張秋平，徐向群

(浙江理工大學理學院，杭州 310018)

?

樺褐孔菌多糖的硫酸化修飾及生物活性研究

張秋平，徐向群

(浙江理工大學理學院，杭州 310018)

研究探討樺褐孔菌胞內(nèi)、胞外多糖經(jīng)過硫酸化修飾后其化學組成與生物活性的變化。利用水溶醇沉法提取了胞外多糖EPS和胞內(nèi)多糖IPS。以EPS為樣品，通過正交實驗確定了最佳的硫酸化修飾條件為反應溫度75℃，反應時間2.5h，反應摩爾比1∶2.5。在同樣修飾條件下，胞外多糖取代度要高于胞內(nèi)多糖取代度。樺褐孔菌胞內(nèi)、胞外多糖經(jīng)硫酸化修飾后，糖含量、蛋白質(zhì)含量以及糖醛酸含量都有所降低，然而硫酸化修飾多糖展示出了更強的DPPH清除活性以及更低的IC50值。這表明樺褐孔菌胞外、胞內(nèi)多糖經(jīng)硫酸化修飾后，有效提高了抗氧化活性，利于其進一步開發(fā)利用。

樺褐孔菌；多糖；硫酸化修飾；抗氧化活性

0　引　言

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)屬于擔子菌亞門，是一種非常珍稀且有著良好治療效果的可食藥用真菌，主要分布在北緯45°～50°的寒冷地區(qū)，如歐洲、亞洲和北美地區(qū)，是生長在寒帶的木腐菌[1]。樺褐孔菌多糖是其主要的活性組分，有著多種生物功能，如抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性[2-4]。野生樺褐孔菌資源非常昂貴且稀缺。我們實驗室研究報道了通過液體深層發(fā)酵樺褐孔菌能獲得更多含量以及更高活性的胞外多糖[5-6]，然而，樺褐孔菌多糖的溶解度偏低，從而影響其生物活性的發(fā)揮。

多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)有著密切的關系，對多糖結(jié)構(gòu)進行適當修飾是多糖領域研究的重點方向之一。多糖經(jīng)硫酸化修飾后，不僅能加強其溶解性，而且能夠改變多糖的結(jié)構(gòu)，從而導致多糖生物活性的加強甚至產(chǎn)生新的生物活性[7-8]。一些研究報道了硫酸化修飾多糖展示了更強的抗氧化以及抗腫瘤活性[9]，而對樺褐孔菌多糖硫酸化修飾的報道卻很少。因此本研究期望通過正交實驗確定樺褐孔菌多糖硫酸化修飾的最佳條件，并在最佳條件下對來源對照培養(yǎng)基的胞內(nèi)、胞外多糖硫酸化修飾，分析比較胞內(nèi)、胞外多糖經(jīng)硫酸化修飾后，各自的化學含量、單糖組成、分子量以及抗氧化活性的變化，為進一步開發(fā)樺褐孔菌多糖提供理論基礎。

1　材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1發(fā)酵培養(yǎng)胞內(nèi)、胞外多糖

樺褐孔菌從徐州師范大學獲得。液體菌種的培養(yǎng)：把保存在麥芽瓊脂斜面的樺褐孔菌菌絲體接種于含有100 mL培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為：酵母浸膏2 g/L，蛋白胨3 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，CaCl20.1 g/L，于28 ℃,150 r/min的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d。將培養(yǎng)好的液體菌種在超凈臺上用移液管分別接種于100mL對照培養(yǎng)基的250mL發(fā)酵瓶中，接種比例為10%(體積比)。將接種好的培養(yǎng)瓶于搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，時間9 d，收集發(fā)酵液和菌絲體，分別提取胞外多糖和胞內(nèi)多糖[10]。

1.1.2主要試劑

Tween 80，天津永大化學試劑有限公司；BCA試劑盒，上海索寶生物科技公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma公司；咔唑，常州中集化工有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1胞外多糖的提取

