鄒勝利，聶作明，吳祥甫，方心葵，孫　濤

(1.浙江理工大學(xué)生物化學(xué)研究所，杭州 310018；2.上海交通大學(xué)上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

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水泡性口炎病毒與Monocyte及MoDC的互作研究

鄒勝利1，聶作明1，吳祥甫1，方心葵2，孫濤2

(1.浙江理工大學(xué)生物化學(xué)研究所，杭州 310018；2.上海交通大學(xué)上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

為了探究水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus ,VSV)與天然宿主免疫細(xì)胞的互作關(guān)系，實(shí)驗(yàn)用M蛋白第51位甲硫氨酸殘基缺失后的重組病毒(VSVΔM51-GFP)和第51位甲硫氨酸敲除、第221位纈氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒌?26位絲基酸突變?yōu)榫彼岬闹亟M病毒(VSV-MT-GFP)以及野生型重組病毒(VSV-GFP)感染豬單核細(xì)胞(Monocyte)和單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞(Monocyte-derived dendritic cell，MoDC)，通過空斑實(shí)驗(yàn)制作病毒生長曲線，用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的感染狀況，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子表達(dá)變化。結(jié)果表明，VSV、VSVΔM51、VSV-MT均可感染Monocyte和MoDC，且Monocyte的感染率僅為8.38%。3種病毒在MoDC中可以大量復(fù)制，但無法在Monocyte中擴(kuò)增。且與野生型VSV相比，VSVΔM51、VSV-MT細(xì)胞致病性依次減弱。VSV能有效激活TNF-α、IL-8、IFN-α相關(guān)免疫細(xì)胞因子在MoDC中的表達(dá)，且M蛋白突變程度越大，病毒激活能力越強(qiáng)。

水泡性口炎病毒；單核細(xì)胞；MoDC；互作；基質(zhì)蛋白M

0　引　言

水泡性口炎(vesicular stomatitis，VS)是由水泡型口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)引起的一種人畜共患急性傳染病，可通過多種媒介廣泛傳播。VSV屬于彈狀病毒科水泡病毒屬成員，按其血清型可分為新澤西型和印第安納型[1]，基因組為一條單鏈RNA分子，分別編碼N、NS、M、G、L 5種主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中M和G蛋白定位于病毒粒子包膜蛋白。M蛋白由229個(gè)氨基酸組成，能使核衣殼同含有G蛋白的包膜或細(xì)胞膜發(fā)生相互聯(lián)系，故M蛋白被認(rèn)為是一種橋連分子和重要的致病因子[2]。樹突狀細(xì)胞[3](Dendritic Cell)是目前已知功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，作為機(jī)體適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動者，DC細(xì)胞能夠顯著刺激初始T細(xì)胞的增殖。病毒感染DC后，能夠不同程度引起MHC II、TNF-α、IL-12、和CD80/86等細(xì)胞因子及表面蛋白的變化。病毒感染致使細(xì)胞因子分泌的改變可以反映出細(xì)胞免疫的傾向性。IFN-α的分泌可以促進(jìn)動物體內(nèi)未成熟DC的成熟[4]，TNF-α的分泌可誘導(dǎo)DC主要組織相容性復(fù)合物的表達(dá)，可以提高DC細(xì)胞的抗原遞呈能力。IL-8是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞趨化因子和活化因子，是激活中性粒細(xì)胞的吞噬功能和溶酶體活性，此外對T淋巴細(xì)胞也有一定的趨化作用[5]。

近年來，VSV相繼被人們應(yīng)用于HIV、乳腺癌[6]等疾病的疫苗研究[7]。2014年，起源于非洲的埃博拉病毒引起全球恐慌，近日，加拿大公共衛(wèi)生署的科研人員成功研發(fā)出基于口炎病毒載體的VSV-EBOV埃博拉疫苗[8]，已投入臨床實(shí)驗(yàn)，并表現(xiàn)出強(qiáng)大的臨床效果。

