王建輝 王　秀 王發(fā)祥 李向紅 俞　健 靳　娜 劉永樂

(長沙理工大學(xué)湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙　410114)

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冷藏條件下帶蓬鮮蓮優(yōu)勢腐敗菌鑒定及其消長規(guī)律研究

王建輝 王秀 王發(fā)祥 李向紅 俞健 靳娜 劉永樂

(長沙理工大學(xué)湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙410114)

通過稀釋平板法分離4 ℃條件貯藏18 d的帶蓬鮮蓮腐敗菌，提取篩選菌株DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用細(xì)菌16S rDNA菌種鑒定法對(duì)優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行鑒定，并分析其4 ℃冷藏過程中的消長規(guī)律。結(jié)果表明，帶蓬鮮蓮4 ℃冷藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌主要為分散泛菌(Pantoeadispersa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)、成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)。且4 ℃貯藏期間，分散泛菌、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的變化趨勢大體相同，適應(yīng)期后呈增長趨勢，成團(tuán)泛菌變化規(guī)律不明顯。

鮮蓮；冷藏；優(yōu)勢腐敗菌；分離鑒定；消長規(guī)律

鮮蓮營養(yǎng)豐富，味道鮮美，口感甜脆[1]，具有益心、補(bǔ)腎、健脾、止瀉和安神等多重功效[2-4]，但常溫下易軟化皺縮，貨架期3～6 d，采后低溫4 ℃帶蓬貯藏也僅能維持15 d[5]。鮮蓮在采摘、運(yùn)輸、加工及貯藏過程中極易腐敗變質(zhì)，喪失其原有的鮮食風(fēng)味，直接影響其感官品質(zhì)及食用價(jià)值，極大限制了鮮食蓮子的銷售和消費(fèi)者的需求。研究[6]表明，微生物活動(dòng)是引起果蔬腐敗變質(zhì)的主要原因之一，果蔬常見腐敗菌有：沙門氏菌(Salmonella)、假單胞菌(Pseudomonasspp)、李斯特菌(Listeria)、黃單胞菌(Xanthomonas)等[7]，對(duì)蓮子危害最大的微生物主要是曲霉屬和青霉屬霉菌[8]。目前國內(nèi)外鮮蓮研究處于起步階段，有關(guān)鮮蓮優(yōu)勢腐敗菌分離鑒定研究尚無報(bào)道。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，細(xì)菌的分類鑒定從傳統(tǒng)的表型、生理生化分類深入到各種基因型分類水平，如質(zhì)粒圖譜、限制性片段長度多態(tài)性分析、PCR 指紋圖、16S rRNA 序列分析等技術(shù)[9-10]。16S rDNA 序列分析技術(shù)在一定程度上克服了傳統(tǒng)表型、生理生化指標(biāo)鑒定微生物的局限性，能簡便、快速準(zhǔn)確地鑒定微生物[11-12]。

本研究以帶蓬鮮蓮為研究對(duì)象，通過16S rDNA 序列分析技術(shù)初步鑒定低溫貯藏下帶蓬鮮蓮的主要優(yōu)勢腐敗菌，并分析其優(yōu)勢菌的消長變化規(guī)律，對(duì)進(jìn)一步監(jiān)控和靶向抑制鮮蓮品質(zhì)變化以及鮮蓮低溫貯藏新技術(shù)的開發(fā)，提高其貯藏品質(zhì)，延長貨架期均具有很好的理論價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮蓮蓬：由湖南省湘潭縣湘蓮種植基地提供；

PCA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

Folin酚試劑、NaCl、異戊醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；

瓊脂糖：電泳級(jí)，生工生物工程上海股份有限公司；

Tris-乙酸-EDTA：電泳級(jí)，北京索萊寶生物科技有限公司；

溴化乙錠(EB)、PCR試劑等：電泳級(jí)，美國sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

電子分析天平：AUY120型，日本島津公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：DY01-13-44-00型，上海東亞力容器制造有限公司；

超聲波清洗器：KQ-500B型，昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司；

搖床：ZHWY-100C型，上海智城公司；

生化培養(yǎng)箱：DZX180型，上海艾測電子科技有限公司；

顯微鏡：BH-2型，日本Olympus公司；

PCR儀：T100型，美國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1鮮蓮原料處理新鮮蓮蓬在低溫條件下快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。選取成熟度一致、大小均勻、無病蟲害和機(jī)械損傷的帶蓬鮮蓮樣品于RH(相對(duì)濕度)65%～70%，溫度4 ℃恒溫條件下貯藏。

