熊偉，曾梅花，韓曉丹，徐國良，袁菊如，鄧朝陽

（1. 江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西 南昌，330096；2. 江西出入境檢驗(yàn)檢疫局，江西南昌 330002）

茶殼中原花青素的抗氧化活性研究

熊偉1，曾梅花2，韓曉丹1，徐國良1，袁菊如1，鄧朝陽1

（1. 江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西 南昌，330096；2. 江西出入境檢驗(yàn)檢疫局，江西南昌 330002）

以茶殼為原料，提取分離其中的原花青素，并研究其抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：原花青素對(duì)DPPH自由基、羥基自由基（·O H）、超氧陰離子自由基（O2-·）具有較強(qiáng)的清除作用；通過還原力和總抗氧化活性的測(cè)定，證明原花青素的抗氧化能力略高于抗氧化劑BHT。

茶殼；原花青素；自由基；抗氧化活性

原花青素是具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的黃烷醇及其聚合體，在結(jié)構(gòu)上是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成［1-2］。它具有很強(qiáng)的生物活性，能清除人體內(nèi)過剩自由基，提高人體免疫力，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無毒的新型抗氧化劑［3］。

目前，原花青素主要從葡萄籽中獲得［4-5］，而從茶殼中提取分離的研究報(bào)道較少。茶殼是油茶去仁后留下的外種皮［6］，目前茶殼一般被廢棄，僅有少部分作為燃料、培養(yǎng)食用菌以及用于制造活性碳等物質(zhì)［7-8］。 本研究以茶殼中提取分離的原花青素為研究對(duì)象，通過自由基清除、還原力和總抗氧化活性的測(cè)定，并與傳統(tǒng)抗氧化劑BHT對(duì)比，研究其抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶殼（采自江西上饒，60℃干燥24h備用）；原花青素對(duì)照品（天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司）；SOD試劑盒（南京建成科技有限公司）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、硫酸亞鐵、水楊酸、鉬酸胺、磷酸鈉、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵等（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計(jì)（北京普析科學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化科技有限公司）；高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；JM-10002天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶殼中原花青素的提取分離實(shí)驗(yàn)

采用課題組自有專利技術(shù)提取分離茶殼中的原花青素［9］，具體方法為：準(zhǔn)確稱取一定量干燥后的茶殼，粉碎至60目過篩，采用乙醇浸提其中的原花青素：提取溫度為70℃，提取時(shí)間為120 min，乙醇濃度為65%，液料比為20ml/g，提取完畢后濃縮提取液備用。采用大孔樹脂S-8對(duì)提取液進(jìn)行吸附，調(diào)節(jié)上柱液中原花青素的濃度為1.5mg/ml，pH值為6，吸附流速為1.5BV/h，吸附完畢后采用30%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液濃縮干燥后得到原花青素樣品備用，經(jīng)檢測(cè)其純度達(dá)到75%以上。

1.3.2 原花青素抗氧化性能的測(cè)定

通過對(duì)制備的原花青素樣品進(jìn)行DPPH自由基、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）清除，還原力以及總抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，并與傳統(tǒng)抗氧化劑BHT進(jìn)行對(duì)比，從而對(duì)原花青素的抗氧化性能進(jìn)行全面、客觀的評(píng)價(jià)。

1.3.2.1 原花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用

采用DPPH分光光度法測(cè)定原花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用［10］。具體方法為：稱取一定量的原花青素，配置成不同濃度的溶液 （5、10、20、40、60、80、100ug/ml）。精密吸取2ml不同濃度的樣品溶液，分別加入0.1 mmoL/L DPPH無水乙醇溶液2mL，搖勻后于40℃恒溫避光靜置30min，于517nm波長處測(cè)定樣品吸光度，BHT做為陽性對(duì)照。自由基清除率按下列公式計(jì)算：

注：A0：不加樣品時(shí)的吸光度值；A1：加入樣品溶液后的吸光度值；A2：不加DPPH時(shí)樣品本身的吸光度值。

1.3.2.2 原花青素對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

采用水楊酸法測(cè)定原花青素對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用［11］。具體方法為：精密吸取不同濃度的樣品溶液1 mL（50、100、200、400、600、800、1 000ug/ml），分別加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液和1.5mL水楊酸-乙醇溶液，然后加入0.1 mL 0.03%H2O2，于37 ℃反應(yīng)0.5 h后放入離心機(jī)，以3000 r/min的速度離心10 min，于510 nm處測(cè)定吸光度， BHT做為陽性對(duì)照。羥基自由基（·OH）清除率按下列公式計(jì)算：

注：A0：不加樣品時(shí)的吸光度值；A1：加入樣品溶液后的吸光度值；A2：不加H2O2時(shí)的樣品本身的吸光度值。

1.3.2.3 原花青素對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

采用黃嘌呤氧化酶法，參照SOD試劑盒的方法進(jìn)行測(cè)定［12］。具體方法為：將樣品配制成不同濃度的溶液（50、100、200、400、600、800、1 000ug/ml），按照試劑盒的方法進(jìn)行測(cè)定，BHT做為陽性對(duì)照。按下列公式計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率：

