王亞萍　陳　鍇　李寶莉　郭姝彤　劉永仙

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安716000)

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復(fù)方五倍子洗液對(duì)白色念珠菌體外抑制實(shí)驗(yàn)的探討*

王亞萍陳鍇△李寶莉郭姝彤劉永仙▲

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安716000)

目的:探討復(fù)方五倍子洗液對(duì)白色念珠菌的體外抑制實(shí)驗(yàn)的最佳劑量組合。方法:運(yùn)用正交t檢驗(yàn)探討復(fù)方五倍子洗液最佳劑量組合。結(jié)果:五倍子、白芷、石斛、當(dāng)歸4味藥起主要作用,川穹起輔助作用,丁香、珍珠、紅參起拮抗作用。結(jié)論:復(fù)方五倍子洗液的處方最佳劑量組合為A1B2C1D1E1F2G1H2。

主題詞白色念珠菌@復(fù)方五倍子洗液

白色念珠菌是真菌屬中較為常見(jiàn)的條件致病菌。近幾年來(lái),由于抗生素、免疫抑制劑藥物的大量的使用及其抗腫瘤藥物的應(yīng)用致使機(jī)體正常菌群發(fā)生失調(diào)，導(dǎo)致白色念珠菌的感染率及其發(fā)病率逐漸上升[1]。由白色念珠菌引起的陰道炎，發(fā)病率呈逐年增多，這可能與患者自身的免疫力下降及干擾患者生活質(zhì)量緊密相關(guān)[2-4]。在臨床上，較常見(jiàn)的婦女陰道主要以白色念珠性致病性為主，被稱作做真菌性或者念珠菌性陰道炎(Vulvovaginal Candidiasis，簡(jiǎn)稱VCC)，主要是指由白色念珠菌感染而引起陰道炎癥，是女性婦科生殖道常見(jiàn)致病菌之一。白色念珠菌感染后的臨床癥狀主要以白帶量增多、黏稠、外陰瘙癢及紅腫、熱痛等為主，而如何抵制致病菌、達(dá)到消炎的目的是陰道炎治療的關(guān)鍵問(wèn)題。當(dāng)前，臨床主要以應(yīng)用廣譜抗生素類(lèi)藥物及抗真菌類(lèi)藥來(lái)達(dá)到治療的目的，但是長(zhǎng)期應(yīng)用后，耐藥性問(wèn)題尤顯突出，給以后的診斷、治療造成極嚴(yán)重的困難，顯著威脅著患者的心身健康，是造成威脅患者死亡的重要原因之一。當(dāng)前，臨床上經(jīng)常使用抗念珠菌類(lèi)的藥物如酮康唑、咪康唑及氟康唑等，盡管有一定的臨床效果，但其復(fù)發(fā)率較高[5]，而且有部分患者已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性，致使感染了白色念珠菌的治療將要遇到新的挑戰(zhàn)[6]。所以, 研制出一類(lèi)抗念珠菌的新型藥物，使其不容易形成耐藥性且毒副低，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。本文經(jīng)多方研究探討制備復(fù)方五倍子洗液作用婦女念珠菌陰道炎，復(fù)方五倍子洗液是由八味中草藥組成，其成分是:五倍子、丁香、石斛、當(dāng)歸、珍珠粉、白芷、紅參、川芎等組成，其中五倍子味酸、寒，能收澀止帶；白芷性溫味辛，能除濕止痛；二藥共為主藥。當(dāng)歸味甘、辛，能補(bǔ)血和血；石斛味甘，具有滋陰生津的功效；人參味甘、性微溫，有大補(bǔ)元?dú)?，?qiáng)精通脈，延緩衰老，珍珠味甘，性寒。丁香味辛、性溫，補(bǔ)腎助陽(yáng)。五藥共為臣藥，川芎性辛、溫，具有活血行氣之功效。珍珠則解毒生肌，輔助君藥，增強(qiáng)君藥之職。為了得到八味中草藥的最佳劑量組合，運(yùn)用正交t檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法，探討其最佳藥物劑量配伍組合。

1儀器與試藥1.1實(shí)驗(yàn)中草藥五倍子(Rhus chinensis Mill.)、白芷 (Angelica dahurica)、石斛(Dendrobium nobileLindl)、丁香(Syringa Linn)、川芎(Ligusticum chuanxiong hort)、當(dāng)歸(Angelica sinensis)、珍珠(Marfarita)、紅參(radix ginseng rubra)等八種均購(gòu)自延安大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。

1.2受試菌種標(biāo)準(zhǔn)菌白色念珠菌(canidia Albicans) KWIK-STIKTM購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC10231)。

