侯俊明　任占良　侯杰軍　楊得振　董　明　魏　輝　賈　奇　任小朋　賈　勇

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712000)

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莪黃湯保留灌腸對(duì)人結(jié)腸癌SW480移植瘤生長(zhǎng)及VEGF表達(dá)的影響*

侯俊明任占良▲侯杰軍△◇楊得振△董明△魏輝△賈奇△任小朋△賈勇△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712000)

目的：研究莪黃湯對(duì)人結(jié)腸癌SW480移植瘤生長(zhǎng)及VEGF的影響。方法：選健康SPF級(jí)BALB/c小鼠2只，雌性，年齡4～6周，體重18～22g；健康SD大鼠40只，體重200±15g。造模后，40只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、莪黃湯高劑量組、莪黃湯低劑量組，每組10只,接種后1周開(kāi)始給藥治療。四組均給予飼料、自由飲用水，分別用相應(yīng)藥物干預(yù)處理2周。觀察莪黃湯對(duì)人結(jié)腸癌SW480移植瘤生長(zhǎng)及抑瘤作用的影響，運(yùn)用S-P免疫組化法分析移植瘤內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)。結(jié)果：莪黃湯對(duì)SW480移植瘤大鼠瘤體生長(zhǎng)有抑制作用，但弱于5-FU；該藥等促進(jìn)大鼠胸腺、脾臟的生長(zhǎng)，提升了機(jī)體的免疫力及抗腫瘤能力；陽(yáng)性對(duì)照組與藥物組對(duì)SW480移植瘤大鼠VEGF表達(dá)的影響相近；可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)論：莪黃湯對(duì)SW480移植瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，減少SW480移植瘤表達(dá)VEGF，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

主題詞結(jié)腸腫瘤灌腸@莪黃湯動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)

中醫(yī)藥抗腫瘤治療既能扶正、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，又能殺滅腫瘤細(xì)胞，還能活血并改善高黏高凝狀態(tài)，在腫瘤治療過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[1]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)SW480荷瘤大鼠免疫功能影響的研究，探討了莪黃湯對(duì)人結(jié)腸癌移植瘤的抑瘤作用及對(duì)VEGF表達(dá)的影響。

1材料1.1實(shí)驗(yàn)材料健康SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠2只，鼠齡4～6周，體重20±2g；健康SD大鼠40只，體重200±15g；以上動(dòng)物均購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其中健康SPF級(jí)BALB/c小鼠代養(yǎng)在第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF條件下的超凈層流籠中；人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。莪黃湯組方：莪術(shù)、大黃、昆布、薏苡仁。陽(yáng)性對(duì)照藥物：5-FU購(gòu)自陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院。(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31020593，規(guī)格0.25g/支)。實(shí)驗(yàn)試劑盒：鼠抗人VEGF免疫組化試劑(產(chǎn)品貨號(hào)：A003-3)。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1造模及分組灌腸將莪黃湯生藥80g，煎湯濃縮為生藥含量為4g/ml冷藏備用(陜西中醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)中心制備)，用前稀釋至所需濃度。選健康SPF級(jí)BALB/c小鼠2只，雌性，年齡4～6周，體重18～22g；健康SD大鼠40只，體重200±15g。在健康SPF級(jí)BALB/c小鼠背部種植人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，制成實(shí)體瘤模，觀察兩周后成瘤率100%[2]。成瘤后即處死瘤鼠，消毒皮膚，切下瘤塊，選用合適部位于生理鹽水中剪成直徑2mm的瘤塊備用。40只SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后進(jìn)行瘤體種植手術(shù)；術(shù)前禁食12 h，以10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，常規(guī)安爾碘消毒腹部皮膚，選擇下腹正中切口，打開(kāi)腹腔，將制備好的瘤塊植入距回盲部約5cm處腸系膜側(cè)的漿膜面凹龕中[3]。術(shù)后所有大鼠暫時(shí)分籠飼養(yǎng)至完全清醒后給予正常飲食。以《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)》給藥方法，莪黃湯組結(jié)腸給藥，按低劑量組4g/kg/d，高劑量組40g/(kg·d)[4]。5-FU結(jié)合臨床用藥原則，按公式計(jì)算，每只大鼠腹腔注射50mg/kg，隔日。

所有SD大鼠全部蘇醒，按根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分組的方法分為4組，模型對(duì)照組[用蒸餾水按10ml∕(kg·d)體重灌腸]；陽(yáng)性對(duì)照組(腹腔注射5-FU，給藥劑量為50mg/kg,隔日)；莪黃湯高劑量組[2ml(8g)/(d·只)]；莪黃湯低劑量組[2ml(0.8g)/(d·只)]，每組10只。接種后1周開(kāi)始給藥治療，均給予飼料、自由飲用水，分別用相應(yīng)藥物干預(yù)處理2周。觀察SD大鼠一般情況；各組SD大鼠體重的變化；SW480移植瘤的生長(zhǎng)狀況。計(jì)算抑瘤率抑瘤率(%)=[(模型組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%]及脾臟(胸腺)指數(shù)脾臟(胸腺)指數(shù)=[脾臟(胸腺)重量(mg)/大鼠體重(g)]。S-P免疫組化分析法測(cè)定各組VEGF的表達(dá)。

