魏潔　胡剛　侯鳳賢　甄永占　林雅軍

[摘要]目的 探討抗氧化復合酶對D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用。方法 將40只小鼠機分為4組：正常組、衰老模型組、低和高劑量復合酶組。除正常組外，小鼠每天背部皮下注射D-半乳糖100mg/（kg·d），給藥組分別飲用相應(yīng)劑量的復合酶溶液，其余組自由飲水，連續(xù)8周。檢測小鼠血清和腎組織超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量；觀察小鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化；檢測衰老相關(guān)蛋白表達水平變化。結(jié)果 復合酶對小鼠體重沒有影響。復合酶能夠降低衰老模型引起的血糖和膽固醇升高（P<0.05）。與正常組比較，衰老模型組小鼠血清和腎組織SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量增加（P<0.05）；與衰老模型組比較，復合酶能夠明顯增加血清和腎組織SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量（P<0.05）。復合酶能夠減輕衰老模型小鼠腎組織損傷和調(diào)控衰老相關(guān)蛋白的表達。結(jié)論 復合酶能夠提高活性氧自由基的清除率，減輕機體損傷，延緩衰老。

[關(guān)鍵詞]復合酶；D-半乳糖；抗氧化；腎組織；衰老

[中圖分類號]R965.1 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）02-14-05

50多年前Harman提出了衰老的自由基理論，他認為衰老是自由基對細胞成分和結(jié)締組織損傷的結(jié)果。這些自由基來自氧化酶催化的分子氧相關(guān)反應(yīng)。自由基清除劑可直接或間接清除體內(nèi)過多的自由基，有效阻止或防止由于過多自由基而導致的氧化損傷，起到保護機體延緩衰老的作用。因此，開發(fā)與研究抗氧化劑具有重要的意義。正常機體中存在針對R0s介導細胞損傷的抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）。其中超氧化物歧化酶（SOD）在機體抗氧化系統(tǒng)中扮演著重要角色，其能夠?qū)⒓毎麅?nèi)超氧陰離子（O-）還原成HO。接下來谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）把H2O，代謝成O2和H2O。在病理條件下，如D-半乳糖衰老模型，機體的抗氧化能力會降低。因此有必要補充抗氧化酶或使用氧自由基清除劑。復合酶是遼寧未來生物科技有限公司采用具有國際先進水平的封閉式生物萃取技術(shù)，從玉米胚芽中提取SOD、GSH-Px和CAT三種主要成分研制而成。每100克玉米胚芽提取物含有SOD 378800u、GSH-Px 288000u和CAT17800u。本實驗在D-半乳糖衰老模型小鼠體內(nèi)觀察了復合酶的抗衰老作用。

1.材料與方法

1.1動物

ICR系成熟小白鼠，體重（20.0±2.0）g，雌雄各半，北京維通利華動物中心提供，合格證：SCXX（京）2002-0003。

1.2藥物與試劑

復合酶由遼寧未來生物科技有限公司提供；D-半乳糖、H&E染色試劑盒和RIPA組織裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、總膽固醇和甘油三酯檢測試劑盒由北京瑞正善達生物工程技術(shù)有限公司提供；SOD、GSH-Px和MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；10%水合氯醛北京醫(yī)院制劑室提供；蛋白酶抑制劑套裝購自sigma公司?？筍IRTl、FOX03a、p53、p21和B-actin抗體購自細胞信號通路公司。

1.3實驗儀器

酶標儀（SpectraMax 190）由美國MolecularDevices公司生產(chǎn)。奧林巴斯顯微鏡CK40由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。日立7100型全自動生化分析儀由日本日立公司生產(chǎn)。凝膠成像儀購自美國alpha公司。

1.4方法

1.4.1動物分組、造模和用藥 將40只小鼠按體重隨機分為4組（每組10只）：正常組、衰老模型組、低劑量復合酶組[13g/（kg·d）]和高劑量復合酶組[26g/（kg·d）]。除正常組外，其余各組小鼠每天背部皮下注射D-半乳糖100mg/（kg·d），持續(xù)8周，正常組小鼠每天皮下注射等量的生理鹽水，低、高劑量復合酶組分別飲用40mg/mL和80mg/mL的復合酶飲料（假定20g小鼠每天飲水6mL，推算的飲料中復合酶濃度）。正常組和衰老模型組自由飲水，連續(xù)8周。

1.4.2觀察實驗期間動物行為、飲食、飲水變化 每2周觀察小鼠體重變化；實驗結(jié)束時，用10%水合氯醛麻醉小鼠，下腔靜脈采血，收集血清。檢測血清葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、總膽固醇（CHOD-PAP法）和甘油三酯（GPO-PAP法）含量。

1.4.3SOD、GSH和MDA含量檢測 實驗結(jié)束時，用10%水合氯醛麻醉小鼠，下腔靜脈采血，收集血清。處死小鼠，取腎組織，制備腎組織勻漿后收集上清液，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性、二硫代二硝基苯甲酸直接法檢測GSH-Px活性、硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

1.4.4小鼠腎組織形態(tài)學觀察 取各組小鼠的腎臟標本，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，制作成4um石蠟切片，分別進行蘇木素一伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H&E），觀察腎組織學改變。

1.4.5Western blot檢測蛋白表達水平 每組各取50mg-80℃凍存的小鼠腎組織標本，置于RIPA+sigma公司蛋白酶抑制劑中裂解，冰浴下勻漿，離心，取上清液BCA法測定蛋白濃度后制成蛋白含量相等的樣品，每孔上樣25uL，進行SDS-PAGE電泳。經(jīng)300mA濕轉(zhuǎn)3h后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，然后滴加SIRTl、FOX03a、p53、p21和B-actin一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍，二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3遍，膜上滴加化學發(fā)光增強劑（Santa Cruz Biotechnology SC-2048），按照試劑說明進行操作，結(jié)果在凝膠成像儀上照相。

1.5統(tǒng)計學分析