1.3培養(yǎng)基 沙保氏瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g, 牛肉膏3g ,氯化鈉5g, 瓊脂20g，葡萄糖40g, 氯霉素0.05g，蒸餾水1000ml,調(diào)PH值4-6)；肉湯培養(yǎng)基(牛肉膏3g, 氯化鈉5g, 蛋白胨10g,蒸餾水1000ml,調(diào)pH7.8高壓滅菌15min)；分別經(jīng)高壓滅菌15min，分裝，冷卻，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實(shí)驗(yàn)儀器手提式高壓鍋、培養(yǎng)箱、冰箱、無(wú)菌工作臺(tái)、電暖套、電子天平、無(wú)菌平皿、無(wú)菌試管、燒杯、酒精燈、移液器、接種環(huán)、游標(biāo)卡尺、無(wú)菌棉簽等。

2方法2.1菌液的準(zhǔn)備按照說(shuō)明書(shū)Kwik-Stik 操作流程，在無(wú)菌環(huán)境下，采用劃線接種法，接種于沙保平板培養(yǎng)基， 24h可見(jiàn)菌落形成，提取菌落做革蘭氏染色，鏡下確定是白色念珠菌。用接種環(huán)挑取單菌落，接種于5 ml普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，取0.5 ml于沙保氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，將菌落用滅菌生理鹽水洗后稀釋?zhuān)闷矫髢A注法測(cè)試活菌數(shù)后將其稀釋至1.0×109cfu/ ml，即制成試驗(yàn)菌液。

2.2中草藥醇提液的制備各稱取一定量的中藥藥材,破碎后除去蟲(chóng)垢及其雜質(zhì),并沖洗干凈,后干燥、粉碎，經(jīng)40目過(guò)篩,復(fù)方五倍子制劑分別為：五倍子30g,丁香、白芷、川芎、石斛、當(dāng)歸各10g，珍珠40g，紅參50g。按實(shí)驗(yàn)需求組合分組后加80%乙醇，水浴3h，過(guò)濾，抽離,萃取，計(jì)算萃取率為17.27%，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)酒精，烘干，刮取干粉，蒸餾水配液，得出原液濃度為4.21g/l，用無(wú)菌過(guò)流器過(guò)濾藥，分裝于無(wú)菌管中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3因素水平的確定試驗(yàn)選用 L12(211)正交t值表[7]進(jìn)行安排，處方中8味中藥構(gòu)成8個(gè)因素。以各藥高劑量為水平1,低劑量為水平2。因素水平(見(jiàn)表1)。

表1　因素及水平

2.4分組按照正交設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，共安排12組實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)采用打孔法[8]，吸取0.1 ml試驗(yàn)菌懸液,涂滿于沙保氏瓊脂平板表面,用直徑6 mm打孔器在平板上打孔，均勻打6空, 除去孔內(nèi)瓊脂并用少量營(yíng)養(yǎng)瓊脂封閉孔底，在孔內(nèi)滴加0.1 ml各組中草藥提液,置37℃培養(yǎng)24h后測(cè)定抑菌圈的直徑。計(jì)算各組抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)5次。

3結(jié)果從表中可以看出，因素A,C,E,對(duì)細(xì)菌的抑制作用有顯著的差異，因素G對(duì)細(xì)菌的抑制差異性不顯著，而因素B,F,H數(shù)值較小，可能誤差所致，單獨(dú)應(yīng)用對(duì)炎癥影響不大，這符合當(dāng)初實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求。從實(shí)驗(yàn)分析得知八種中草藥抗菌藥效較顯著著依然是五倍子，白芷，石斛(為主藥)，當(dāng)歸和川穹作用不顯著(可能為輔藥)，丁香、珍珠、紅參為作用不明顯，但可提高機(jī)體免疫功能。故優(yōu)化組合是A1B2C1D1E1F2G1H2，既五倍子、白芷、川穹、石斛、當(dāng)歸五味藥物組合可取得抗白色念珠菌最高藥效,見(jiàn)表2。

表2　實(shí)驗(yàn)安排表

4討論目前，較常見(jiàn)的婦女陰道感染主要以白色念珠性致病性為主，被稱作做真菌性或者念珠菌性陰道炎(Vulvovaginal Candidiasis，簡(jiǎn)稱VCC)，主要是指由白色念珠菌感染而引起陰道炎癥，是女性婦科生殖道常見(jiàn)致病菌之一[9-10]。中草藥作為純天然的藥物,日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，其具有價(jià)格廉、無(wú)藥物殘留等優(yōu)點(diǎn),越來(lái)越受到研究者們的歡迎。因此，如何開(kāi)發(fā)具有抗真菌性感染，且具有毒副作用小，又適合免疫力低下人群，是目前研究的熱點(diǎn)。

