鐘奇?zhèn)?，蔡玉榮

(浙江理工大學材料與紡織學院，杭州 310018)

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球形碳酸鈣/羥基磷灰石的制備及藥物控釋

鐘奇?zhèn)?，蔡玉榮

(浙江理工大學材料與紡織學院，杭州 310018)

絲膠蛋白調(diào)控得到尺寸均一的球形碳酸鈣顆粒，并以此為硬模板，輔以水熱，制備羥基磷灰石微球。以鹽酸阿霉素為藥物模型，用合成的碳酸鈣、羥基磷灰石球形顆粒對其分別進行有效負載和可控釋放研究，并用體外實驗評價載藥顆粒對共培養(yǎng)細胞的影響。用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)、傅里葉紅外吸收光譜(FT-IR)、X射線粉末衍射(XRD)、紫外分光光度計和熒光顯微鏡等對樣品進行了檢測。結果表明：絲膠有利于碳酸鈣球霰石相的穩(wěn)定，同時通過離子交換反應可將碳酸鈣轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石，碳酸鈣和羥基磷灰石對鹽酸阿霉素最佳負載濃度分別為8 μg/mL和10 μg/mL，羥基磷灰石對藥物的控制釋放能力更強。體外Huh-7肝癌細胞實驗表明載藥顆粒對細胞的增殖有明顯抑制作用，證明所制顆粒的藥物負載和釋放功能。

碳酸鈣；羥基磷灰石；藥物載體；負載及釋放

0　引　言

骨組織工程[1]在治愈骨缺損時可以避免傳統(tǒng)骨移植存在的供體有限，復雜手術和免疫排斥反應等問題[2-3]，因此得到廣泛的研究。理想的支架材料不僅需要提供細胞黏附、增殖、分化的臨時場所，而且有對生長因子的強吸附能力。目前研究較多的支架材料主要有生物活性玻璃[4]、磷酸鈣骨水泥[5]、可注射水凝膠[6]等。

羥基磷灰石(HAP)是脊椎動物天然骨和牙齒的主要無機成分，因此具有良好的生物相容性和骨傳導性[7]，在骨組織工程中常被用作支架材料。同時，羥基磷灰石具有強吸附性，應用在催化、重金屬吸附和藥物緩釋等領域[8-10]。Kasuya等[11]發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石和不同濃度的明膠(10%～15%)在動物體內(nèi)實驗中表現(xiàn)出優(yōu)異的機械能力和生物降解性，并能促進新骨的生成。Jun等[12]將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2負載在多孔羥基磷灰石上，在生長因子逐步釋放下促進了新骨形成。

本實驗利用絲膠蛋白作為有機調(diào)控劑，制備了尺寸均一的球形碳酸鈣顆粒，并以此為硬模板，水熱法合成多孔羥基磷灰石微球。鹽酸阿霉素是一種高效抗癌藥，利用碳酸鈣和羥基磷灰石微球?qū)}酸阿霉素的負載和釋放，與Huh-7肝癌細胞的共培養(yǎng)表征兩種載體材料的藥物控釋能力。

1　實　驗

1.1實驗試劑

絲膠蛋白(分子量≈8000Da)來自湖州奧特絲生物化工有限公司；無水氯化鈣(CaCl2)、無水碳酸鈉(Na2CO3)、氫氧化鈉(NaOH)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、濃鹽酸(HCl)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、氯化鎂(MgCl2)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、無水乙醇等試劑均為分析純，Dio染色液、CCK-8試劑盒等購于杭州米克化工儀器有限公司；鹽酸阿霉素購于Sigma公司；肝癌Huh-7細胞為實驗室凍存的細胞。

1.2碳酸鈣微球的制備

室溫條件下，將0.2 M的CaCl2溶液緩慢滴加到2 g/L的絲膠蛋白溶液中，磁力攪拌混合均勻，用1 M的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至7。接著加入0.2 M的Na2CO3溶液，40 ℃水浴機械攪拌180 min。反應結束后，將白色懸濁液用0.22 μm的濾紙抽濾，將所得濾餅用無水乙醇和去離子水各洗3次，最后將濾餅放入60 ℃烘箱中干燥48 h。