而此前對VSV與M蛋白的研究數(shù)據(jù)主要來源于小鼠，在BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明基質(zhì)蛋白M與細(xì)胞感染有關(guān)，但其在天然宿主致病機(jī)制中的作用并不清楚。與小鼠相比，VSV在天然宿主中與免疫細(xì)胞的互作模型回歸本體動物，使研究結(jié)果更具有參考意義。觀察DC感染病毒后的功能和表型變化，可幫助人們探究VSV傳播機(jī)制，通過比較M蛋白突變后病毒的致病性和免疫原性變化，也可為VSV病毒弱化和載體疫苗提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1病毒株與細(xì)胞

表達(dá)綠色熒光蛋白的野生型重組VSV(VSV-GFP)、M蛋白第51位甲硫氨酸缺失的重組病毒VSVΔM51-GFP、以及在VSVΔM51-GFP基礎(chǔ)上將第221位纈氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒌?26位絲基酸突變?yōu)榫彼岬闹亟M病毒(VSV-MT-GFP)、豬腎細(xì)胞系(IBRS2)和非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)、Monocyte及MoDC均由上海交通大學(xué)獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離制備和誘導(dǎo)。采血用豬為上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的中型西雙版納豬。

1.1.2主要試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清以及MHC II、CD80熒光抗體購自賽默飛。低吸附24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國康寧公司，細(xì)胞磁珠分選設(shè)備及CD14抗體購自德國Miltenyi公司，流式細(xì)胞儀分別用到BD公司FACSCalibur和Beckman Coulter公司的CytoFLEX型號，激光共聚焦顯微鏡為德國徠卡TCS SP5 II型號，TNF-α、IL-8、IFN-α檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1豬Monocyte及MoDC的分離及誘導(dǎo)

從豬心臟靜脈叢取血120 mL，加適量1 %肝素抗凝，緩慢移入裝有17 mL淋巴細(xì)胞分離液的50 mL離心管中，2000 r/min離心20 min，使離心機(jī)自然減速。將上層與中層之間的乳白色單個(gè)核細(xì)胞層用吸管吸出，加入紅細(xì)胞裂解液裂解5 min后再加DPBS緩沖液2000 r/min離心5 min，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照每107個(gè)細(xì)胞加入10 μL CD14磁珠抗體，室溫孵育10 min，加DPBS緩沖液離心后加入3 mL的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基過柱，將磁性分選柱從磁場中移走，用含10% FBS得到Monocyte細(xì)胞。將得到的Monocyte細(xì)胞計(jì)數(shù)，用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至2×106/mL，加入豬IL-4和GM-CFS，使二者工作濃度為10 ng/mL，將細(xì)胞移至表面低吸附24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，誘導(dǎo)5 d。

1.2.2MoDC的鑒定

把經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)的MoDC細(xì)胞從低吸附24孔板中輕輕吹打洗出，用DPBS洗1遍，用MHC II及CD80熒光抗體避光染色20 min，1000 r/min離心2 min，加入500 μL DPBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測MHC II和CD80含量。

1.2.3病毒在IBRS2、Monocyte及MoDC細(xì)胞的多步生長曲線

按MOI(multiplicity of infection)=1，用VSV-GFP、VSVΔM51-GFP和VSV-MT-GFP分別感染IBRS2、Monocyte及MoDC細(xì)胞，孵育1 h后，用DPBS洗3遍，在接種病毒后的2、8、12、24、48 h收集細(xì)胞上清，并依次按1∶103；1∶104；1∶105；1∶106；1∶107；1∶108稀釋后，感染12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的VERO細(xì)胞，37℃孵育1h后用PBS洗滌，按1∶1加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基和1 %低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，等凝膠冷卻凝固后，放置在5 %的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，待空斑形成后用微波爐加熱，棄去培養(yǎng)基和瓊脂糖凝膠，加入1 %的結(jié)晶紫染色液染色2 min后洗去染色液，晾干后選取合適的孔對空斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)病毒稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度，制作病毒多步生長曲線。