本文探討復(fù)方五倍子等8味中草藥，應(yīng)用80%乙醇提取，制成復(fù)方洗劑，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌白色念珠菌進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)白色念珠菌的抑菌效果。為臨床婦科陰道炎的治療研發(fā)新型有效的抗真菌藥物做基礎(chǔ)研究，為更好的探討本組方組成劑量的合理性、有效性、對(duì)真菌藥物的最佳抗菌性，對(duì)該組方用正交t檢驗(yàn)法的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。正交t檢驗(yàn)源于正交設(shè)計(jì), 是中藥方劑的研究，適合4～11味藥物的，特點(diǎn)是不含劑量間的交互作用的都不列在表內(nèi),所以用組數(shù)少的來(lái)分析組數(shù)多的因素。而中藥組方方劑的分析常用兩個(gè)水平,即用藥或者不用藥, 小劑量或者大劑量,且兩水平f值恒為t值的平方因此可簡(jiǎn)化計(jì)算。用正交t值較處方優(yōu)選,對(duì)主藥的分析，輔藥交互的分析以及劑量的分析[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交t檢驗(yàn)測(cè)得最佳劑量比為A1B2C1D1E1F2G1H2，測(cè)得了最佳的抑菌效果，希望能更好的發(fā)揮臨床療效，增強(qiáng)其對(duì)白色念珠菌性陰道炎最佳抑菌效果。

復(fù)方五倍子洗劑中五倍子味酸、寒，能收澀止帶；白芷性溫味辛，能除濕止痛；二藥共為主藥。當(dāng)歸味甘、辛，能補(bǔ)血和血；石斛味甘，具有滋陰生津的功效；人參味甘、性微溫，有大補(bǔ)元?dú)?，?qiáng)精通脈，延緩衰老，珍珠味甘，性寒。丁香味辛、性溫，補(bǔ)腎助陽(yáng)。五藥共為臣藥，川芎性辛、溫，具有活血行氣之功效。珍珠則解毒生肌，輔助君藥，增強(qiáng)君藥之職。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果只針對(duì)五倍子等 8種中草藥對(duì)白色念珠菌體外的抑菌作用做了初步的研究，而中草藥組方作用于人體疾病的藥理過(guò)程相對(duì)復(fù)雜等特點(diǎn)，若將其應(yīng)用對(duì)抗白色念珠菌性陰道炎的效果還有待下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察和對(duì)臨床婦科念珠菌陰道炎體外實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行確定。

[1]Kim H,Jung KW,Meng S,et al.Network-assisted genetic dissection of pathogenicity and drug resistance in the opportunistic human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans[J].Scientific reports,2015,3(5):8767-8777.

[2]Peters BM,PalmerGE,Nash AK,et al.Fungal morphogenetic pathways are required for the hallmark inflammatory response during Candida albicans vaginitis[J].Infection and immunity,2014,82(2):532-543.

[3]Mohamadi J,Havasian MR,Panahi J,et al.Antifungal drug resistance pattern of Candida. spp isolated from vaginitis in Ilam-Iran during 2013-2014[J]. Bioinformation,2015,11 (4): 203-206.

[4]De Bernardis F ,Arancia S ,Sandini S,et al.Studies of Immune Responses in Candida vaginitis[J]. Pathogens 2015,4 (4): 697-707.

[5]Nasrollahi Z , Yadegari MH , Roudbar Mohammadi S,et al. Fluconazole Resistance Candida albicans in Females With Recurrent Vaginitis and Pir1 Overexpression[J].Jundishapur J Microbiol ,2015,8 (9): 21468-21476.

[6]Den A,Durukan H, Güzel AB,et al.Genotyping of Vaginal Candida glabrata Isolates Using Microsatellite Marker Analysis and DNA Sequencing to Identify Mutations Associated with Antifungal Resistance[J]. Mikrobiyol Bul,2013,47 (1): 109-121.

[7]Zhou C,Hu J,Ma H.Antioxidant peptides from corn gluten meal: Orthogonal design evaluation[J].Food chemistry,2015,14(1):1771-1781.

[8]Yang JF,Yang CH,Chang HW,et al.Chemical composition and antibacterial activities of Illicium verum against antibiotic-resistant pathogens[J].J Med Food,2010,13(5):1254-1262.

[9]Kovachev S.Vaginal ecosystem[J].Akusherstvo i ginekologii,2011 ,50 (3): 41-49.

[10]石曉,王素燕.我國(guó)陰道炎患者陰道分泌物病原體分布情況[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(1):138-140.

[11]盛亮亮,賈冬,孫科峰,等.正交t值法篩選“養(yǎng)血止癢方”最佳配伍實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,12(11):235-236.

(收稿2016-02-23；修回2016-04-26)

*陜西省延安市科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013-KW30)

△延安大學(xué)附屬醫(yī)院(延安 716000)

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10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.064