分別將發(fā)酵第9 d的培養(yǎng)基胞外液用濾紙進行抽濾，得到菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體保留用于提取胞內(nèi)多糖，發(fā)酵液于真空濃縮至原體積的1/4，加入4倍體積的95%的乙醇，充分攪拌，使多糖盡可能多的沉淀下來，與4 ℃的冰箱中靜置過夜。沉淀用95%的乙醇反復沖洗，以除去參雜在其中的還原糖和小分子物質(zhì)。然后在6500 r/min條件下離心，清除上清液，并冷凍干燥，得到了干燥的胞外多糖樣品并留著備用，記為EPS。

1.2.2胞內(nèi)多糖的提取

將發(fā)酵液抽濾得到的菌絲體用蒸餾水洗滌3次，直至洗滌后的蒸餾水為無色為止。將洗滌干凈的菌絲體放置烘箱中烘干至沒有水分，然后用研磨磨成粉末，將粉末置于離心管中并加入蒸餾水(蒸餾水∶菌絲體=1∶5)，超聲5 min(超聲時間5 s，間隔時間3 s)，混合液置于95 ℃的恒溫水浴鍋中加熱2 h，離心收集上清液，再向離心管中的殘渣加入蒸餾水，重復上面的操作，將兩次收集的上清液合并，真空濃縮，加入4倍體積的95%乙醇并充分攪拌，放入4℃冰箱中靜置過夜，用干凈的95%的乙醇洗滌得到的沉淀多糖，然后在6500 r/min條件下離心并去除上清液，將得到的沉淀放入冷凍干燥機中干燥，最終得到的固體即為胞內(nèi)多糖，記為IPS。

1.2.3硫酸化多糖的制備

本實驗采用三氧化硫-吡啶法對樺褐孔菌多糖進行硫酸化修飾?？疾炝朔磻獪囟?、反應時間以及三氧化硫-吡啶與多糖摩爾比3個因素對硫酸化修飾結(jié)果的影響。以對照培養(yǎng)基胞外多糖為樣品，取代度(DS)為指標，每個因素選取了3個水平，其中溫度為55、75 ℃和85 ℃；時間為1.5、2.5 h和3.5 h；摩爾比為1.0∶1.5,1.0∶2.5和1.0∶3.5，通過正交實驗確定最佳的硫酸化修飾條件。

在最佳的硫酸化修飾條件下，分別對樺褐孔菌胞內(nèi)、胞外多糖進行硫酸化修飾，其過程為：準確稱取50 mg多糖樣品，通過超聲或加熱攪拌使其溶解在35mL的甲酰胺溶液中，將制備好的硫酸酯化試劑加入其中。反應一段時間后，用冰水浴使其迅速降至室溫，然后用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7～8。經(jīng)透析袋透析48 h后，透析液于真空濃縮至原溶液體積的1/4，加入4倍體積95%的乙醇，4 ℃冰箱靜置過夜，離心清除上清液，再冷凍干燥，所得固體即為樺褐孔菌硫酸化多糖，分別記為sEPS和sIPS。

硫酸多糖的取代度通過氯化鋇明膠法測定[11]，根據(jù)測得標準曲線計算硫酸基含量并根據(jù)以下公式計算取代度：

(1)其中：DS為硫酸多糖取代度；S為硫酸基百分含量。

1.2.4化學組成的分析

用苯酚-硫酸法測定各多糖EPS和IPS以及對應硫酸化多糖樣品的糖含量。用BCA試劑盒測定各上述多糖以及各硫酸化多糖樣品的蛋白含量。用硫酸-咔唑法測定各上述多糖以及硫酸化多糖樣品的糖醛酸含量。

采用氣相色譜分析多糖樣品中單糖的組成，多糖以及硫酸化多糖的水解物和各單糖標準品通過糖腈乙酸酯法完成多糖的衍生化。氣相色譜的分析條件為：采用的是石英毛細管柱SE-50, 30 m×0.25 mm，液膜厚度為0.25 μm，氣化室溫度260 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度250 ℃，載氣壓力0.6 MPa,氫氣壓力0.65 MPa,空氣0.50 MPa,分流比30∶1，進樣量1 μL。程序升溫，110 ℃保持2 min，在以3 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 ℃，然后5 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min。