1.2.4Monocyte和MoDC細(xì)胞病毒感染檢測

分別按MOI=1將3種病毒接種MoDC細(xì)胞，按MOI=1和MOI=10接種Monocyte細(xì)胞。病毒孵育1 h后，用DPBS洗3遍，培養(yǎng)12 h。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞病毒感染率，隨后用激光共聚焦顯微鏡對感染病毒后MoDC及Monocyte觀察GFP熒光。

1.2.5細(xì)胞因子的檢測

按MOI=1將3種病毒接種MoDC細(xì)胞，孵育1 h后，用DPBS洗3遍，12 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-8和IFN-α。實(shí)驗(yàn)用RPMI-1640培養(yǎng)基作為空白對照，用未感染病毒的MoDC上清作為陰性對照。具體操作方法參照檢測試劑盒說明書。

2　結(jié)　果

2.1MoDC誘導(dǎo)后的鑒定

Monocyte誘導(dǎo)過程中，在顯微鏡下可以看到細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán)，從第三天開始逐漸呈現(xiàn)出典型的毛刺狀突起，呈現(xiàn)出MoDC細(xì)胞表型。將誘導(dǎo)得到的MoDC細(xì)胞用MHC II及CD80熒光抗體避光染色20 min，上流式細(xì)胞儀檢測。用未經(jīng)熒光抗體染色的陰性細(xì)胞設(shè)門，如圖1所示，MHC II及CD80/86表面標(biāo)志的雙陽性比例可達(dá)到86%左右，成熟的DC細(xì)胞高表達(dá)MHC II類分子和CD80/86共刺激分子[9]，表明誘導(dǎo)得到的細(xì)胞成熟度和一致性較高。

圖1　MoDC的純度鑒定

圖2　病毒在細(xì)胞中的生長曲線

2.2 3種病毒在IBRS2、Monocyte及MoDC中生長動力學(xué)特征

IBRS2作為一種豬腎細(xì)胞系，常用于很多豬瘟病毒的增殖，本實(shí)驗(yàn)以IBRS2細(xì)胞作為病毒在普通細(xì)胞中繁殖狀況。通過空斑試驗(yàn)對接毒后的細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒含量進(jìn)行定量，得到其各自的生長曲線。觀察病毒在IBRS2、Monocyte及MoDC中的生長曲線，如圖2(a)和(b)所示，3種病毒在IBRS2和MoDC均可進(jìn)行復(fù)制，IBRS2細(xì)胞在12 h時(shí)上清病毒濃度達(dá)到最大值，且隨著時(shí)間增加細(xì)胞逐漸凋亡，病毒滴度快速降低。MoDC細(xì)胞在感染病毒12 h后病毒滴度達(dá)到最大值，隨后病毒滴度維持在一定水平，下降趨勢緩慢。如圖2(c)，多次重復(fù)空斑實(shí)驗(yàn)表明病毒在Monocyte培養(yǎng)上清中的濃度并未增加。

2.3病毒在Monocyte和MoDC中的感染狀況

為了驗(yàn)證Monocyte這一DC前體細(xì)胞能否被VSV有效感染，用VSV-GFP分別在MOI=1和MOI=10的條件下感染Monocyte 12h后，進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測感染狀況。如圖3所示，重組病毒VSV-GFP感染Monocyte后，可以看到少量細(xì)胞發(fā)出GFP熒光，表明VSV可以感染Monocyte。用未感染VSV病毒的Monocyte細(xì)胞做為陰性對照，如圖4所示，在MOI=1時(shí)，Monocyte感染率為8.38%，當(dāng)感染細(xì)胞的病毒濃度提高十倍(MOI=10)，其感染率僅提高至16.56%。相比之下，VSV對MoDC的感染率明顯高于Monocyte，接種VSV-GFP 8 h后MoDC感染率可達(dá)到54%。