1.3羥基磷灰石微球的制備

準確稱取5 g Na2HPO4·12H2O溶解于15 mL去離子水，完全溶解后用1 M NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至9.5。然后加入0.5 g球形碳酸鈣顆粒，磁力攪拌并超聲30 min，形成懸濁液后置于聚四氟乙烯反應釜中，在140 ℃烘箱中分別反應2、4、8、16 h。反應完成后，產(chǎn)物用0.22 μm的濾紙抽濾，將所得濾餅用無水乙醇和去離子水各洗3次，最后將濾餅放入60 ℃烘箱中干燥48 h。

1.4碳酸鈣和羥基磷灰石微球?qū)}酸阿霉素的負載

取濃度為10 μg/mL的鹽酸阿霉素溶液20 mL，加入10 mg 碳酸鈣顆粒，37 ℃水浴，110 r/min震蕩速率下保持24 h。負載完成后，將懸濁液高速離心，收集上清液，利用紫外可見分光光度計對上清液檢測，差值法計算顆粒上負載上的鹽酸阿霉素的量，用Origin軟件作圖，得出兩種顆粒對藥物的最佳負載濃度，實驗設置3個平行樣。羥基磷灰石負載實驗方法和碳酸鈣相同。

(1)

(2)

其中M總表示加入的總藥量；M上清中表示在離心后在上清中的殘余藥量；M材料表示載體材料的質(zhì)量[13]。

1.5載藥碳酸鈣和羥基磷灰石微球的體外釋放

將載有鹽酸阿霉素的顆粒20 mg分散在40 mL的0.01 M PBS緩沖液中，37℃水浴，110 r/min震蕩速率下保持24 h。在規(guī)定的時間內(nèi)取出樣品，在8000 r/min下離心15 min，吸取0.6 mL上清液用紫外分光光度計測定上清液中鹽酸阿霉素的含量，然后補充0.6 mL的PBS。用Origin軟件統(tǒng)計藥物累積釋放量。每個樣品設置3組平行樣。

1.6載藥碳酸鈣和羥基磷灰石微球體外細胞實驗

將碳酸鈣和羥基磷灰石微球用紫外線照射48 h滅菌。然后準確稱取兩種載藥顆粒各10 mg分別均勻平鋪到48孔板底部。加入處于對數(shù)生長期的Huh-7細胞懸濁液，并補加新鮮完全培養(yǎng)基至每孔細胞濃度為1.5×104cell/mL，實驗空白對照組為不加顆粒的情況下培養(yǎng)，每組實驗設置3個平行樣。用DiO細胞染色劑和CCK-8試劑盒表征。

DiO是一種親脂性膜染料，進入細胞膜后可以側(cè)向擴散逐漸使整個細胞的細胞膜被染色，在倒置熒光顯微鏡下可以直觀的觀察到細胞的形態(tài)和數(shù)量。

CCK-8試劑盒是一種基于WST-8的快速高靈敏度的試劑盒，主要用于細胞增殖及細胞毒性的檢測。就同一種細胞而言，其顏色深淺程度與細胞數(shù)量成線性關系，顏色越深，說明細胞的數(shù)量越多，材料毒性越小。

1.7材料表征

樣品分析：Hitachi公司 S4800場發(fā)射掃描電鏡分析，Thermo Electron 公司XTRA型X射線粉末衍射儀分析，Thermo Electron的Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜，Hitachi公司的U-2900型紫外分光光度計，Bio-Rad公司的680行酶標儀和日本Nikon公司的C2型激光共聚焦顯微鏡。

