陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科(西安710068)

趙　娜　張　勇▲　劉小軍　夏東雨　徐姣姣　劉仲偉　潘　 碩　于海奕△

?

·論著·基礎(chǔ)研究·

PPARγ上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞中miR-148b表達(dá)不依賴于轉(zhuǎn)錄水平*

陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科(西安710068)

趙娜張勇▲劉小軍夏東雨徐姣姣劉仲偉潘 碩于海奕△

目的：探討PPARγ是否能上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞中miR-148b表達(dá)，以及PPARγ上調(diào)miR-148b表達(dá)是否依賴于轉(zhuǎn)錄水平。方法：利用吡格列酮刺激大鼠H9C2心肌細(xì)胞PPARγ激動，應(yīng)用GW9662特異性拮抗大鼠心肌細(xì)胞PPARγ激動。采用Real-time PCR法檢測大鼠H9C2心肌細(xì)胞中miR-148b表達(dá)水平；利用生物信息學(xué)方法分析miR-148b啟動子區(qū)域的PPARγ結(jié)合位點(diǎn)；應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀法(ChIP)驗(yàn)證PPARγ是否與miR-148b啟動子結(jié)合。結(jié)果：吡格列酮劑量依賴性上調(diào)miR-148b表達(dá)(P<0.01)；吡格列酮上調(diào)miRs-148b表達(dá)后，給予PPARγ特異性拮抗劑GW9662，上調(diào)的miR-148b表達(dá)降至對照水平(P<0.01)；生物信息學(xué)預(yù)測miR-148b啟動子區(qū)域存在PPARγ的兩個結(jié)合位點(diǎn)；應(yīng)用ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子PPARγ不能與miR-148b啟動子區(qū)域的兩個預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。結(jié)論：PPARγ上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞中miR-148b表達(dá)，但調(diào)控不依賴于轉(zhuǎn)錄水平。

主題詞細(xì)胞/病理生理學(xué)心肌轉(zhuǎn)錄因子/代謝核糖核苷酸類/代謝動物，實(shí)驗(yàn)大鼠

MicroRNAs(miRNAs)在生物體內(nèi)廣泛存在，通過調(diào)控不同的RNA發(fā)揮生物學(xué)功能。miRNAs在生理發(fā)育及疾病進(jìn)展中表達(dá)發(fā)生改變[1]，從miRNAs的生成生物學(xué)行為過程分析導(dǎo)致miRNAs表達(dá)改變的機(jī)制，有助于深入理解miRNAs所參與的病理變化過程。研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中內(nèi)源性前列環(huán)素信號通路能上調(diào)miR-148b表達(dá)水平[2]。參與內(nèi)源性前列環(huán)素信號通路的分子多種多樣，其中PPARγ是其中的關(guān)鍵蛋白分子之一。本研究旨在探索:①PPARγ是否上調(diào)miR-148b表達(dá)水平；②如果PPARγ上調(diào)miR-148b表達(dá)水平，是否依賴于轉(zhuǎn)錄水平。

材料與方法

1大鼠心肌細(xì)胞H9C2培養(yǎng)大鼠H9C2細(xì)胞購自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，參考文獻(xiàn)方法培養(yǎng)[3]，待細(xì)胞融合至90%，更換含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基，應(yīng)用PPARγ激動劑吡格列酮(Pioglitazone)或PPARγ拮抗劑GW9662處理(Sigma-Aldrich, pioglitazone/1～10μmol)。

2實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time- QPCR)應(yīng)用miRcute miRNA分離提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取分離小分子RNA(小于200個堿基)。MiRcute microRNA cDNA合成試劑盒及實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司)用于microRNA表達(dá)分析。實(shí)時熒光定量PCR采用ABI PRISM 7700檢測系統(tǒng)完成。MiR-148b引物序列為: TCAGTGCATCACAGAACTTTGT；內(nèi)參5S引物序列為: GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC。