注：A0為空白管的吸光度值， A1為樣品管的吸光度值。

1.3.2.4 原花青素還原力的測(cè)定

采用普魯士藍(lán)法測(cè)定原花青素的還原力［13］。具體方法為：分別取1ml不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（50、100、200、400、600、800、1000ug/ml），依次加入2.5mL、0.2mol/L PBS緩沖液（ pH6.6）和2.5mL、1%鐵氰化鉀于50 ℃水浴中保溫20min后快速冷卻，再加入2.5mL、10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水，2.5mL，0.1% 三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10min后，在700nm下測(cè)定其吸光度值， BHT做為陽性對(duì)照，吸光度值越高還原力越強(qiáng)。

1.3.2.5 原花青素總抗氧化活性的測(cè)定

采用Prieto法測(cè)定原花青素的總抗氧化活性［14］。具體方法為：在試管中依次加入3 mol/L H2S04溶液1m1，0.14mol/L Na3P04溶液1m1和0.02 mol/L鉬酸銨溶液1 ml，再加入1ml不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（50、100、200、400、600、800、1 000ug/ml），蒸餾水定容至5 ml，加塞搖勻，在95℃水浴中加熱90 min，取出冷卻后在695nm波長下測(cè)定吸光度，吸光度值越高總抗氧化活性越強(qiáng)。以不加樣品作為空白對(duì)照，BHT做為陽性對(duì)照，

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用

原花青素對(duì)DPPH自由基清除率的影響見圖1。由圖1可知，隨著原花青素質(zhì)量濃度的增加， DPPH自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度達(dá)到60 ug/ml以上時(shí)，清除率基本趨于平衡。這可能是由于原花青素質(zhì)量濃度越高，其作為自由基的接受體阻礙自由基連鎖反應(yīng)的能力也就越強(qiáng)，因而DPPH自由基的清除能力也越強(qiáng)。與抗氧化劑BHT相比，在5-40ug/ml范圍內(nèi)，原花青素對(duì)DPPH自由基的清除率略低于BHT，在40-100 ug/ml范圍內(nèi)，原花青素對(duì)DPPH自由基的清除率略高于BHT。

圖1 原花青素對(duì)DPPH自由基清除率的影響

2.2 原花青素對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

原花青素對(duì)羥基自由基（·OH）清除率的影響見圖2。由圖2可知，隨著原花青素質(zhì)量濃度的增加，羥基自由基的清除率表現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì)?？傮w而言，原花青素對(duì)羥基自由基（·OH）的清除效果要明顯強(qiáng)于BHT。

2.3 原花青素對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

圖2 原花青素對(duì)羥基自由基（·OH）清除率的影響

原花青素對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的影響見圖3。由圖3可知，隨著原花青素質(zhì)量濃度的增加，超氧陰離子自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到800 ug/ml時(shí)，清除率基本保持不變。與抗氧化劑BHT相比，在50-600ug/ml范圍內(nèi)，原花青素對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率略低于BHT，在800-1 000 ug/ml范圍內(nèi)，原花青素與BHT基本接近。

圖3 原花青素對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的影響

2.4 原花青素還原力的測(cè)定

原花青素還原力的測(cè)定見圖4。由圖4可知，隨著原花青素質(zhì)量濃度的不斷增加，原花青素的還原力也不斷增強(qiáng)。在50-600ug/ml范圍內(nèi)，增長速度較快，幾乎呈直線增長。當(dāng)濃度達(dá)到600 ug/ml以后，增長速度有所減緩。與抗氧化劑BHT相比，原花青素的還原力略高于BHT。

圖4 原花青素的還原力

2.5 原花青素總抗氧化活性的測(cè)定

原花青素總抗氧化活性的測(cè)定見圖5。由圖5可知，隨著原花青素質(zhì)量濃度的增加，原花青素的總抗氧化活性不斷增強(qiáng)，并表現(xiàn)出與還原力相近的趨勢(shì)。與抗氧化劑BHT相比，原花青素的總抗氧化活性略高于BHT。

圖5 原花青素的總抗氧化活性

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：茶殼中提取的原花青素對(duì)DPPH自由基、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）具有較強(qiáng)的清除作用；通過還原力和總抗氧化活性的測(cè)定，證明原花青素的抗氧化活性略高于抗氧化劑BHT。因此，茶殼中提取的原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，作為天然抗氧化劑具有良好的開發(fā)前景。

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Study on antioxidative activity of procyanidin from episperm of tea seeds

Xiong Wei1，Zeng Mei-hua2，Han Xiao-dan1，Xu Guo-liang1，Yuan Ju-ru1，Deng Zhao-yang1
(1. Institute of Applied Chemistry，Jiangxi Academy of Sciences，Jiangxi Nanchang 330096 PRC ; 2.Jiang Xi entry-exit inspection and quarantine bureau of PRC，Jiangxi Nanchang 330002 PRC）

In this paper, the procyanidin was extracted from episperm of tea seeds and antioxidative activity was researched. The results indicated that procyanidin had strong scavenging effect to DPPH, hydroxyl and superoxide radical ; The antioxidant activity of procyanidin was slightly higher than BHT by the determination of reducing power and total antioxidative activity,

episperm of tea seeds；procyanidin；radical；antioxidative activity

R285.3

A

2096-0387（2016）04-0001-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260400）；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（20151BBF60002）；江西省科學(xué)院重大科技專項(xiàng)（2016-YZD1-01）；江西省科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2013-YQC-6）。

熊偉（1982—），男（漢族），副研究員，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。