2　結果與分析

2.1碳酸鈣微球表征

圖1　碳酸鈣微球表征

2.2羥基磷灰石微球的表征

如圖2所示，隨著反應時間從2 h增加到16 h，顆粒始終保持良好的球形度，尺寸分布在5 μm左右。隨著反應時間的增加，微球表面的粗糙程度增加，由致密變成疏松多孔狀， 16 h時微球表面變得凹凸不平。因此，高溫高壓下延長水熱反應時間可以增加羥基磷灰石表面粗糙度，增大比表面積。

圖2　不同水熱時間下制備的羥基磷灰石微球FE-SEM圖

圖3　不同水熱時間下制備的羥基磷灰石微球

2.3藥物在碳酸鈣和羥基磷灰石微球上的負載行為

圖4為鹽酸阿霉素在300～650 nm的波長范圍內(nèi)的吸光度分布曲線，可知藥物的最大吸收波長為480 nm。然后分別配制一系列不同濃度的鹽酸阿霉素溶液，測定其在480 nm下的吸光度值，計算得到標準工作曲線方程為Y=0.01987X-0.00129，R2=0.99903。

圖4　鹽酸阿霉素標準工作曲線

在骨修復治療中，使用的藥物高效但昂貴，必須要提高藥物的有效使用率，所以定量研究載體材料的吸附能力十分必要。載藥量和載藥能力是評價載體材料負載能力的兩大指標。如圖5所示，對于10 mg的碳酸鈣顆粒，當鹽酸阿霉素的濃度從1 μg/mL增加到20 μg/mL時，載藥量從95%左右快速降至25%。同時，藥物濃度從1 μg/mL增加到8 μg/mL時，載藥能力直線式上升。濃度繼續(xù)增加到20 μg/mL時，載藥能力逐漸處于定值。綜合載藥能力和載藥量，10 mg的碳酸鈣負載8 μg/mL鹽酸阿霉素是最高效的。

圖5　鹽酸阿霉素的濃度對碳酸鈣藥物載藥量和載藥能力的影響

如圖6所示，對于10 mg的羥基磷灰石顆粒，當鹽酸阿霉素的濃度從1 μg/mL增至10 μg/mL時，羥基磷灰石微球載藥量保持在90%以上，緩慢下降，載藥能力快速上升。當藥物濃度繼續(xù)增至20 μg/mL，載藥量快速下降至50%，載藥能力變化趨于穩(wěn)定。綜合載藥能力和載藥量，10 mg的羥基磷灰石負載10 μg/mL鹽酸阿霉素是最高效的。

圖6　鹽酸阿霉素的濃度對羥基磷灰石藥物載藥量和載藥能力的影響

2.4藥物在碳酸鈣和羥基磷灰石微球上的釋放行為

圖7為鹽酸阿霉素在碳酸鈣和羥基磷灰石微球上的累積釋放量隨時間變化曲線。鹽酸阿霉素在碳酸鈣微球上的釋放可分為兩個階段：前期突釋和后期緩慢釋放。釋放開始至12 h，藥物釋放量迅速達到60%，平均釋放速率為18.3 μg/h，有明顯的突釋現(xiàn)象。到168 h，藥物釋放速度逐漸下降至穩(wěn)定，平均釋放速率為 1.5 μg/h，最終釋放量達到89.7%。對于羥基磷灰石微球，釋放開始至12 h，平均釋放速度為12.3 μg/h，釋放量達到36.8%。至96 h，藥物釋放速度相對變緩，平均釋放速率為 2.1 μg/h，釋放量達到44.3%。到168 h時釋放量基本達到穩(wěn)定，最終釋放了84.3%。 當釋放時間點在12 h，兩者的釋放量有顯著差異(p<0.05)，羥基磷灰石的突釋行為要小的多。如果要進一步減少前期突釋，可以對微球進行表面改性，增加對藥物的吸附能力。