3染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)參考Porro 等方法[4]，于大鼠H9C2細(xì)胞行ChIP實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用調(diào)整后的RIPA[1%十二烷基硫酸鈉，5mmol乙二胺四乙酸，50mmolTris-鹽酸(pH 8.1)，5%蛋白酶抑制劑cocktail]溶液裂解H9C2細(xì)胞，超聲使裂解產(chǎn)物降解成為約200～1000bp大小的DNA碎片。然后用ChIP緩沖液[1% Triton X-100，2mmol 乙二胺四乙酸，150mmol 氯化鈉，20mmolTris-鹽酸(pH 8.1)，5%蛋白酶抑制劑Cocktail]稀釋10倍，然后分別與PPARγ抗體，IgG抗體共孵育，于4℃過夜，加入蛋白A/G瓊脂糖結(jié)合抗體-DNA復(fù)合物。隨后交聯(lián)物質(zhì)進(jìn)一步于65℃孵育6h解交聯(lián)。免疫共沉淀得到的產(chǎn)物應(yīng)用PCR分析。在miR-148b編碼基因啟動子上的用于擴(kuò)增包含結(jié)合PPARr位點(diǎn)片段的兩對引物分別為：5’-GCTCTAGAGTTACAATCATGTGCCAC-3’(上游引物)，5’-GCAAGCTTTCGAGACAAAGTTCTG-3’(下游引物)以及5’-GCAAGCTTTCTAGCAGCTGCCCAT-3’ (上游引物), 5’- GC CTCGAG TGGCTGTCTAGAAGACAGGATC -3’(下游引物)。用含有溴乙烷的2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

4生物信息學(xué)分析應(yīng)用miRBase查詢pre-miR-148b序列及編碼基因，利用TRANSFAC和Promotor 2.0 Prediction Serve 軟件預(yù)測分析Pre-miR-148b的轉(zhuǎn)錄因子。

結(jié)　果

1吡格列酮劑量依賴性上調(diào)大鼠H9C2細(xì)胞中miR-148b表達(dá)水平見圖1。為明確PPARγ對miR-148b的調(diào)控作用,采用不同劑量的PPARγ激動劑吡格列酮(1～10μmol/L)刺激大鼠心肌H9C2細(xì)胞24 h后, 應(yīng)用Real-time PCR方法檢測H9C2細(xì)胞中miR-148b表達(dá)水平。結(jié)果顯示與對照組相比，1 μmol/L吡格列酮對miR-148b表達(dá)無影響，5μmol/L吡格列酮顯著上調(diào)miR-148b表達(dá)約4倍(P<0.01)，10μmol/L吡格列酮顯著上調(diào)miR-148b表達(dá)約7倍。

2PPARγ上調(diào)大鼠H9C2細(xì)胞中miR-148b表達(dá)見圖2。為進(jìn)一步證實(shí)吡格列酮是否特異性通過PPARγ上調(diào)H9C2中miR-148b表達(dá)，利用PPARγ特異性拮抗劑GW9662刺激大鼠心肌H9C2細(xì)胞后，與吡格列酮共孵育。采用吡格列酮刺激大鼠H9C2細(xì)胞，miR-148b表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，在此基礎(chǔ)上加用PPARγ拮抗劑GW9662后，上調(diào)的miR-148b表達(dá)下降至對照水平(P<0.01)，提示PPARγ上調(diào)大鼠H9C2細(xì)胞中miR-148b表達(dá)水平。

圖1　吡格列酮劑量依賴性

圖2　PPARγ上調(diào)大鼠H9C2細(xì)胞中miR-148b表達(dá)

3生物信息學(xué)預(yù)測miR-148b啟動子與PPARγ結(jié)合位點(diǎn)見圖3。采用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-148b編碼基因啟動子上是否存在PPARγ結(jié)合位點(diǎn)。對miR-148b所在基因啟動子上游2000bp及下游500bp堿基進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在兩個PPARγ結(jié)合位點(diǎn)。

4PPARγ與miR-148b啟動子預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)不發(fā)生結(jié)合見圖4。利用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)方法檢測PPARγ是否與miR-148b啟動子上的兩個預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。結(jié)果顯示：在大鼠心肌H9C2細(xì)胞中，PPARγ與miR-148b啟動子兩個預(yù)測位點(diǎn)結(jié)合均不能發(fā)生結(jié)合。

圖3　生物信息學(xué)預(yù)測miR-148b啟動子與PPARγ結(jié)合位點(diǎn)

圖4　PPARγ與miR-148b啟動子預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)不發(fā)生結(jié)合

經(jīng)典microRNA生成過程包括編碼microRNA的基因在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III作用下轉(zhuǎn)錄出pri-miRNA；Drosha/DGCR8復(fù)合體剪切pri-miRNA生成pre-miRNA；pre-miRNA在exportin 5作用下從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞漿中；Dicer酶剪切pre-miRNA生成成熟microRNA。除此途徑以外，研究顯示一些microRNA的生成不依賴于RNA聚合酶III(RNase III/Drosha或Dicer)的剪切過程[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用PPARγ激動劑能上調(diào)miR-148b表達(dá)量，由于吡格列酮不僅能激動PPARγ，還能激動其他信號分子，因此，我們在給予吡格列酮后，應(yīng)用PPARγ特異性拮抗劑，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR-148b水平下降至對照水平。證實(shí)PPARγ的確能上調(diào)miR-148b表達(dá)。

