the reaction of photocatalytic conditions compared withP.fluorescens.

Nano-TiO2; Photocatalytic disinfection;M.caseolyticus;P.fluorescens

海南大學科研啟動基金項目(kyqd1560)；國家中小企業(yè)創(chuàng)新基金項目(JSA9ED6Q)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目[CX(15)1049]);江蘇省國際合作項目(BZ2014034);國家科技支撐計劃項目(2015BAD16B05-05)。

王佳媚(1984- )，女，山東日照人，講師，從事肉類加工與貯藏保鮮方向的研究。*通訊作者，教授，博士，從事畜產(chǎn)品加工及食品包裝研究。

2016-06-27

S 879.2

A

0517-6611(2016)23-037-04