圖3　Monocyte 的共聚焦熒光圖像注：A、D為白光模式，B、E為488nm藍(lán)色激發(fā)光，C、F為自光模式和488nm藍(lán)色激發(fā)光的合并。

圖4　Monocyte病毒感染率

2.4VSV感染MoDC細(xì)胞對細(xì)胞因子分泌的改變

用ELISA檢測試劑盒對細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-8及IFN-α進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-8和IFN-α在感染前后發(fā)生了較大的變化。TNF-α和IFN-α在3種接毒MoDC上清中的濃度依次為VSVVSV>VSVΔM51。從圖5可知，TNF-α、IL-8和IFN-α在上清中的濃度高低與M基質(zhì)蛋白突變的程度有關(guān)，即M蛋白突變的程度越大，VSV引起細(xì)胞因子變化的的能力越強(qiáng)。值得注意的是，3種病毒在MoDC細(xì)胞中的生長動力學(xué)特征表現(xiàn)出同樣的趨勢。

圖5　MoDC感染病毒后細(xì)胞因子的表達(dá)變化

3　討　論

通過病毒的生長曲線可以證實(shí)，VSV在體外可以感染DC細(xì)胞。通過比較3種病毒的上清滴度，可知3種病毒在DC細(xì)胞中復(fù)制能力依次為VSV、VSVΔM51和VSV-MT，M蛋白作為VSV中重要的毒力因子，未突變的M蛋白可阻遏宿主細(xì)胞的mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)，一定程度上抑制感染的細(xì)胞產(chǎn)生干擾素[10]，可使病毒躲過宿主的免疫系統(tǒng)得以復(fù)制的同時(shí)，降低對宿主細(xì)胞殺傷性。在空斑實(shí)驗(yàn)中，野生型的重組病毒VSV形成的空斑較大且清晰，而VSV-MT形成的空斑斑痕相對模糊，毒力明顯弱于野生型VSV。

與病毒在MoDC中的表現(xiàn)不同，多次空斑實(shí)驗(yàn)均表明VSV無法在Monocyte中復(fù)制，激光共聚焦實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測說明Monocyte的感染率明顯低于MoDC。在研究登革熱病毒的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)登革熱病毒在Monocyte細(xì)胞中同樣無法擴(kuò)增[11]，表明部分病毒難以進(jìn)入Monocyte，而Singleton在研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)中發(fā)現(xiàn)PRRSV在Monocyte中的可以大量復(fù)制。以VSV為載體的疫苗雖然在動物實(shí)驗(yàn)中都產(chǎn)生了很好的保護(hù)效果，但由于減毒重組活載體疫苗有在體內(nèi)復(fù)制的特點(diǎn)，其安全性受到質(zhì)疑，因此，對Monocyte能被VSV感染卻無法復(fù)制的機(jī)制研究可為人們在VSV疫苗研制中提供思路。

VSV感染DC后能夠通過相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌激活DC細(xì)胞，發(fā)揮其抗原遞呈作用。病毒的免疫源性與致病性一般表現(xiàn)為對應(yīng)關(guān)系，當(dāng)VSV M蛋白突變后，其致病性下降，免疫原性往往隨之下降。而本研究中與野生型VSV和VSVΔM51相比，VSV-MT在表現(xiàn)出低復(fù)制和低毒性的特點(diǎn)的同時(shí)，卻能夠更大程度地激活DC細(xì)胞發(fā)揮作用，M蛋白作為參與宿主細(xì)胞凋亡的重要病毒因子，在MoDC細(xì)胞中因其突變產(chǎn)生穩(wěn)定差異將為研究與M蛋白相關(guān)的VSV載體疫苗提供參考和依據(jù)。

[1] MARTINEZ I, BARRERA J C, RODRIGUEZ L L, et al. Recombinant vesicular stomatitis (Indiana) virus expressing New Jersey and Indiana glycoproteins induces neutralizing antibodies to each serotype in swine, a natural host[J]. Vaccine,2004,22(29/30):4035-4043.

