魏潔　胡剛　侯鳳賢　甄永占　林雅軍

[摘要]目的 探討抗氧化復(fù)合酶對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用。方法 將40只小鼠機(jī)分為4組：正常組、衰老模型組、低和高劑量復(fù)合酶組。除正常組外，小鼠每天背部皮下注射D-半乳糖100mg/（kg·d），給藥組分別飲用相應(yīng)劑量的復(fù)合酶溶液，其余組自由飲水，連續(xù)8周。檢測(cè)小鼠血清和腎組織超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量；觀察小鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化；檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果 復(fù)合酶對(duì)小鼠體重沒有影響。復(fù)合酶能夠降低衰老模型引起的血糖和膽固醇升高（P<0.05）。與正常組比較，衰老模型組小鼠血清和腎組織SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量增加（P<0.05）；與衰老模型組比較，復(fù)合酶能夠明顯增加血清和腎組織SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量（P<0.05）。復(fù)合酶能夠減輕衰老模型小鼠腎組織損傷和調(diào)控衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)論 復(fù)合酶能夠提高活性氧自由基的清除率，減輕機(jī)體損傷，延緩衰老。

[關(guān)鍵詞]復(fù)合酶；D-半乳糖；抗氧化；腎組織；衰老

[中圖分類號(hào)]R965.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616（2016）02-14-05

50多年前Harman提出了衰老的自由基理論，他認(rèn)為衰老是自由基對(duì)細(xì)胞成分和結(jié)締組織損傷的結(jié)果。這些自由基來自氧化酶催化的分子氧相關(guān)反應(yīng)。自由基清除劑可直接或間接清除體內(nèi)過多的自由基，有效阻止或防止由于過多自由基而導(dǎo)致的氧化損傷，起到保護(hù)機(jī)體延緩衰老的作用。因此，開發(fā)與研究抗氧化劑具有重要的意義。正常機(jī)體中存在針對(duì)R0s介導(dǎo)細(xì)胞損傷的抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）。其中超氧化物歧化酶（SOD）在機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中扮演著重要角色，其能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)超氧陰離子（O-）還原成HO。接下來谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）把H2O，代謝成O2和H2O。在病理?xiàng)l件下，如D-半乳糖衰老模型，機(jī)體的抗氧化能力會(huì)降低。因此有必要補(bǔ)充抗氧化酶或使用氧自由基清除劑。復(fù)合酶是遼寧未來生物科技有限公司采用具有國(guó)際先進(jìn)水平的封閉式生物萃取技術(shù)，從玉米胚芽中提取SOD、GSH-Px和CAT三種主要成分研制而成。每100克玉米胚芽提取物含有SOD 378800u、GSH-Px 288000u和CAT17800u。本實(shí)驗(yàn)在D-半乳糖衰老模型小鼠體內(nèi)觀察了復(fù)合酶的抗衰老作用。

1.材料與方法

1.1動(dòng)物

ICR系成熟小白鼠，體重（20.0±2.0）g，雌雄各半，北京維通利華動(dòng)物中心提供，合格證：SCXX（京）2002-0003。

1.2藥物與試劑

復(fù)合酶由遼寧未來生物科技有限公司提供；D-半乳糖、H&E染色試劑盒和RIPA組織裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、總膽固醇和甘油三酯檢測(cè)試劑盒由北京瑞正善達(dá)生物工程技術(shù)有限公司提供；SOD、GSH-Px和MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；10%水合氯醛北京醫(yī)院制劑室提供；蛋白酶抑制劑套裝購自sigma公司?？筍IRTl、FOX03a、p53、p21和B-actin抗體購自細(xì)胞信號(hào)通路公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀（SpectraMax 190）由美國(guó)MolecularDevices公司生產(chǎn)。奧林巴斯顯微鏡CK40由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。日立7100型全自動(dòng)生化分析儀由日本日立公司生產(chǎn)。凝膠成像儀購自美國(guó)alpha公司。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組、造模和用藥 將40只小鼠按體重隨機(jī)分為4組（每組10只）：正常組、衰老模型組、低劑量復(fù)合酶組[13g/（kg·d）]和高劑量復(fù)合酶組[26g/（kg·d）]。除正常組外，其余各組小鼠每天背部皮下注射D-半乳糖100mg/（kg·d），持續(xù)8周，正常組小鼠每天皮下注射等量的生理鹽水，低、高劑量復(fù)合酶組分別飲用40mg/mL和80mg/mL的復(fù)合酶飲料（假定20g小鼠每天飲水6mL，推算的飲料中復(fù)合酶濃度）。正常組和衰老模型組自由飲水，連續(xù)8周。

1.4.2觀察實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物行為、飲食、飲水變化 每2周觀察小鼠體重變化；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用10%水合氯醛麻醉小鼠，下腔靜脈采血，收集血清。檢測(cè)血清葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、總膽固醇（CHOD-PAP法）和甘油三酯（GPO-PAP法）含量。

1.4.3SOD、GSH和MDA含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用10%水合氯醛麻醉小鼠，下腔靜脈采血，收集血清。處死小鼠，取腎組織，制備腎組織勻漿后收集上清液，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性、二硫代二硝基苯甲酸直接法檢測(cè)GSH-Px活性、硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。

1.4.4小鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察 取各組小鼠的腎臟標(biāo)本，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，制作成4um石蠟切片，分別進(jìn)行蘇木素一伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H&E），觀察腎組織學(xué)改變。

1.4.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 每組各取50mg-80℃凍存的小鼠腎組織標(biāo)本，置于RIPA+sigma公司蛋白酶抑制劑中裂解，冰浴下勻漿，離心，取上清液BCA法測(cè)定蛋白濃度后制成蛋白含量相等的樣品，每孔上樣25uL，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。經(jīng)300mA濕轉(zhuǎn)3h后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，然后滴加SIRTl、FOX03a、p53、p21和B-actin一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍，二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3遍，膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑（Santa Cruz Biotechnology SC-2048），按照試劑說明進(jìn)行操作，結(jié)果在凝膠成像儀上照相。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析