袁志輝蔣瓊鳳

(1. 湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 永州　425199；2. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州　425199)

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內(nèi)部沸騰法提取七葉一枝花皂苷的工藝優(yōu)化

袁志輝1,2蔣瓊鳳1,2

(1. 湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 永州425199；2. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州425199)

ofScienceandEngineering,Yongzhou,Hunan425199,China)

為提高藥用成分皂苷的提取得率，合理有效開(kāi)發(fā)七葉一枝花藥材，以乙醇濃度、溫度、料液比和提取時(shí)間為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，確定各因素的最佳水平。在該基礎(chǔ)上，采用基于Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化，得到最佳提取工藝為：乙醇濃度39%、水浴溫度86 ℃、提取時(shí)間5.5 min。在該條件下，七葉一枝花中皂苷提取得率達(dá)11.02%。內(nèi)部沸騰法提取七葉一枝花中皂苷具有簡(jiǎn)便、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。

七葉一枝花；皂苷；內(nèi)部沸騰法

七葉一枝花(Rhizomaparidis)，為百合科重樓屬多年生草本植物，藥用價(jià)值高[1-3]，其藥用部分為根莖，有小毒?，F(xiàn)代藥理研究[4-5]表明：七葉一枝花根莖具有止血、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗真菌等多種生理活性，已成為著名中成藥如云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥片等產(chǎn)品的主要原料[6]，其主要活性成分為甾體皂苷[7]。

對(duì)七葉一枝花皂苷的提取工藝研究目前還較少，在僅有的兩篇文獻(xiàn)[8-9]中報(bào)道均采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行研究，提取方法為酶酵解—微波助提—雙相酸水解聯(lián)合技術(shù)[8]和浸漬法[9]。該兩種方法均有各自的不足，前者操作過(guò)程較復(fù)雜，后者的提取劑用量大。內(nèi)部沸騰法是一種在低溫條件下快速?gòu)?qiáng)化植物有效成分的提取方法，具有收率高、產(chǎn)品雜質(zhì)少及容易實(shí)現(xiàn)等[10]優(yōu)點(diǎn)。此外，正交試驗(yàn)法試驗(yàn)次數(shù)較多，周期較長(zhǎng)，而且不能從整個(gè)區(qū)域的水平上找到因素的最佳組合，響應(yīng)面法一定程度上能滿足這些要求，其在多酚等的提取中已得到廣泛的應(yīng)用[11-12]。本研究擬利用響應(yīng)面優(yōu)化內(nèi)部沸騰法提取七葉一枝花皂苷，旨在提高藥用成分的提取得率，為合理有效開(kāi)發(fā)七葉一枝花藥材提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

七葉一枝花：永州恒康藥品零售連鎖有限公司馨雅堂連鎖分店；

重樓皂苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品：≥99%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；

95 %乙醇、甲醇、高氯酸等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV2800型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

電子分析天平：AUY120型，島津國(guó)際貿(mào)易公司；

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：TGL-16M型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-1001-VN型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

超聲波提取儀：SY-150型，上海寧商超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱(chēng)取重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌?0.000 mg，用適量的甲醇溶解定容至25 mL，搖勻，分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL于干凈試管中，60 ℃水浴揮干溶劑，各加入高氯酸5 mL，密封，搖勻后置于65 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，取出冷卻至室溫，以高氯酸為空白溶液，在波長(zhǎng)407 nm處測(cè)定吸光度[13]。

1.3.2內(nèi)部沸騰法提取七葉一枝花皂苷將2.00 g七葉一枝花粉末置于100 mL燒杯中，加入適量的80%乙醇解析劑，在功率為150 W的超聲波提取器中保持20 min，溫度控制在25 ℃，使乙醇解析劑充分滲透到細(xì)胞組織中，然后加入溫度高于解析劑沸點(diǎn)的乙醇，于恒溫水浴中提取一定時(shí)間后再抽濾[14]。濾渣以相同條件再提取一次，合并濾液，經(jīng)減壓濃縮至無(wú)醇味，用蒸餾水定容至100 mL，再用等體積的水飽和正丁醇萃取二次，合并正丁醇萃取液，經(jīng)減壓蒸餾至無(wú)液體流出，回收正丁醇，后用乙醚洗滌，抽濾，沉淀即為總皂苷。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定皂苷含量。

1.3.3七葉一枝花總皂苷提取條件優(yōu)化在其它條件固定的情況下，分別考察乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間對(duì)七葉一枝花皂苷得率的影響。

