趙文靜，張晶，修江帆

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550025）

德國小蠊核糖體相關(guān)膜蛋白的克隆和表達(dá)

趙文靜，張晶，修江帆

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550025）

通過同源克隆獲得德國小蠊RAM P的cDN A，并成功進(jìn)行原核表達(dá)，使用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定和分析。結(jié)果表明，德國小蠊RAM P的cDN A全長(zhǎng)195bp，編碼64個(gè)氨基酸，與諸多昆蟲的RAM P具有較高的同源性，是堿性的小分子膜整合蛋白，單次跨膜，親水性較高。該研究能夠?yàn)榈聡◇筊AM P的功能研究提供有價(jià)值的基礎(chǔ)材料。

德國小蠊；核糖體相關(guān)膜蛋白；克隆；原核表達(dá)

德國小蠊（Blattellagermanica）是蜚蠊目昆蟲中分布最為廣泛的種類，與人類生活密切相關(guān)。其適應(yīng)能力強(qiáng)，繁殖快，并具有遷徙、擴(kuò)散的習(xí)性，已成為全球最普遍、最難治理的城市衛(wèi)生害蟲［1］。

核糖體相關(guān)膜蛋白（Ribosome-associated Membr ane Protein，RAMP），又稱壓力相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（Stressassociated Endoplasmic Reticulum Protein，SERP），是一類與應(yīng)激相關(guān)的蛋白。Yamaguchi等［2］使用缺氧大鼠模型，獲得大鼠RAMP的cDNA，并驗(yàn)證在缺氧條件下，大鼠通過過表達(dá)RAMP以抑制其他膜蛋白的合成。而當(dāng)環(huán)境壓力（缺氧）解除后，該蛋白能夠促進(jìn)新合成蛋白的谷氨酸化?，F(xiàn)今，多種昆蟲RAMP的cDNA和EST已經(jīng)獲得并上傳至NCBI，但與昆蟲相關(guān)的研究文獻(xiàn)較少，僅查閱到2005年Yao等［3］克隆并鑒定家蠶的RAMP蛋白。鑒于此，該研究克隆并表達(dá)德國小蠊RAMP蛋白，使用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定和分析，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

德國小蠊敏感系引種于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，繁殖并飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室蜚蠊目養(yǎng)殖室。飼養(yǎng)溫度28℃，相對(duì)濕度65%，自然光照。取成蟲作為試驗(yàn)材料。

1.2 RAMP基因的克隆及測(cè)序

按照TAKARA公司RNAiso PLUS說明書提取總RNA，經(jīng)電泳檢測(cè)及GeneQuant公司核酸定量分析儀測(cè)定，選取A260/A280的比值范圍為1.95～2.00的樣本，以1μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

根據(jù)美洲大蠊RAMP的EST序列（NCBI登錄號(hào)：FG130770），設(shè)計(jì)同源克隆的引物。引物設(shè)計(jì)軟件為Primer Primer5.0［4］，引物為：上游5‘-ATGGCACCAAAACAAAGAATGCG-3’，下游5‘-TTAGGCTGCTCTGATGCTCTGG-3’。使用該引物對(duì)上述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接至載體pMD18-T，送上海生工生物公司測(cè)序鑒定。

1.3 RAMP蛋白的原核表達(dá)及鑒定

以克隆基因pMD18T-RAMP質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，純化定量。將純化產(chǎn)物與pEASY-E1載體25℃連接10min，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1，次日挑取陽性克隆，放入含芐青霉素（50mg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒選用載體T7啟動(dòng)子上游引物、T7終止于下游引物及目的基因上游、下游引物進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，次日挑取陽性克隆，進(jìn)行PCR鑒定。

取過夜培養(yǎng)的菌液60μL，加入含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min震搖約5h至OD600=0.6，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取過夜誘導(dǎo)表達(dá)的pEASY-RAMP菌液，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.4 RAMP基因的生物信息學(xué)分析

使用Pfam［5］確認(rèn)蛋白的基因家族。使用ORF Finder［6］預(yù)測(cè)cDNA的開放閱讀框。使用Protparam［7］分析蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)和親水性。使用TMHMM［8］預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 德國小蠊RMAP全長(zhǎng)cDNA

以德國小蠊成蟲cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。其中，第一泳道標(biāo)示連接著上下游特異引物的目的產(chǎn)物，約200bp；第三四泳道標(biāo)示的PCR產(chǎn)物結(jié)果與第二泳道接近，說明重組質(zhì)粒連接方向正確。測(cè)序結(jié)果顯示，德國小蠊RAMP的cDNA全長(zhǎng)195bp，測(cè)序結(jié)果與電泳結(jié)果一致。序列上傳至NCBI，登錄號(hào)為KT820541。

圖1 cDNA模板及pEASY-RMAP重組質(zhì)粒

2.2 德國小蠊重組質(zhì)粒的原核表達(dá)