1.2.5分子量的測定

采用SEC-LLS法(size exclusion chromatography with laser light scattering)來測量多糖的分子量。該種方法不需要標準曲線，所以不依賴于未知樣品的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，測量結(jié)果更為精確。測量操作步驟如下：準確稱取儲存好的多糖樣品和硫酸化多糖樣品2 mg，溶解于4 mL的0.2 mol/L的NaNO3溶液中，使?jié)舛葹?.5 mg/mL。進行測量之前，先將所有待測樣品用0.2μm的微孔濾膜進行過濾，進樣量為100 μL,檢測器溫度30 ℃，流動時間0.8 mL/min。

1.2.6FT-IR光譜分析

稱取少量的干燥多糖樣品，在1∶100的情況下與KBr充分混合，壓成均勻的1mm的薄片。薄片通過Nicolet AVATAR 360 FT-IR光譜儀進行掃描測量，掃描范圍4000～400 cm-1。

1.2.7DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基的測定了通過采用Yang等[12]的方法并做了一些改進，具體操作為：準確稱取儲存好的多糖樣品并溶于蒸餾水中，配成濃度梯度0.5～5 mg/mL。于干凈的試管中加入0.8 mL配置好的DPPH溶液(0.4 mmol/L),分別移取各濃度多糖2.4 mL加入試管中，并充分振蕩搖勻，黑暗處靜置30min，然后測定其吸光度并記為Ab1，樣品對照組為以甲醇代替DPPH，加入各濃度多糖2.4 mL，反應后測定吸光度記為Ab2，對照組為0.8 mL的甲醇溶液與2.4mL的DPPH溶液反應記為Ab0。所有吸光度的值都是在517 nm下測得，DPPH自由基清除率按以下方程進行計算：

DPPH自由基清除率/%=

(2)

其中：Ab0—對照吸光度；Ab1—多糖樣品吸光度；Ab2—樣品對照組吸光度(反應體系中無DPPH)。

2　結(jié)果與分析

2.1硫酸修飾條件的優(yōu)化

表1所示為正交實驗結(jié)果，從表1中可以看出，5號試驗的取代度最高為0.97，取代度最低的為1號試驗，取代度為0.53。此外，通過極差分析可以得出，在溫度、時間和反應摩爾比3個因素中，反應溫度對取代度的影響最大，其次是反應摩爾濃度比，而反應時間對溫度的影響最弱。

在多糖硫酸化修飾的反應研究中，反應溫度和反應摩爾濃度比是影響硫酸化多糖取代度的兩個主要因素。隨著反應摩爾濃度比的增加以及反應時間的延長，取代度逐漸升高，而如果反應摩爾濃度比過高或者反應時間過長，多糖也許會被降解甚至碳化。當溫度從55 ℃上升到75 ℃過程中，硫酸化多糖取代度明顯上升，但當溫度繼續(xù)上升時，硫酸化多糖的取代度卻開始下降，此外溫度過高也許會導致多糖結(jié)構(gòu)被破壞。因此綜合所有因素，確定了最佳的多糖硫酸化修飾條件為溫度75 ℃，時間2.5 h，反應摩爾濃度比為1.0∶2.5。

表1　正交實驗結(jié)果表

注：K1為每一列中當溫度為55℃,時間1.5h、摩爾比1.0∶1.5時各取代度之和；K2(K3)為每一列中當溫度為75℃(85℃),時間2.5h(3.5h)以及摩爾比1.0∶2.5(1.0∶3.5)時各取代度之和；R為每一列中K1、K2和K3的極差。

2.2多糖以及硫酸化多糖的組成分析

表2所示為樺褐孔菌胞內(nèi)、胞外多糖以及對應硫酸化修飾多糖的化學含量以及單糖組成。從表2中可以看出，IPS要比EPS有更高的糖含量，為45.71%，而糖醛酸和蛋白質(zhì)的含量則較低。兩種多糖經(jīng)硫酸化修飾后，糖含量、糖醛酸含量以及蛋白質(zhì)含量都有所下降，且其中蛋白含量下降的更明顯，這可能由于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差，在高溫條件下容易變性而失活。所有多糖和硫酸化多糖樣品都主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，并且含有少量阿拉伯糖、木糖和鼠李糖。與EPS相比，IPS有更高含量的葡糖糖，其含量分別為40.2%和55.9%；經(jīng)硫酸化修飾后，兩種多糖中葡萄糖含量都明顯增加；此外，sEPS和sIPS的取代度分別為0.85和0.65，表明在同樣條件下，胞外多糖要比胞內(nèi)多糖更容易發(fā)生硫酸化取代。