(1) 乙醇濃度對(duì)皂苷提取的影響：設(shè)置乙醇濃度梯度為20%，30%，40%，50%和60%，在料液比1∶24(g/mL)、溫度85 ℃條件下提取5 min，考察乙醇濃度對(duì)皂苷得率的影響。

(2) 水浴溫度對(duì)皂苷提取的影響：設(shè)置水浴溫度梯度為75，80，85，90，95 ℃，在料液比1∶24(g/mL)、30%乙醇條件下提取5 min，考察水浴溫度對(duì)皂苷得率的影響。

(3) 料液比對(duì)皂苷提取的影響：設(shè)置料液比梯度為1∶8，1∶16，1∶24，1∶32，1∶40(g/mL)，用30%乙醇在水浴溫度85 ℃條件下提取5 min，考察料液比對(duì)皂苷得率的影響。

(4) 提取時(shí)間對(duì)皂苷提取的影響：設(shè)置提取時(shí)間梯度為3，5，7，9，11 min，用30%乙醇在水浴溫度85 ℃、料液比1∶24(g/mL)條件下，考察提取時(shí)間對(duì)皂苷得率的影響。

在此基礎(chǔ)上，選擇對(duì)七葉一枝花皂苷提取有顯著影響的3個(gè)因素，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[15]進(jìn)一步優(yōu)化，確定內(nèi)部沸騰提取七葉一枝花皂苷的最佳條件。

1.3.4樣品液皂苷的測(cè)定取適量樣品用甲醇溶解，并定容至25 mL的容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法在407 nm處測(cè)定吸光度，并以式(1)計(jì)算皂苷提取得率。

(1)

式中：

R——皂苷提取得率，%；

C——皂苷質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——七葉一枝花皂苷提取液的體積，mL；

N——稀釋的倍數(shù)；

M——七葉一枝花樣品質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1重樓皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以重樓皂苷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)，得回歸線方程為：y=10.3x-0.002，R2=0.998 9。

圖1　重樓皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2提取因素對(duì)總皂苷得率的影響

由圖2(a)可知，乙醇濃度的提高有利于皂苷的浸出，40%時(shí)達(dá)到最大值，之后皂苷提取得率反而降低?？赡苁翘崛舛冗^(guò)低，皂苷溶解度最小，提取不充分；而提取劑濃度過(guò)高，與物料內(nèi)部解析劑濃度差縮小，內(nèi)部沸騰強(qiáng)度可能降低，皂苷擴(kuò)散較慢，提取得率也下降。

由圖2(b)可知，總皂苷提取得率隨水浴溫度升高而上升，在85 ℃時(shí)提取得率最高，之后逐漸下降。溫度是內(nèi)部沸騰法的重要因素，濃度為80%的乙醇在常壓下的沸點(diǎn)約為82.4 ℃，當(dāng)水浴溫度高于此沸點(diǎn)時(shí)，物料內(nèi)部的乙醇沸騰，分子擴(kuò)散較快，提取效果好，但當(dāng)溫度超過(guò)85 ℃時(shí)，物料的內(nèi)外部均能產(chǎn)生沸騰，使對(duì)流擴(kuò)散在很短時(shí)間內(nèi)就結(jié)束，相當(dāng)于縮短了提取時(shí)間，提取得率反而下降。當(dāng)提取溫度低于解吸劑沸點(diǎn)時(shí)，物料內(nèi)部不能發(fā)生沸騰，分子擴(kuò)散較慢，在較短時(shí)間內(nèi)提取不完全，故提取效果不好。

由圖2(c)可知，總皂苷提取得率隨著乙醇用量的增加而升高，在乙醇體積為48 mL時(shí)，提取得率最大，之后乙醇用量的增加對(duì)皂苷提取得率無(wú)影響，因此最適料液比為1∶24(g/mL)，后續(xù)試驗(yàn)不再考察料液比因素。

由圖2(d)可知，在5 min內(nèi)，皂苷提取得率急劇增加，5 min時(shí)，總皂苷得率最高，之后提取得率逐漸下降。內(nèi)部沸騰過(guò)程提取速度相當(dāng)快，物料內(nèi)部沸騰過(guò)程中，分子運(yùn)動(dòng)方式為對(duì)流擴(kuò)散，其速度比普通條件下快100倍，故內(nèi)部沸騰提取時(shí)間相當(dāng)短。此外，皂苷的熱穩(wěn)定性較差，若高溫下提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，皂苷結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞導(dǎo)致提取得率下降。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

選擇皂苷提取得率影響較大的3個(gè)因素乙醇濃度、提取時(shí)間、水浴溫度作三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體方案及結(jié)果見(jiàn)表1、2。