SDS-PAGE電泳（見圖2）顯示，在約10kD處有外源蛋白表達(dá)條帶出現(xiàn)，除去pEASY載體HIS標(biāo)簽及部分載體蛋白（大小約3.2kD），電泳產(chǎn)物與目標(biāo)蛋白的理論分子量6.97kD基本一致。而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株在此位置無顯著條帶，說明目的蛋白表達(dá)成功。

圖2 RAMP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.3 德國小蠊RAMP的生物信息學(xué)分析

ORF Finder預(yù)測(cè)德國小蠊RAMP的cDNA編碼64個(gè)氨基酸（見圖3）。經(jīng)Blastp比對(duì)發(fā)現(xiàn)，德國小蠊RAMP與美洲大蠊、臺(tái)灣家白蟻、柑橘木虱、歐洲熊蜂等多種昆蟲的RAMP序列相似度超過80%，與一些魚類的序列相似度也高達(dá)70%左右，這說明RAMP蛋白是一類高度保守的蛋白，推測(cè)由管家基因編碼。

圖3 德國小蠊RAM的cDNA及編碼氨基酸

Pfam檢測(cè)該蛋白屬于核糖體相關(guān)膜蛋白4超家族（RAMP4，PF06624）。使用該序列與多種昆蟲的RAMP作為種子序列在德國小蠊的基因組上進(jìn)行tBlastn檢索，僅發(fā)現(xiàn)一段核酸序列（JPZV01234229.1）與之對(duì)應(yīng)，由此推測(cè)該基因是單拷貝基因，其基因家族在德國小蠊基因組中只有一個(gè)成員。

Protparam預(yù)測(cè)蛋白理論分子量為6.99kD，等電點(diǎn)pI為10.38，親水性平均系數(shù)GRAVY為-0.058。TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白包含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域：36～58aa處（見圖4）。這些結(jié)果表明德國小蠊RAMP是堿性的小分子膜整合蛋白，單次跨膜，且親水性較高。

圖4 德國小蠊RAMP蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域

3 結(jié)論

該研究通過同源克隆獲得德國小蠊RAMP的全長(zhǎng)cDNA，并成功對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)。此外，使用生物信息學(xué)方法分析了該基因及其編碼蛋白的理化特性等，為進(jìn)一步研究德國小蠊RAMP的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]霍京.德國小蠊(Blattellagermanica)的種群特性及控制策略研究[D].濟(jì)南:山東師范大學(xué),2012.

[2]Y amaguchi A, Hori O, Stern D M, et al. Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1 (SERP1)/Ribosome-associated membrane protein 4 (RAMP4) stabilizes membrane proteins during stress and facilitates subsequent glycosylation[J].Journal of Cell Biology,1999,147(6):1195-204.

[3]Yao Q, Hu Z, Xu J, et al. Cloning and Characterization of Ribosomeassociated Membrane Protein 4 (RAMP4) gene in silkworm Bombyxmori[J].Research,2005,10(2):125-129.

[4]Lalitha S. Primer Premier 5[J]. Biotech Software & Internet Report,2000.

[5]Finn R D, Coggill P, Eberhardt R Y, et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future[J].Nucleic Acids Research,2015,44(Database issue):D279-D285.

[6]Hancock J M, Bishop M J. ORF Finder (Open Reading Frame Finder)[M]. Dictionary of Bioinformatics and Computational Biology.U.S.A.:John Wiley & Sons, Inc. 2004.

[7]Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, et al. In The Proteomics Protocols Handbook[M]. The Proteomics Protocols Handbook.Totowa, NJ:Humana Press, 2005:571-607.

[8]M?ller S, Croning M D R, Apweiler R. Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions[J].Bioinformatics, 2001,17(7):646-53.

Cloning and Expression of Ribosome Associated Membrane Protein of Blattellagermanica

Zhao Wen-jing, Zhang Jing, Xiu Jiang-fan
(School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guizhou Guiyang 550025)

cDNA of BlattellagermanicaRAMP was obtained by Homologous cloning, successfully carried out the prokaryotic expression,and identified and analyzed it by using biological information method. The results showed that the ramp of BlattellagermanicacDNAwas 195bp, code 64 amino acids, RAMP had high homology with many insects, it was a basic small molecular membrane integrated protein, with a single transmembrane and high hydrophilicityThis study could provide material basis for the valuable function of RAMP of Blattellagermanica.

Blattellagermanica; Ribosome associated membrane protein; Cloning; Prokaryotic expression

S718.45

A

2096-0387（2016）04-0056-03

趙文靜（1982-），女，貴州銅仁人，碩士，講師，研究方向：昆蟲分子生物學(xué)。

修江帆（1984-），男，博士，副教授，研究方向：昆蟲資源利用。