表2　樺褐孔菌多糖以及對應硫酸化多糖的化學含量和單糖組成

注：w/%表示為重量百分比；n/%表示摩爾百分比; -表示未發(fā)現(xiàn)。

2.3多糖的分子量

重均分子量(MW)和粘均分子量(MN)是影響硫酸化多糖生物活性的重要參數(shù)。從表3中可以看到，EPS和sEPS的MN值和MW值分別為42840、43566和45376、44986， 且EPS和sEPS的MW/MN的值都接近于1，表明多糖分散度小，分子形態(tài)分布較均一。

表3　樺褐孔菌多糖以及硫酸多糖的分子量

2.4多糖FT-IR分析

如圖1所示為EPS和sEPS的紅外光譜圖，圖1中3200～3600cm-1出現(xiàn)的寬峰為O-H伸縮振動；2940cm-1左右出現(xiàn)的峰是由-CH2中C-H的伸縮振動造成；1659cm-1左右出現(xiàn)的峰為多糖的水化峰；1391cm-1出現(xiàn)的峰是由C-H的彎曲振動造成；1032cm-1左右出現(xiàn)的峰是由糖類中C-O振動引起的。與EPS相比，sEPS出現(xiàn)了3個新的特征峰，其中1230cm-1和1146cm-1兩個特征峰是由S=O的伸縮振動引起，另外一個809cm-1出現(xiàn)的特稱峰是由C-O-SO3伸縮振動引起。3個新出現(xiàn)的特征峰可以表明硫酸取代的發(fā)生[13]。

圖1　來源對照培養(yǎng)基胞外多糖和對應硫酸多糖紅外光譜圖注：(a)為sEPS；(b)為EPS。

2.5DPPH自由基清除活性

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，被廣泛應用于評估天然產(chǎn)物的自由基清除能力。圖2為樺褐孔菌胞外、胞內(nèi)多糖以及對應硫酸化多糖的DPPH清除活性隨溶度變化關系。從圖2中可以看出，4種多糖EPS、sEPS、IPS和sIPS的自由基清除活性與溶度呈一定劑量關系，且在5mg/mL時達到最大值，分別為39.18%、42.26%、35.2%和45.1%。結(jié)果表明樺褐孔菌胞內(nèi)、胞外多糖經(jīng)硫酸化修飾后，有更強的DPPH清除活性，且從表4中可以看出，硫酸修飾多糖要比對應未修飾多糖有更低的IC50值。表明硫酸修飾多糖呈現(xiàn)更強的抗氧化活性。

圖2　樺褐孔菌多糖以及對應硫酸多糖的DPPH清除活性

多糖樣品IC50/(mg/mL)EPS6.94sEPS5.74IPS7.31sIPS6.05

3　結(jié)　論

本實驗對來源對照培養(yǎng)基胞內(nèi)、胞外多糖進行了硫酸化修飾，確定了最佳的硫酸修飾條件為溫度75 ℃，反應摩爾濃度比1∶2.5以及反應時間2.5 h。在FT-IR光譜中，經(jīng)硫酸化修飾后的多糖出現(xiàn)了兩個新的特征峰，分別為1250和 810 cm-1，都是由S=O伸縮振動引起的，表明硫酸取代反應的發(fā)生。多糖樣品經(jīng)硫酸化修飾后，其分子量并未出現(xiàn)明顯的變化，表明在硫酸化修飾反應過程中，多糖沒有發(fā)生明顯的降解。此外，與天然多糖相比，經(jīng)硫酸化修飾后的胞內(nèi)、胞外多糖顯示出更強的DPPH自由基清除活性以及更低的IC50值，表明其抗氧化能力被加強了。這些結(jié)果表明硫酸化修飾能加強樺褐孔菌多糖的抗氧化活性。

[1] 黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌-樺褐孔菌[J].中國食用菌,2002,21(4):7-8.