2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果3.1SD大鼠生活狀況觀察造模前所有大鼠生活狀況良好。接種后1周內(nèi)，未見(jiàn)異常，各組大鼠均成瘤成功，成瘤率為100%。給藥2周以后，體重變化情況模型組較其它組均有減輕，進(jìn)食及飲水量明顯減少，體毛雜亂暗淡無(wú)光。陽(yáng)性對(duì)照組明顯出現(xiàn)脫毛、體毛雜亂、無(wú)光澤，較模型組體重明顯減輕。莪黃湯各組大鼠體重明顯增長(zhǎng)，日進(jìn)食、水量增加，活動(dòng)好。模型組1只大鼠因全身衰竭死亡。

3.2給藥前后對(duì)各組大鼠體重的影響SD大鼠接種第7天與用藥后第15天體重比較，用藥后體重與模型組比較陽(yáng)性對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，與模型組比較莪黃湯組均升高，升高程度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)；莪黃湯組體重均高于陽(yáng)性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1　給藥前后SD大鼠體重變化比較(g)

3.3藥物對(duì)大鼠瘤體重量及抑瘤率的影響對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行藥物灌腸，灌腸后2周，嚴(yán)格稱取SD大鼠體重，瘤體重量及抑瘤率分析結(jié)果見(jiàn)表2。從結(jié)果來(lái)看，實(shí)驗(yàn)鼠的體重兩組存在顯著差異，與陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠體重比較比較，莪黃湯組的大鼠體重均較高(P<0.05)。

表2　藥物對(duì)SW480移植瘤大鼠瘤體重量及抑瘤率的影響

3.4藥物對(duì)SW480移植瘤大鼠免疫器官指數(shù)的影響與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組指數(shù)均降低(P<0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，莪黃湯組均較高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3　藥物對(duì)SW480移植瘤大鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響(mg/g)

3.5藥物對(duì)SW480移植瘤大鼠瘤組織中VEGF的影響與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、莪黃湯高劑量組表達(dá)VEGF明顯下降，莪黃湯低劑量組VEGF表達(dá)有所下降；莪黃湯高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，說(shuō)明莪黃湯與5-FU對(duì)SW480移植瘤大鼠VEGF的表達(dá)影響相近，見(jiàn)表4。

表4　藥物對(duì)SW480移植瘤大鼠瘤組織中VEGF的影響

4討論運(yùn)用莪黃湯保留灌腸，在改善結(jié)直腸癌術(shù)后患者排便功能、圍放療期患者的臨床表現(xiàn)，改善腫瘤周圍組織手術(shù)條件，增強(qiáng)新輔助治療效果，縮短了新輔助治療的時(shí)間，提高患者的生活質(zhì)量方面取得了一定的療效[5]。莪黃湯聯(lián)合化療能在一定程度上下調(diào)患者結(jié)直腸癌組織中VEGF的表達(dá)，上調(diào)E-Cadherin的表達(dá)，抑制腫瘤新生血管生成，從而抑制腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[6]。

以往的研究中發(fā)現(xiàn)益氣活血類中藥可通過(guò)影響SDF-1/CXCR4通路等,調(diào)節(jié)血管生成,從而治療血管生成異常的疾??；而從莪術(shù)中提取莪術(shù)醇和β—欖香烯的抗腫瘤作用尤其突出[7]。李傳偉等[8]探討了莪術(shù)油對(duì)小鼠結(jié)腸癌抑制作用及機(jī)制。馮剛等[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明莪術(shù)油對(duì)腫瘤血管形成有明顯抑制作用。大黃素抗腫瘤、抗炎癥等多種生物學(xué)作用已經(jīng)有報(bào)道[10]。 王庭欣等[11]認(rèn)為昆布多糖是通過(guò)細(xì)胞免疫和非特異性免疫而實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠的抑瘤作用。馮剛等[12]發(fā)現(xiàn)薏苡仁具有明顯抑制S180肉瘤生長(zhǎng)的功效。

本實(shí)驗(yàn)提示莪黃湯對(duì)SW480移植瘤大鼠瘤體的生長(zhǎng)有抑制，但弱于5-FU。與模型對(duì)照組比較，莪黃湯各劑量組可增強(qiáng)SD大鼠免疫力，具有顯著性差異；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，莪黃湯各劑量組SD大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著升高；與模型組相比，5-FU組SD大鼠免疫力明顯降低，顯示了5-FU對(duì)大鼠的脾臟和胸腺較強(qiáng)的損傷作用。莪黃湯各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，莪黃湯能夠促使大鼠的胸腺、脾臟生長(zhǎng)，能改善機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)抗腫瘤的能力。

目前眾多研究證實(shí)，當(dāng)腫瘤體積大于2mm3時(shí)，就需要新生血管來(lái)為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供養(yǎng)分。大腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移同樣依賴新生血管的形成。宋寄春等[13]發(fā)現(xiàn)半枝蓮阻滯了腫瘤細(xì)胞由S期向GZ/M期的轉(zhuǎn)變過(guò)程，從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡。崔映宇等[14]發(fā)現(xiàn)馬尾松樹(shù)皮提取物抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡是通過(guò)上調(diào)P53、P21，下調(diào)Bel-2來(lái)表達(dá)。呂盈盈等[15]發(fā)現(xiàn)大黃素通過(guò)抑制VEGFR酪氨酸激酶活性來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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(收稿2016-05-07；修回2016-06-20)

*陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012SF2-11-3)

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10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.074