圖7　載藥碳酸鈣和羥基磷灰石體外釋放曲線

2.5載藥顆粒的體外細胞實驗

圖8為Huh-7細胞與載藥碳酸鈣和羥基磷灰石微球共培養(yǎng)1、3、7d增殖實驗。如圖，在培養(yǎng)初期Huh-7細胞輪廓呈橢圓形，沒有偽足和觸角。培養(yǎng)1d后，碳酸鈣和羥基磷灰石上的細胞綠色熒光稍弱。3d后，基本只能看到星星點點的亮光，碳酸鈣上的細胞數(shù)量要多于羥基磷灰石。7d后，實驗組熒光強度非常弱，細胞基本凋亡。圖8(b)是用CCK-8試劑盒定量表征Huh-7細胞的增殖數(shù)量。與對照組相比，載藥顆粒對Huh-7細胞的生長有明顯抑制作用。1 d后，空白對照組的細胞數(shù)量比載藥顆粒上細胞數(shù)量多(p<0.05)。3d后，Huh-7細胞在獲得充足的營養(yǎng)后迅速增殖，載藥顆粒共培養(yǎng)的細胞數(shù)量減少，因為在釋放的鹽酸阿霉素作用下被殺死(p<0.01)。7d后，空白對照組的細胞數(shù)量進一步增加，而顆粒上的細胞進一步凋亡(p<0.01)。其中，在每個時間點，載藥羥基磷灰石對肝癌細胞的抑制效果要好于碳酸鈣，主要有兩個原因：一是羥基磷灰石負載的藥物量大于碳酸鈣，藥物釋放量大，對細胞的抑制作用明顯；二是羥基磷灰石能夠更好的保持藥物的活性，對Huh-7肝癌細胞的殺傷力更大。

圖8　載藥顆粒對Huh-7細胞增殖的影響

3　結　論

a) 在絲膠蛋白的調(diào)控下，得到尺寸均一的球形碳酸鈣顆粒。以其為硬模板，在磷酸根離子過飽和條件下合成了結晶度好、純度高的多孔羥基磷灰石微球。

b) 羥基磷灰石的負載能力要強于碳酸鈣。且藥物釋放過程中，碳酸鈣有突釋，而羥基磷灰石與藥物通過氫鍵或者靜電作用結合，控制藥物釋放能力較強。

c) 載藥顆粒與Huh-7肝癌細胞共培養(yǎng)7d發(fā)現(xiàn)，兩種載藥顆粒都對肝癌細胞增殖產(chǎn)生抑制，且羥基磷灰石的抑制作用更明顯。

[1] PETITE H, VIATEAU V, BENSAID W, et al. Tissue-engineered bone regeneration [J]. Nature Biotechnology,2000,18(9):959-963.

[2] SANTO V E, GOMES M E, MANO J F, et al. Controlled release strategies for bone, cartilage, and osteochondral engineering-part I: recapitulation of native tissue healing and variables for the design of delivery systems [J]. Tissue Engineering Part B: Reviews,2013,19(4):308-326.

[3] SUN X, KANG Y, BAO J, et al. Modeling vascularized bone regeneration within a porous biodegradable CaP scaffold loaded with growth factors [J]. Biomaterials,2013,34(21):4971-4981.

[4] YANG S, GUO Q, SHORES L S, et al. Use of a chondroitin sulfate bioadhesive to enhance integration of bioglass particles for repairing critical-size bone defects [J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A,2015,103(1):235-242.

[5] VENTURA M, SUN Y, CREMERS S, et al. A theranostic agent to enhance osteogenic and magnetic resonance imaging properties of calcium phosphate cements [J]. Biomaterials,2014,35(7):2227-2233.

[6] NI P Y, DING Q X, FAN M, et al. Injectable thermosensitive PEG-PCL-PEG hydrogel/acellular bone matrix composite for bone regeneration in cranial defects [J]. Biomaterials,2014,35(1):236-248.

[7] WANG J Q, ZHANG X D, NIE M, et al. Exotic spartina alterniflora provides compatible habitats for native estuarine crab sesarma dehaani in the yangtze river estuary [J]. Ecological Engineering,2008,34(1):57-64.