[2] FANG X, ZHANG S, SUN X, et al. Evaluation of attenuated VSVs with mutated M or/and G proteins as vaccine vectors[J]. Vaccine,2012,30(7):1313-1321.

[3] LANG P A, MERYK A, PANDYRA A A, et al. Toso regulates differentiation and activation of inflammatory dendritic cells during persistence-prone virus infection[J]. Cell Death and Differentiation,2015,22(1):164-173.

[4] PLEVIN R E, KNOLL M, MCKAY M, et al. The role of lipopolysaccharide structure in monocyte activation and cytokine secretion[J]. Shock,2016,45(1):22-27.

[5] GILLE C, STEFFEN F, LAUBER K, et al. Clearance of apoptotic neutrophils is diminished in cord blood monocytes and does not lead to reduced IL-8 production[J]. Pediatric Research,2009,66(5):507-512.

[6] EBERT O, HARBARAN S, SHINOZAKI K, et al. Systemic therapy of experimental breast cancer metastases by mutant vesicular stomatitis virus in immune-competent mice[J]. Cancer Gene Therapy,2005,12(4):350-358.

[7] FLANAGAN E B, ZAMPARO J M, BALL L A, et al. Rearrangement of the genes of vesicular stomatitis virus eliminates clinical disease in the natural host: new strategy for vaccine development[J]. Journal of Virology,2001,75(13):6107-6114.

[8] GARBUTT M, LIEBSCHER R, WAHL-JENSEN V, et al. Properties of replication-competent vesicular stomatitis virus vectors expressing glycoproteins of filoviruses and arenaviruses[J]. Journal of Virology,2004,78(10):5458-5465.

[9] CHAKRABORTY K, CHATTERJEE S, BHATTACHARYYA A. Modulation of phenotypic and functional maturation of murine bone-marrow-derived dendritic cells (BMDCs) induced by cadmium chloride[J]. International Immunopharmacology,2014,20(1):131-140.

[10] SIMON I D, VAN ROOIJEN N, ROSE J K. Vesicular stomatitis virus genomic RNA persists in vivo in the absence of viral replication[J]. Journal of Virology,2010,84(7):3280-3286.

[11] SCHMID M A, DIAMOND M S, HARRIS E. Dendritic cells in dengue virus infection: targets of virus replication and mediators of immunity[J]. Frontiers in Immunology,2014,5(657)647-647.

(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Study on Interactions of Vesicular Stomatitis Virus with Monocyte and MoDC

ZOUShengli1,NIEZuoming1,WUXiangfu1,FangXinkui2,SUNTao2

(1.School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2. Shanghai Municipal Veterinary Key Laboratory, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

In order to explore the interactions between VSV (Vesicular stomatitis virus) and immune cells of natural host, three recombinant VSVs, including the wild-type VSV-GFP, the VSV with M51 deletion (VSVΔM51-GFP) and the VSV with triple mutations of M51 deletion, V221F and S226R (VSV-MT-GFP), were used to infect the pig monocyte and monocyte-derived dendritic cell. The plaque experiment was done to make virus growth curve. Then confocal laser scanning microscope and Flow cytometry were used to assess the cell infection status. The change in cytokines expression in MoDC was detected by ELISA assay kit. The results show that three viruses can infect monocyte and MoDC, and virus infection rate of Monocyte is only 8.38%. The three viruses are unable to replicate in quantity in monocyte, but cannot proliferate in monocyte. Compared with wild-type VSV, the pathogenicity of VSVΔM51 and VSV-MTdecreases successively. They can effectively activate the expression of TNF-α, IL-8, IFN-α in MoDC， and the virus activation capacity is positively correlated with the degree of M protein mutation.

vesicular stomatitis virus; dendritic cell; MoDC; interaction; matrix protein M

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.09.019

2015-01-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272562)

鄒勝利(1990-)，男，河南駐馬店人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。

Q255

A

1673- 3851 (2016) 05- 0749- 05 引用頁碼： 090701