馮云

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210007）

離子色譜法測(cè)定牛奶中硫氰酸根方法的應(yīng)用及優(yōu)化

馮云*

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210007）

基于離子色譜測(cè)定牛奶中硫氰酸根的方法，通過(guò)對(duì)相關(guān)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步證實(shí)了牛奶樣品中含有硫氰酸根的乳過(guò)氧化物酶體系具有防腐保鮮的作用。該方法可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地應(yīng)用于牛奶中硫氰酸根的測(cè)定。

離子色譜法；硫氰酸根；乳過(guò)氧化物酶體系

1 前言

論述牛奶樣品添加硫氰酸必要性及現(xiàn)狀等。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牛奶樣品直接添加硫氰酸鈉，并將樣品保存在恒溫恒濕的環(huán)境中，然后經(jīng)過(guò)1、2、4、8、12、16、24、48h和72h的時(shí)間間隔后，分別測(cè)定牛奶樣品中硫氰酸根的本底含量以及經(jīng)過(guò)這些時(shí)間間隔之后的硫氰酸根的含量，從而判斷在代謝體系中硫氰酸根的含量是否受到影響。［1］

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要試劑

試驗(yàn)所用試劑及其生產(chǎn)廠(chǎng)家見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所用試劑及其生產(chǎn)廠(chǎng)家

2.2 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)所用儀器及其生產(chǎn)廠(chǎng)家見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)所用儀器及其生產(chǎn)廠(chǎng)家

2.3 實(shí)驗(yàn)原理

試驗(yàn)樣品經(jīng)直接添加硫氰酸鈉模擬硫氰酸根環(huán)境后，將其保存在恒溫恒濕的環(huán)境條件下，經(jīng)過(guò)一段代謝時(shí)間之后，對(duì)牛奶樣品中硫氰酸根的本底含量以及代謝后的含量進(jìn)行測(cè)定。首先稱(chēng)取液體乳制品4～5g于25mL比色管中，加入乙腈5mL左右至10mL刻度線(xiàn)，劇烈振蕩，超聲萃取10min后，于4℃冰箱內(nèi)靜置10min來(lái)沉淀蛋白。吸取上清液1mL于10mL比色管中，用水定容至10mL搖勻，將稀釋后的溶液經(jīng)過(guò)RP柱和0.22μm濾膜，濾液進(jìn)小瓶后待上機(jī)分析。

2.4 試驗(yàn)方法的優(yōu)化

2.4.1 樣品準(zhǔn)備

直接將液體奶樣品（鮮牛乳、酸牛乳等）稱(chēng)量4～5g到25mL的比色管中；對(duì)于乳粉等固體樣品，稱(chēng)取適當(dāng)樣品，加入適量水混勻制成復(fù)原乳再稱(chēng)取樣品；對(duì)于奶酪、奶油等半固體樣品，稱(chēng)取適量樣品，加入海砂，研磨混勻再稱(chēng)取樣品。注意此時(shí)不要將奶樣品碰觸到10mL刻度線(xiàn)以上的管壁上，防止添加乙腈后管壁上的蛋白沉淀不下來(lái)，影響試驗(yàn)結(jié)果。

2.4.2 沉淀蛋白

生鮮奶中含有豐富的蛋白質(zhì)，測(cè)定前必須將其去除，否則會(huì)造成色譜柱污染。用滴管直接將乙腈液體添加到比色管中，此時(shí)奶樣品∶乙腈的比值大約在5∶5，劇烈震蕩，在超聲波清洗機(jī)里放置10min，目的是為了徹底混合均勻牛奶樣品和沉淀劑乙腈，最大作用地發(fā)揮蛋白沉淀劑的功能。然后在4℃的冰箱里放置10min來(lái)沉淀蛋白，因?yàn)樵诘蜏貤l件下蛋白沉淀效果明顯優(yōu)于常溫條件。蛋白沉降效果優(yōu)于常溫條件，兩者沉降的結(jié)果對(duì)回收率沒(méi)有顯著影響，沉降時(shí)間以10min為優(yōu)［2］。

圖1 超聲提取樣品效果圖

對(duì)于硫氰酸鹽的提取，曾采用過(guò)直接震蕩提取的方法，但是提取效果明顯沒(méi)有超聲提取10min快速高效，超聲5、10、20、30min和40min對(duì)提取結(jié)果的影響見(jiàn)圖1，圖1表明超聲10min提取樣品結(jié)果較好。

在這個(gè)去雜過(guò)程中，也有通過(guò)添加無(wú)機(jī)沉淀劑來(lái)完成的，如常用的醋酸鋅+亞鐵氰化鉀，但是此方法會(huì)在測(cè)定體系中帶入金屬離子，并對(duì)提取結(jié)果的穩(wěn)定性有影響；而若加入有機(jī)沉淀劑如乙醇，沉淀效果不佳。

2.4.3 固相萃取

從冰箱內(nèi)將樣品取出來(lái)，此時(shí)可以看到明顯的上清液分層，準(zhǔn)確抽取1mL上清液到10mL比色管中，定容到線(xiàn)，此時(shí)上清液即被稀釋了10倍（若在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)上清液過(guò)少，分層不明顯，可以用離心機(jī)離心之后再抽取1mL的上清液）。此時(shí)就可以準(zhǔn)備用全自動(dòng)固相萃取儀來(lái)除去脂肪等大分子物質(zhì)，全自動(dòng)固相萃取小柱是ON GUARRP（2.5mL），或相當(dāng)者（如C18），使用前依次用5mL甲醇和10mL水進(jìn)行活化，最后獲得6mL萃取后的樣品溶液。