[2] FAN L P, DING S D, AI L Z, et al. Antitumor and immunomodulatory activity of water-soluble polysaccharide fromInonotusobliquus[J]. Carbohydrate Polymers,2012,90(2)：870-874.

[3] DU X, MU H M, ZHOU S, et al. Chemical analysis and antioxidant activity of polysaccharides extracted fromInonotusobliquussclerotia [J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,62：691-696.

[4] WON D P, LEE J S, KWON D S, et al. Immunostimulating activity by polysaccharides isolated from fruiting body ofInonotusobliquus[J]. Molecules and Cells,2011,31(2)：165-173.

[5] XU X Q, WU Y D, CHEN H. Comparative antioxidative characteristics of polysaccharide-enriched extracts from natural sclerotia and cultured mycelia in submerged fermentation ofInonotusobliquus[J]. Food Chemistry, 2011,127(1)：74-79.

[6] XU X Q, LI J, HU Y. Polysaccharides fromInonotusobliquussclerotia and cultured mycelia stimulate cytokine production of human peripheral blood mononuclear cells in vitro and their chemical characterization [J].International Immunopharmacology,2014,21(2)：269-278.

[7] CHEN S G, WANG J F, XUE C H, et al. Sulfation of a squid ink polysaccharide and its inhibitory effect on tumor cell metastasis [J]. Carbohydrate Polymers,2011,81(3)：560-566.

[8] CHEN X, SIU K C, CHEUNG Y C, et al. Structure and properties of a (1→3)-β-d-glucan from ultrasound-degraded exopolysaccharides of a medicinal fungus [J]. Carbohydrate Polymers,2014,106(15):270-275.

[9] MA L S, CHEN H X, ZHANG Y, et al. Chemical modification and antioxidant activities of polysaccharide from mushroomInonotusobliquus[J]. Carbohydrate Polymers,2012,89(2)：371-378.

[10] CHEN H, XU X Q, ZHU Y. Optimization of hydroxyl radical scavenging activity of exo-polysaccharides fromInonotusobliquusin submerged fermentation using response surface methodology [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology,2010,20(4)：835-843.

[11] MOJIACA K, ELSEY D, COONEY M J. Quantitative analysis of biofilm EPS uronic acid content [J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 71(1)：61-65.

[12] YANG Z Y, TU Y Y, XIA H L, et al. Suppression of free-radicals and protection against H2O2-induced oxidative damage in HPF-1 cell by oxidized phenolic compounds present in black tea [J]. Food Chemistry,2007,105(4):1349-1356.

[13] WANG J L, GUO H Y, ZHANG J, et al. Sulfated modification, characterization and structurefation of the extracellular poArtemisia sphaerocephala polysaccharides [J]. Carbohydrate Polymers,2010,81(4)：897-905.

(責任編輯： 許惠兒)

Studies on Sulfated Modification and Biological Activity of Polysaccharides ofInonotusObliquus

ZHANGQiuping,XUXiangqun

(School of Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

This research aims to discuss chemical composition and biological activity of intracellular and extracellular polysaccharides ofInonotusobliquusafter sulfated modification. extracellular polysaccharide (EPS) and intracellular polysaccharide (IPS) were extracted by water ethanol method. By using the EPS as the sample, the orthogonal experiments were applied to confirm the optimum modification conditions as follows: reaction temperature 75℃, reaction time 2.5 h, molar ratio 1∶2.5. Under the same modification conditions, the substitution degree of EPS was higher than that of IPS. The contents of sugar, uronic acid and protein of polysaccharides decreased after sulfated modification, while the polysaccharide modified by sulfation exhibited significantly stronger DPPH elimination activity and lower IC50 value. These show that sulfated modification can enhance the antioxidant activity of polysaccharides ofInonotusobliquus, and contribute to further development and utilization of polysaccharides.

Inonotusobliquus; polysaccharide; sulfated modification; antioxidant activity

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.09.020

2016-02-05

浙江省自然科學基金項目(LY16B020013)

張秋平(1989-)，男，江西新余人，碩士研究生，主要從事生物技術與生物化工方面的研究。

徐向群，E-mail：xuxiangqun@zstu.edu.cn

Q538

A

1673- 3851 (2016) 05- 0754- 05 引用頁碼： 090702