圖2　提取條件對(duì)總皂苷得率的影響

利用Design-Expert 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到皂苷提取得率對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、水浴溫度的模型為：

Y=10.91-0.33A+0.17B+0.58C+0.085AB-0.30AC-0.16BC-0.71A2-0.17B2-0.68C2。

(2)

模型方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，模型的F=2 641.84，P<0.000 1，表明二次多元回歸模型極其顯著。三因素及交互項(xiàng)、二次項(xiàng)的P值均小于0.000 1，說(shuō)明乙醇濃度、提取時(shí)間、水浴溫度三因素及其交互項(xiàng)、二次項(xiàng)都具有顯著性影響；缺失項(xiàng)F值=2.13，P=0.238 7>0.05，模型失擬不顯著；決定因素R2=0.999 7，說(shuō)明該模型擬合度較好，誤差小，能較好地反應(yīng)響應(yīng)值的變化。

圖3分別表示在固定水浴溫度85 ℃、提取時(shí)間5 min及乙醇濃度為40%條件下，乙醇濃度與提取時(shí)間、乙醇濃度與水浴溫度、提取時(shí)間與水浴溫度交互作用對(duì)皂苷提取得率的影響。結(jié)果表明：當(dāng)乙醇濃度和提取時(shí)間都固定時(shí)，皂苷提取得率隨著溫度的變化幅度較大，故水浴溫度對(duì)提取得率影響最大。通過(guò)最優(yōu)分析，得到各因素最佳水平為：乙醇濃度38.67%、提取時(shí)間5.44 min、水浴溫度86.11 ℃，預(yù)測(cè)皂苷提取得率為11.07%。因?qū)嶋H操作的局限性，將提取工藝修改為乙醇濃度39%、水浴溫度86 ℃、提取時(shí)間5.5 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，3次實(shí)驗(yàn)取平均值為11.03%，與預(yù)測(cè)值基本相符。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3　回歸模型方差分析

圖3　因素交互作用對(duì)皂苷提取得率影響的響應(yīng)面圖

3　結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析對(duì)內(nèi)部沸騰法提取七葉一枝花皂苷的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)建立影響提取得率的二次多項(xiàng)模型，得到了七葉一枝花皂苷的最佳提取條件為乙醇濃度39%、水浴溫度86 ℃、提取時(shí)間5.5 min。經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下七葉一枝花中總皂苷提取得率為11.03%，與預(yù)測(cè)值相符，證實(shí)該模型準(zhǔn)確，適用于七葉一枝花皂苷提取的分析和預(yù)測(cè)。可為更加科學(xué)合理地開(kāi)發(fā)和應(yīng)用七葉一枝花提供了重要的數(shù)據(jù)參考和方法支撐。此外，該領(lǐng)域還有更大的研究空間和價(jià)值，如改變提取劑，利用正丁醇萃取法進(jìn)行總皂苷的提取以進(jìn)一步優(yōu)化工藝；或者從提取得到的總皂苷中進(jìn)一步分離單體皂苷，并研究其生理活性等。

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Optimization on saponin extraction from Rhizoma paridis by inner ebullition

YUAN Zhi-hui1,2JIANGQiong-feng1,2

(1.KeyLaboratoryofComprehensiveUtilizationofAdvantagePlantsResourcesinHunanSouth,Yongzhou,Hunan425199,China; 2.CollegeofChemistryandBioengineering,HunanUniversity

In order to improve the unit yields of medicinal components, and provide a scientific basis for effective exploring ofRhizomaparidis, single factor experiments were combined with inner ebullition and response surface methods to extract the saponin fromRhizomaparidis. Based on the single factor experiments of ethanol concentration, temperature, liquid feed ratio, and extraction time, the best levels of all factors were established. The extraction conditions were optimized by the Box-Behnken design and the optimum conditions were as follows: 39% of ethanol concentration, 86 ℃ of extraction temperature, and 5.5 min of extraction time. The yield of saponin extracted under the optimal conditions reached 11.02%. The present strategy is simple, rapid and efficient.

Rhizomaparidis; saponin; Inner ebullition

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2014NK3002)；湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(編號(hào)：XNZW14C05)；永州市科技局項(xiàng)目(編號(hào)：2015[10])

袁志輝，男，湖南科技學(xué)院講師，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士研究生。

蔣瓊鳳(1982—)，女，湖南科技學(xué)院高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士。

E-mail: jiangxinyi477@sohu.com

2016—05—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.043