PPARγ是一種核轉(zhuǎn)錄因子，能通過轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)節(jié)體內(nèi)多種多樣代謝途徑[6]。為進(jìn)一步研究PPARγ是否通過轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)miR-148b表達(dá)。我們進(jìn)一步預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-148b的編碼基因啟動子存在PPARγ結(jié)合位點(diǎn)。但通過進(jìn)一步的染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果否定了PPARγ與miR-148b編碼基因啟動子的結(jié)合，這些結(jié)果提示：PPARγ并非從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)miR-148b表達(dá)水平。PPARγ上調(diào)miR-148b表達(dá)是通過何種方式實(shí)現(xiàn)，根據(jù)上述的miRNAs生成的調(diào)控機(jī)制研究推測：①PPARγ通過其他激活其他轉(zhuǎn)錄因子，其他轉(zhuǎn)錄因子于轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)miR-148b表達(dá)；②PPARγ可能通過影響Drosha,Dicer或exportin5的表達(dá)及活化于轉(zhuǎn)錄后水平影響miR-148b表達(dá)；③近期，一種新的RNA結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)能參與轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后耦聯(lián)過程[7]，關(guān)于PPARγ是否影響RNA結(jié)合蛋白進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)錄后耦聯(lián)過程影響miR-148b表達(dá)尚未明確，提示亦是一種可能的機(jī)制。對于PPARγ調(diào)控miR-148b表達(dá)從轉(zhuǎn)錄以外的何種方式實(shí)現(xiàn)仍有待于未來研究進(jìn)一步深入探討。

[1]Zhao N, Yu H, Yu H,etal. MiRNA-711-SP1-collagen-I pathway is involved in the anti-fibrotic effect of pioglitazone in myocardial infarction[J]. Sci China Life Sci ，2013，56:431-439.

[2]Mohite AJ, Chillar AJ, Wijaya C,etal. Endogenous prostacyclin signaling regulating microRNA expression in mammalian cells[J]. FASEB J, 2009, 23: LB373.

[3]Yan W, Xuan C, Xuan L,etal. BN52021 protects rat cardiomyocyte from doxorubicin induced cardiotoxicity[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2015，8:1719-1724.

[4]Porro A, Haber M, Diolaiti D,etal. Direct and coordinate regulation of ATP-binding cassette transporter genes by Myc factors generates specific transcription signatures that significantly affect the chemoresistance phenotype of cancer cells[J]. J Biol Chem ，2010，285：19532-19543.

[5]Havens MA, Reich AA, Duelli DM,etal. Biogenesis of mammalian microRNAs by a non-canonical processing pathway[J]. Nucleic Acids Res ,2012,40:4626-4640.

[6]Ahmadian M, Suh JM, Hah N,etal. PPARgamma signaling and metabolism: the good, the bad and the future[J]. Nat Med， 2013，19：557-566.

[7]Han N, Li W, Zhang M. The function of the RNA-binding protein hnRNP in cancer metastasis[J]. J Cancer Res Ther， 2013，9 (Suppl): 129-134.

(收稿：2016-03-20)

PPARγ up-regulated miR-148b expression in H9C2cells of rats is not dependent on the transcriptional level

First Department of Cardiovascular Medicine, The People，s Hospital of Shaanxi Province

(Xi’an 710068) Zhao NaZhang YongLiu Xiaojun et al

Objective: To explore wheather PPARγ up-regulates the miR-148b expression in cardiomyocytesof rats, and whether this process is dependent on the transcriptional level. Methods: Piogliatazone and GW9662 were used by PPARγ agonist and antagonist to stimulate H9C2cells in rats. Using Real-time PCR evaluate the expression level of miR-148b in H9C2cells of rats. Applying bioinformatics analysis predicte the binding sites between PPARγ and promoter region of miR-148b. Using chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay verify wheather PPARγ binds to the predicted binding sites in the promoter of miR-148b. Results: Pioglitazone up-regulated miR-148b expression in a dose-dependent manner (P<0.01).In addition, the up-regulated miR-148b expression by pioglitazone was inhibited totally by GW9662 (P<0.01). Bioinformatic analysis found two binding sites between PPARγ and promoter region of miR-148b. ChIP assay verify that PPARγ did not bind to the two predicted binding sites in the promoter region of miR-148b. Conclusion: PPARγ up-regulates miR-148b expression in cardiomyocytes of rats, but does no dependent on the transcriptional level.

Cell/physiopathologyMyocardiumTranscription factor/metabolismRibonucleotide/metabolismAnimails, laboratotyRats

R337.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.001

*國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81400181)

△北京大學(xué)第三醫(yī)院