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        響應面法優(yōu)化魚尾鰭抗氧化肽酶解工藝

        2016-09-29 00:49:44蘇現(xiàn)波王更先
        關(guān)鍵詞:尾鰭多肽底物

        蘇現(xiàn)波 王更先

        (邯鄲學院,河北 邯鄲 056005)

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        響應面法優(yōu)化魚尾鰭抗氧化肽酶解工藝

        蘇現(xiàn)波王更先

        (邯鄲學院,河北 邯鄲 056005)

        對酶解法制備魚尾鰭抗氧化肽的最佳工藝進行探討,以期為豐富魚尾鰭應用領(lǐng)域,開發(fā)高附加值水產(chǎn)品提供理論依據(jù)。以羥自由基清除率為評價指標,通過響應面分析得到最佳酶解工藝為:底物濃度15%(w/v),酶解pH=8.403,溫度54.02℃,加酶量0.6%(w/w),酶解時間3 h。在此最優(yōu)條件下制備的魚尾鰭抗氧化肽產(chǎn)物對羥自由基的清除率為82.09%,與理論值相比相對誤差為1.38%。同時測得此酶解條件下,魚尾鰭多肽得率為31.68%。

        魚尾鰭;抗氧化肽;酶解;羥自由基;響應面法

        我國是世界上主要的漁業(yè)生產(chǎn)國,但魚類加工會產(chǎn)生大量的下腳料,包括魚頭、魚骨、內(nèi)臟和魚尾鰭等,約占原料魚的40%~55%[1]。據(jù)統(tǒng)計,2003年我國魚類加工的廢棄物總量就達到200萬噸以上。目前,發(fā)達國家的水產(chǎn)品加工率在80%以上,而我國的水產(chǎn)品加工率不足30%[2]。這些下腳料中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素,還含有多種活性物質(zhì)。因此合理開發(fā)利用這些低值水產(chǎn)品下腳料具有一定的經(jīng)濟效益和社會意義。

        魚尾鰭中粗蛋白含量高達40%左右[3],可作為優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)蛋白的來源。目前工業(yè)上只是將魚尾鰭加工成飼料魚粉,或是作為廢料處理,造成資源的極大浪費和環(huán)境污染。魚類多肽不僅具有魚類蛋白質(zhì)的優(yōu)點,在功能特性與生物活性方面又得到極大的改善,具有良好的溶解性、熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)以及易消化吸收、抗氧化活性、降血壓活性等生理功能[4],近年來得到國內(nèi)外學者的研究和推崇[5~7]。因此本文采用酶解方法制備魚尾鰭抗氧肽,利用單因素實驗和響應面分析優(yōu)化得到最佳酶解工藝,最終獲得高得率和抗氧化性的魚尾鰭酶解產(chǎn)物,從而為魚尾鰭的開發(fā)利用提供理論依據(jù),減少環(huán)境污染并提高水產(chǎn)品加工的附加值。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        魚尾鰭(邯鄲市菜市場);堿性蛋白酶(BR 南寧東恒華道生物科技有限責任公司);牛血清白蛋白(BR 上海如吉生物科技有限發(fā)展公司);Tris試劑(GR Sigma);福林酚試劑(BR 國藥集團);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、硼砂、硫酸銅、酒石酸鈉、硫酸鈉、鹽酸、抗壞血酸、鄰苯三酚、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫(AR 國藥集團)。

        1.2 儀器與設(shè)備

        JA3003B型電子天平(上海精天電子儀器有限公司);SHZ-B水浴恒溫震蕩器(上海將任實驗設(shè)備有限公司);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海將任實驗設(shè)備有限公司);PHS-25數(shù)顯酸度計(杭州雷磁分析儀器廠);JYL-C022型九陽料理機(九陽股份有限公司);5810型臺式高速離心機(德國艾本德股份公司);FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);722可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 原料預處理

        將魚尾鰭剔除魚肉洗凈后冷凍干燥,打成粉備用。

        1.3.2 魚尾鰭中各組分的含量分析

        蛋白質(zhì)測定:GB/T5009.5—2010 凱氏定氮法;灰分測定:GB/T5009.4-2010 灼燒法;水分測定:GB/T5009.3-2010 干燥法;脂肪測定:氯仿-甲醇法[8];總糖測定:蒽酮比色法[9]。

        1.3.3 魚尾鰭抗氧化肽的制備

        稱取15 g魚尾鰭粉末,加入250 mL具塞三角瓶中,加入一定量去離子水,使其底物濃度為15%(w/v),攪拌均勻,調(diào)節(jié)溶液pH=9.0,60℃下水浴震蕩30 min后加入0.6%堿性蛋白酶開始水解,待酶解3 h后快速于99℃滅活10 min,冷卻后9800 r/min離心28 min,去除上清液中微量油脂及底部沉淀,收集中間部位清液備用。