1.3.2優(yōu)勢菌落的確定根據(jù)王建輝等[5]的研究，帶蓬鮮蓮貨架期為15 d，18 d時(shí)蓮蓬表面菌斑明顯增多，質(zhì)地明顯變軟，感官品質(zhì)明顯下降。故取貯藏18 d的帶蓬鮮蓮樣品，在超凈環(huán)境下，于無菌的組織搗碎機(jī)中搗碎，準(zhǔn)確稱取搗碎后的蓮肉樣品10.00 g于250 mL無菌的錐形瓶中，注入90 mL無菌生理鹽水，振蕩30 min。然后取1 mL進(jìn)行10倍梯度稀釋，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇3個(gè)適合的稀釋度傾注平板，平行3份，36 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。并通過肉眼觀察，記錄各個(gè)稀釋度的菌落特征，并將數(shù)量最多的4～5種菌落視為優(yōu)勢菌。

1.3.3優(yōu)勢菌的分離純化挑選1.3.2中各優(yōu)勢菌于PCA平板上進(jìn)行多次劃線分離，得到單菌落后繼續(xù)傳代培養(yǎng)，對(duì)各代的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、大小等，直至盡可能得到純的單菌落，將純化好的菌株保存于營養(yǎng)瓊脂斜面試管，并于4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

(1) 形態(tài)觀察：將經(jīng)1.3.3純化后菌株接種于平板上，36 ℃下培養(yǎng)48 h，期間結(jié)合肉眼與革蘭氏染色后顯微鏡觀察各優(yōu)勢菌的菌落特征、細(xì)胞形態(tài)[13-14]以及相對(duì)比例等。

(2) 細(xì)菌16S rDNA菌種鑒定：經(jīng)純化的菌株采用細(xì)菌16S rDNA 菌種鑒定方法進(jìn)行鑒定[15]。將純化的5 種優(yōu)勢腐敗菌接種于10 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)，分別提取1#～5#腐敗細(xì)菌的基因組DNA，以通用引物：16S(F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S(R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 。

PCR擴(kuò)增其16S rDNA，回收1 500 bp 長度左右的PCR 產(chǎn)物，送至上海生工股份有限公司進(jìn)行DNA測序，將測定的序列通過Blast 程序與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已有的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析，根據(jù)16S rDNA序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定細(xì)菌種類。

1.3.5鮮蓮貯藏過程中腐敗菌的生長規(guī)律參考Chang Shu-chen等[16]的方法，并稍做修改。將于4 ℃冷藏條件下0～24 d的鮮蓮每3 d取樣，在無菌條件下進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)各優(yōu)勢腐敗菌個(gè)數(shù)，并繪制其生長規(guī)律曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1腐敗菌的分離和優(yōu)勢腐敗菌的確定

通過傾注平板、培養(yǎng)、觀察、計(jì)數(shù)，根據(jù)菌落形態(tài)特征將所有菌落大致分為8組，分別編號(hào)為1#～8#，將數(shù)量最多5種菌視為優(yōu)勢腐敗菌，鮮蓮低溫貯藏條件下5種優(yōu)勢腐敗菌菌落形態(tài)及相對(duì)比例見表1。

表1　優(yōu)勢腐敗菌形態(tài)及組成

2.2優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

2.2.1優(yōu)勢腐敗菌16S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果分別提取腐敗菌1#～5#號(hào)的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。由圖1可知，1#～5#號(hào)腐敗細(xì)菌基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離獲得比較清晰的條帶，可見PCR擴(kuò)增產(chǎn)物主要位于1 500 bp左右，且獲得的目的基因經(jīng)凝膠電泳可很好地純化分離。

2.2.2優(yōu)勢腐敗菌16S rDNA 鑒定結(jié)果通過細(xì)菌16S rDNA可變區(qū)的差異對(duì)菌種類別進(jìn)行區(qū)分?；厥?.2.1中的目的基因片段，并送至上海生工股份有限公司測序，將測序獲得的1#～5#腐敗菌的16S rDNA 序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行Blast相似檢索，從Genbank核苷酸數(shù)據(jù)庫中挑選同源性較高的16S rDNA序列進(jìn)行比較，利用MAGE 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]，結(jié)果見圖2。1#(L1)、2#(L2)菌株分別與分散泛菌(Pantoeadispersa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)親緣關(guān)系最近，驗(yàn)證可信度達(dá)99%；3#(L3)和5#(L5)菌株為同一菌屬，且與巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)親緣關(guān)系最近，驗(yàn)證可信度達(dá)100%；4#(L4)菌株與成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)親緣關(guān)系最近，驗(yàn)證可信度達(dá)100%，鑒定結(jié)果見表2。