[8] JIANG S D, YAO Q Z, ZHOU G T, et al. Fabrication of hydroxyapatite hierarchical hollow microspheres and potential application in water treatment [J]. The Journal of Physical Chemistry C,2012,116(7):4484-4492.

[9] MIZUGAKI T, NAGATSU Y, TOGO K, et al. Selective hydrogenation of levulinic acid to 1, 4-pentanediol in water using a hydroxyapatite-supported Pt-Mo bimetallic catalyst [J]. Green Chemistry,2015,17(12):5136-5139.

[10] MAEHARA H, SOTOME S, YOSHII T, et al. Repair of large osteochondral defects in rabbits using porous hydroxyapatite/collagen (HAp/Col) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2) [J]. Journal of Orthopaedic Research,2010,28(5):677-686.

[11] KASUYA A, SOBAJIMA S, KINOSHITA M. In vivo degradation and new bone formation of calcium phosphate cement-gelatin powder composite related to macroporosity after in situ gelatin degradation [J]. Journal of Orthopaedic Research,2012,30(7):1103-1111.

[12] JUN S H, LEE E J, JANG T S, et al. Bone morphogenic protein-2 (BMP-2) loaded hybrid coating on porous hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering [J]. Journal of Materials Science: Materials in Medicine,2013,24(3):773-782.

[13] LIANG Y H, LIU C H, LIAO S H, et al. Cosynthesis of cargo-loaded hydroxyapatite/alginate core-shell nanoparticles (HAP@Alg) as pH-responsive nanovehicles by a pre-gel method [J]. ACS Applied Materials & Interfaces,2012,4(12):6720-6727.

[14] SORIANO-SOUZA C A, ROSSI A L, MAVROPOULOS E, et al. Chlorhexidine-loaded hydroxyapatite microspheres as an antimicrobial delivery system and its effect on in vivo osteo-conductive properties [J]. Journal of Materials Science: Materials in Medicine,2015,26(4):1-15.

[15] GUO Y J, WANG Y Y, CHEN T, et al. Hollow carbonated hydroxyapatite microspheres with mesoporous structure: Hydrothermal fabrication and drug delivery property [J]. Materials Science and Engineering: C,2013,33(6):3166-3172.

(責任編輯： 許惠兒)

Preparation of CaCO3and Hydroxyapatite Microsphere and Its Potential Application in Drug-Controlled Release

ZHONGQiwei,CAIYurong

(College of Materials and Textiles, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

Spherical CaCO3particles were fabricated in the presence of the silk sericin and then hydroxyapatite (HAP) microspheres were prepared by taking spherical CaCO3particles as the hard template via hydrothermal method. The load and controlled release of DOX·HCl were performed by using doxorubicin hydrochloride as drug model and applying the obtained CaCO3and HAP spheres as carries respectively. The influence of drug-loaded particles on cell culture was evaluated through in-vitro experiment. Field emission scanning electron microscope(FE-SEM), Fourier infrared absorption spectrum(FT-IR), X-ray diffraction pattern(XRD), UV spectrophotometer and confocal laser scanning microscopy were applied to characterize the samples. Results show that vaterite phase of CaCO3can be stabilized by silk sericin, and CaCO3can be transformed to HAP by the ion-exchange reaction. For the loading of drug, the optimum concentrations of DOX·HCl for CaCO3and HAP are 8 and 10 μg/mL separately. HAP has stronger ability for controlled release of drugs. In vitro cell experiment shows an obvious inhibition role of loaded-DOX·HCl particles for Huh-7 cells and potential application as drug carriers. This proves drug loading and releasing functions of the particles.

CaCO3; hydroxyapatite; drug carrier; loading and release

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.09.009

2015-11-16

國家自然科學基金項目(51202219)；浙江省自然科學基金項目(LY16E020013)

鐘奇?zhèn)?(1990-)，男，浙江湖州人，碩士研究生，主要從事生物材料方面的研究。

蔡玉榮，E-mail: caiyr@zstu.edu.cn

TB34

A

1673- 3851 (2016) 05- 0685- 06 引用頁碼： 090204