        1.3.4 堿性蛋白酶單因素實驗

        按照1.3.3魚尾鰭抗氧化肽制備方法,分別考察底物濃度、pH、溫度、加酶量和酶解時間五種因素[10]對魚尾鰭抗氧化肽多肽得率和抗氧化活性的影響。

        各因素水平分別為:底物濃度:5%、10%、15%、20%、25%;pH:7.0、8.0、9.0、10.0;酶解溫度:40℃、50℃、60℃、70℃;加酶量: 0.2%、0.6%、1.0%、1.4%(w/w);酶解時間:2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

        1.3.5 多肽得率的測定

        牛血清白蛋白對照品溶液:精確稱量2.5 mg牛血清白蛋白,用蒸餾水定容于25 mL容量瓶。

        標準曲線的制備:精密移取對照品溶液0.0 mL,0.5 mL,1 mL,1.5 mL,2 mL,分別置于具塞試管中,各加水至2.0 mL。再分別加入5 mL試劑C(VA液:VB液=1:50;A液為0.5 g硫酸銅和1.0 g酒石酸鈉溶于100 mL蒸餾水中,B液為20.0 g碳酸鈉和4.0 gNaOH溶解于1 L蒸餾水),混勻于室溫下放置10 min后,各加入0.5 mL試劑D(Folin-酚試劑),立即混勻,室溫下放置30 min,然后于750 nm處測定其吸光度值。同時以0號管為空白,對照品溶液濃度為橫坐標,其相對應的吸光度為縱坐標,計算線性回歸方程。

        樣品的測定:量取1.0 mL酶解液,依標準曲線的制備方法,測出酶解液在750 nm處的吸光度值。并計算多肽得率(%)。

        式中:c為由標準曲線計算得到的多肽提取液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為多肽提取液的體積(mL);m為樣品粉質(zhì)量(mg)。

        1.3.6 抗氧化性的測定

        方法測定對羥自由基的清除效率[11]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 魚尾鰭中各基本組分的分析結(jié)果

        多數(shù)魚類的蛋白質(zhì)含量可達18%~20%,高于肉、禽、蛋、奶的蛋白質(zhì)含量[12]。由表1可以看出,該魚尾鰭主要成分為蛋白質(zhì),含量為18.96%,與魚肉蛋白質(zhì)含量相近。經(jīng)冷凍干燥后,魚尾鰭粉末中蛋白質(zhì)含量則接近47%。

        表1 魚尾鰭中各基本組成成分(%)

        2.2 單因素實驗

        2.2.1 底物濃度

        如圖1所示,隨著底物濃度的增加,多肽得率和羥自由基清除率都表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。當?shù)孜餄舛容^低時,酶與底物接觸幾率小,酶解程度較弱,導致其產(chǎn)生的多肽較少。隨著底物濃度的增加,多肽得率也隨之增加。當?shù)孜餄舛葹?0%時,其多肽得率達到最高。若底物濃度繼續(xù)增加,多肽得率反而下降,其原因是該體系底物濃度增加導致溶液黏度提高,因此降低體系中底物和蛋白酶的反應接觸能力,從而抑制酶解作用。從圖1還可得知,當?shù)孜餄舛葹?5%時,羥自由基清除率達到最大值。

        2.2.2 pH

        pH通過影響酶的穩(wěn)定性、酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物,從而影響酶的催化效果[13],因此pH是酶解反應的重要因素之一。結(jié)果如圖2所示??梢钥闯?,在pH7.0~8.0范圍,多肽得率和羥自由基清除率隨pH上升而增加。在超過pH 9后則呈現(xiàn)下降趨勢。考慮到實驗所用酶為堿性蛋白酶,故選擇pH范圍8.0~10.0。

        2.2.3 溫度

        溫度對酶的穩(wěn)定性及反應速率皆有一定影響。酶解溫度過高則會破壞蛋白酶特定空間構(gòu)象,從而破壞蛋白酶活性中心,降低其活性;若酶解溫度過低,則降低酶解體系內(nèi)的分子運動,使底物和酶活性分子的碰撞幾率降低[14]。酶解溫度對多肽得率及羥自由基清除率的影響如圖3所示。隨著酶解溫度升高,多肽得率和羥自由基消除率呈先升高后下降的趨勢。在55℃~60℃時,多肽得率和羥自由基消除率較高。當溫度高于60℃時,兩者反而下降,可能是由于溫度升高導致蛋白酶結(jié)構(gòu)改變,活性降低。因此,在后續(xù)實驗中,選擇酶解溫度為不高于60℃。