2.4.4 過(guò)膜進(jìn)樣

用針管吸取固相萃取后的樣品過(guò)0.22μm的聚醚砜水相針式濾膜，進(jìn)入走樣小瓶，等待上機(jī)走樣分析。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)系列的配置

稱(chēng)取1mL的硫氰酸根母液，即硫氰酸根離子標(biāo)液（1 000mg/L），置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度線(xiàn)，此溶液含硫氰酸10mg/L，此溶液為標(biāo)準(zhǔn)中間液。

分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 和3.0mL硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液，用水定容到10mL容量瓶中，此時(shí)硫氰酸根的濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/L和3.0mL/L。此溶液使用時(shí)現(xiàn)配。

2.6 色譜條件

色譜分析條件見(jiàn)表3。

3 結(jié)果與討論

3.1 代謝體系中硫氰酸根含量變化規(guī)律

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳過(guò)氧化物酶體系由三部分組成：乳過(guò)氧化物酶（LP）、硫氰酸根（SCN-）、過(guò)氧化氫（H2O2），只有在這三種成分都存在的情況下，乳過(guò)氧化物酶體系才具有活性。乳過(guò)氧化酶體系的反應(yīng)機(jī)制是根據(jù)H2O2濃度的不同和是否存在外源電子供體而不同的。其中，SCN-通過(guò)與過(guò)氧化等效的2個(gè)電子直接傳遞給過(guò)氧化酶與H2O2反應(yīng)的產(chǎn)物而被氧化，產(chǎn)生短暫存在的OSCN-中間氧化產(chǎn)物，其可殺死或抑制很多微生物的生長(zhǎng)和代謝；另外，LP能催化I-、SCN-和一定濃度Br-，但不能使Cl-氧化，因?yàn)镃l-不能作為L(zhǎng)P的底物，而SCN-可作為生理上的酶底物。因此，試驗(yàn)創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)了一定的時(shí)間梯度，來(lái)檢測(cè)經(jīng)過(guò)一段的代謝時(shí)間之后，牛奶中的硫氰酸根是否存在代謝消耗的現(xiàn)象，從而驗(yàn)證含有硫氰酸根的牛奶是否確實(shí)存在一定的保鮮作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

表3 色譜分析條件

從圖2可以看出，代謝初始，硫氰酸根的含量是明顯減少的，當(dāng)減少到一定的含量范圍后就逐漸趨于平衡，含量逐漸穩(wěn)定下來(lái)，趨于一個(gè)固定的含量值。

圖2 代謝體系中硫氰酸根的含量變化

由圖2可以看出，硫氰酸根的含量隨時(shí)間延長(zhǎng)在逐漸減少。

3.2 代謝體系中牛乳酸度變化規(guī)律

牛奶在存放過(guò)程中由于微生物的活動(dòng)，分解乳糖為乳酸，使牛奶的酸度增高。牛奶的酸度越高，說(shuō)明牛奶受微生物污染的程度越嚴(yán)重。因此，可以通過(guò)測(cè)定牛奶的酸度評(píng)價(jià)牛奶的新鮮度，查看保鮮效果。具體結(jié)果參看圖3。

圖3 牛乳酸度的測(cè)定

3.3 代謝體系中硫氰酸根含量與牛乳酸度關(guān)系

為了驗(yàn)證硫氰酸根的減少是否真的用于乳過(guò)氧化物酶體系中來(lái)達(dá)到防腐的作用，可以通過(guò)測(cè)量牛奶的酸度值來(lái)驗(yàn)證，圖3可以看出，隨著硫氰酸根含量的增加，在相同代謝時(shí)間后的牛奶算酸度是不同的，硫氰酸根的含量越多，牛奶酸度相對(duì)越低，得出了硫氰酸根確實(shí)可以減慢牛奶的腐敗速度的結(jié)論。所以，目前乳過(guò)氧化物酶體系在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，主要是在乳品工業(yè)中用于原乳的儲(chǔ)存和運(yùn)輸，在食品行業(yè)的發(fā)展前景是非常巨大的。

4 結(jié)語(yǔ)

試驗(yàn)采用離子色譜直接測(cè)量牛奶中的硫氰酸根，檢測(cè)條件穩(wěn)定，加標(biāo)回收率較高，變異系數(shù)較小，重復(fù)性好，檢出限低。整個(gè)方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度較高，可操作性強(qiáng)，應(yīng)用簡(jiǎn)單方便。其對(duì)質(zhì)檢部門(mén)開(kāi)展乳制品硫氰酸根殘留檢驗(yàn)，打擊非法添加行為具有現(xiàn)實(shí)參考價(jià)值，對(duì)生鮮乳硫氰酸根國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)的制定具有重要意義。

Application and Optimization of Ion Chromatography for Determination of Thiocyanate in Milk

Feng Yun
(Jiangsu Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Jiangsu Nanjing 210007)

Based on ion chromatography for the determination of milk thiocyanate method, through the optimization of the test conditions, it further confirmed that the milk sample contains the root of the sulfur acid in the root of the oxide enzyme system had the role of anti-corrosion. This method is simple, rapid and accurate for the determination of thiocyanide.

Ion chromatography; Thiocyanide; Lactoperoxidase system

TS255

A

2096-0387（2016）04-0016-03

馮云（1985-）女，湖南衡陽(yáng)人，本科，助理工程師，研究方向：食品安全

[1]潘丙珍,劉青,龐世琦,等.離子色譜法測(cè)定酒中的有機(jī)酸和無(wú)機(jī)陰離子[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(4):876-880.

[2]張磊,周光明,熊建飛.離子色譜法測(cè)定水果和果醬中的3種糖[J].食品科技,2013,39(3):259-263.