圖1　腐敗細(xì)菌的擴(kuò)增結(jié)果

2.3鮮蓮低溫貯藏過程中優(yōu)勢腐敗菌的消長規(guī)律

由圖3可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，4種優(yōu)勢腐敗菌：分散泛菌、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的變化趨勢大體相同，呈現(xiàn)先降后升的趨勢，貯藏第3天時(shí)，優(yōu)勢腐敗菌菌落數(shù)都大幅度降低，研究現(xiàn)象與王滿生等[18]對(duì)草魚低溫貯藏過程中優(yōu)勢腐敗菌前期先大幅降低的結(jié)果相似，可能是鮮蓮采后貯藏溫度突然降低至冷藏4 ℃，導(dǎo)致部分細(xì)胞生長受抑或遇冷死亡引起。其中，巴氏葡萄球菌變化最為明顯，第3天后菌落數(shù)上升迅速，表皮葡萄球菌上升較分散泛菌變化略微明顯，第3天時(shí)菌落數(shù)低于分散泛菌，但第9天其菌落數(shù)超過了分散泛菌。在貯藏期間成團(tuán)泛菌菌落數(shù)變化無規(guī)律，可能是此菌本身的特點(diǎn)，易成片聚集，菌落數(shù)變化規(guī)律不明顯。

圖2　1#～5# 鮮蓮腐敗菌16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹

編號(hào)Blast相似性最高菌株種群1#分散泛菌(Pantoeadispersa)2#表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)3#和5#巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)4#成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)

因3# 和5#屬于同一菌屬，故合并統(tǒng)計(jì)

3　結(jié)論

本研究分離鑒定得到了鮮蓮4 ℃貯藏過程中的4種優(yōu)勢腐敗菌，即分散泛菌(Pantoeadispersa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)和成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)；明確了其在貯藏期間的消長規(guī)律，隨著貯藏時(shí)間的延長，分散泛菌、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的生長趨勢大體相同，呈現(xiàn)先降后升的趨勢，巴氏葡萄球菌變化最為突出，第3天后菌落數(shù)上升迅速，表皮葡萄球菌上升較分散泛菌變化略微明顯，貯藏期間成團(tuán)泛菌菌落數(shù)變化無規(guī)律。當(dāng)前研究分離鑒定了鮮蓮4 ℃貯藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌種類，初步掌握了其各自的消長規(guī)律，然而，對(duì)其優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力及其致腐機(jī)理尚需進(jìn)一步深入探討，對(duì)鮮蓮低溫貯藏新技術(shù)的開發(fā)及其產(chǎn)品的研發(fā)有待進(jìn)一步開展集成研究。

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The dominant spoilage bacteria and their growth and decline law in fresh lotus seeds storedat the cold storage

WANG Jian-huiWANGXiuWANGFa-xiangLIXiang-hongYUjianJINNaLIUYong-le

(HunanProvincialEngineeringResearchCenterforFoodProcessingofAquaticBioticResources,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China)

In this study, spoilage bacteria in fresh Xiang lotus seeds preserved at 4 ℃ temperature for 18 d were separated by dilution-plate method. Total genomic DNA was extracted from these strains and then subjected to PCR amplification. Dominant spoilage bacteria were identified using 16S rDNA sequencing for the identification and the law of their growth and declination was drawn. The results showed the four dominant spoilage bacteria in fresh Xiang lotus seeds preserved at the temperature of 4 ℃ werePantoeadispersa,Staphylococcusepidermidis,Staphylococcuswarneri, andPantoeaagglomerans. At the storage temperature of 4 ℃, the growing trends ofPantoeadispersa,Staphylococcusepidermidis,Staphylococcuswarneriof fresh lotus seeds were similar, which all needed an adaptive phase before their increase. The amount change ofPantoeaagglomeranswas irregular.

Fresh Lotus; Cold storage; dominant spoilage bacteria; identification; growth and decline law

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31301564，31201427)；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2015JJ2011)；湖湘青年英才支持計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2015RS4051)

王建輝，男，長沙理工大學(xué)教授，博士。

劉永樂(1962-)，男，長沙理工大學(xué)教授，博士。

E-mail:LYLE19@163.com

2016-06-07

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.026