        2.2.4 加酶量

        由圖4可知,隨著加酶量的增加,多肽得率和羥自由基清除率逐漸增加。當加酶量高于0.6%時,加酶量對多肽得率和羥自由基清除率均不再有顯著影響。說明當加酶量為0.6%時,酶分子與底物的結(jié)合已達到飽和。因此在酶解實驗中,確定最佳加酶量為0.6%。

        2.2.5 酶解時間

        由圖5可知,酶解前3h內(nèi),多肽得率和羥自由基清除率隨酶解時間增加逐步上升。酶解時間長于3h時,酶解時間不再對多肽得率有顯著影響,而羥自由基清除率降低,可能是隨著酶解時間延長,部分具有抗氧化活性的多肽被繼續(xù)水解導致抗氧化性降低。因此,本實驗確定堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的較優(yōu)反應時間為3h。

        2.3 響應面

        根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果,確定使用堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的基本工藝參數(shù),下一步以抗氧化活性即羥自由基的清除率為評價指標,利用響應面分析法對酶解反應進行優(yōu)化。

        在單因素實驗的分析結(jié)果基礎(chǔ)上,采用三因素三水平的Box-Behnken響應面的設(shè)計方法,選擇底物濃度、酶解pH以及溫度這三個相對來說影響較大的因素進行響應面試驗,試驗因素水平的設(shè)計見表2[15,16]。

        表2 Box-Behnken響應面試驗設(shè)計因素水平

        2.3.1 響應面分析設(shè)計及結(jié)果

        以底物濃度、pH以及反應溫度為自變量的三因素三水平試驗共17組,經(jīng)軟件Design Expert 8.05設(shè)計Box-Behnken響應面試驗設(shè)計因素水平,具體試驗設(shè)計及結(jié)果如表3和表4所示。

        表3 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

        表4 回歸模型的方差分析

        通過軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,得到回歸方程為:

        Y=68.80+3.90A-4.47B+3.10C-9.56AB-2.39BC+5.73A2-5.63C2。

        由表4可知,該模型的P=0.0117<0.05,失擬性在α=0.05水平上不顯著(P=0.2682>0.05),表明該模型差異顯著,能正確反映魚尾鰭酶解過程中底物濃度、酶解pH以及反應溫度之間的關(guān)系。

        2.3.2 各因素交互作用分析

        各因素對羥自由基清除率影響的響應曲面圖如圖6~8所示。由圖可看出,隨pH(B)和反應溫度(C)的增加,羥自由基的清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。從圖6可知,在固定的酶解pH下,隨著底物濃度的增大,羥自由基的清除率先緩慢提高后逐漸減??;而在反應溫度一定時,羥自由基的清除率隨底物濃度的增加而增加(如圖7所示)。比較三個因素的兩兩交互作用圖,A(底物濃度)與B(酶解pH)的交互作用對羥自由基清除率的影響較大,表現(xiàn)為在選定的取值區(qū)間內(nèi)曲面響應值變化大,這與回歸模型方差分析中的AB項P<0.01結(jié)果一致。

        2.3.3 回歸模型的驗證試驗

        經(jīng)軟件Design Expert 8.05優(yōu)化后,分析得到最佳的實驗參數(shù)為:底物濃度為15%(w/v),酶解為pH=8.403,反應溫度為54.02℃。對最佳方案進行驗證,測得羥自由基清除率為82.09%,與理論預測的最大值83.2432%相比,相對誤差為1.38%,說明該模型可較好的預測堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的反應條件和羥自由基清除率的關(guān)系,同時也證明響應面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解魚尾鰭制備抗氧化肽工藝參數(shù)的科學性和可行性,此酶解條件下測得多肽得率為31.68%。

        3 結(jié)論

        選用堿性蛋白酶對魚尾鰭進行酶解,以多肽得率和對羥自由基的清除率為指標,采用單因素實驗和響應面分析優(yōu)化對酶解魚尾鰭的主要影響因素底物濃度、pH、溫度、加酶量和酶解時間進行優(yōu)化,并建立了基于魚尾鰭抗氧化肽酶解條件的優(yōu)化模型。試驗結(jié)果表明:底物濃度15%,pH=8.403,反應溫度54.02℃,加酶量0.6%,酶解時間3h,酶解產(chǎn)物的抗氧化性最佳,對羥自由基清除率為82.09%,與預測值相比相對誤差為1.38%,表明該模型可較好的預測堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的反應條件和羥自由基清除率的關(guān)系。該研究為魚尾鰭的開發(fā)利用提供理論依據(jù),可減少環(huán)境污染并提高水產(chǎn)品加工的附加值。

        參考文獻

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        [責任編校:張彩紅]

        2016-03-22

        邯鄲市科技局科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(1422104057-4)。

        蘇現(xiàn)波,男,河北邯鄲人,邯鄲學院講師。

        TS254.9

        A

        1009-5462(2016)01-0053-07

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