蔣玉亮，蘭　萍，李　艷，余　赟，毛明星，楊亞瓊，楊　平△

1.成都醫(yī)學院 生物醫(yī)學系(成都　610500); 2.成都醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院(成都　610500)

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一種基于OmpA的分泌型原核表達載體的構(gòu)建及應用*

蔣玉亮1，蘭萍1，李艷1，余赟2，毛明星1，楊亞瓊2，楊平2△

1.成都醫(yī)學院 生物醫(yī)學系(成都610500); 2.成都醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院(成都610500)

目的構(gòu)建大腸桿菌周質(zhì)分泌型表達載體并驗證其表達效果。方法以pUC18-lpp為基礎載體，構(gòu)建含有核糖體結(jié)合元件(RBS)、信號肽(OmpA)、多克隆位點(MCS)的分泌型表達載體pUC-OmpA；通過分子克隆獲得含有密碼子優(yōu)化的人生長激素(hGH)編碼序列的pUC-OmpA-hGH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株并驗證周質(zhì)分泌性質(zhì)。結(jié)果經(jīng)IPTG誘導后，SDS-PAGE、Western印跡分析結(jié)果顯示周質(zhì)空間有hGH重組表達產(chǎn)物，分子量約為22 kD，大小與預期一致，周質(zhì)hGH約占菌體總hGH的43%。結(jié)論成功構(gòu)建了基于OmpA信號肽的周質(zhì)分泌型表達系統(tǒng)，為實現(xiàn)生物活性蛋白的原核表達奠定了基礎。

原核表達；周質(zhì)分泌；信號肽

大腸桿菌具有遺傳背景清晰、成本低廉、周期短等優(yōu)點，是目前生產(chǎn)多肽類藥物的重要基因工程菌之一。但由于其缺乏完善的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，致使胞內(nèi)表達外源多肽時易形成包涵體沉淀，需經(jīng)過繁瑣過程才能獲得生物活性多肽，增加了工藝難度和生產(chǎn)成本[1]。分泌性表達是簡化工藝流程、降低成本和提高大腸桿菌多肽類基因工程產(chǎn)品活性的重要途徑之一，目前已經(jīng)開發(fā)了基于OmpT、CBD、DsbA等基因引導序列的分泌型原核表達系統(tǒng)，但因穩(wěn)定性、通用性、低拷貝數(shù)等因素制約，目前在基因工程中實際應用的分泌型原核表達系統(tǒng)并不多見[2]。本研究在課題組前期構(gòu)建的含有大腸桿菌強啟動子lpp的表達載體pUC18-lpp基礎上，在lpp后引入RBS核糖體結(jié)合元件、OmpA信號肽編碼序列，嘗試構(gòu)建新的分泌型原核表達載體pUC-OmpA，并將密碼子優(yōu)化的人生長激素(hGH)編碼序列克隆至新載體中，對pUC-OmpA的周質(zhì)分泌性和分泌效果進行研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒載體及菌株大腸桿菌JM109株為成都醫(yī)學院科研實驗中心保存，質(zhì)粒pUC18-lpp由上述實驗室構(gòu)建保存。

1.1.2酶及主要試劑限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和PrimeSTAR HS DNA polymerase購自日本TaKaRa公司；核酸、蛋白分子量標準、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購于上海Sangon公司；兔抗人hGH多克隆抗體、山羊抗兔IgG-HRP購自Elabscience公司。

1.1.3核酸片段的合成和測序均委托上海Sangon公司完成，序列見表1。

1.2方法

1.2.1分泌型表達載體pUC-OmpA的構(gòu)建設計并合成含有核糖體結(jié)合元件(RBS)、信號肽(OmpA)、多克隆位點(MCS)、His標簽和終止序列的核酸片段Fragment(RBS-Terminator)。利用引物RBS-Terminator-F/RBS-Terminator-R，經(jīng)PCR法擴增RBS-Terminator基因片段(熱循環(huán)30次，擴增條件98 ℃變性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s)。按常規(guī)的分子生物學方法[3]，經(jīng)Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，定向克隆至pUC18-lpp，構(gòu)建分泌型原核表達載體pUC-OmpA。

1.2.2分泌型重組表達載體pUC-OmpA-hGH的構(gòu)建根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中人生長激素序列(AAA72260.1、AAK69708.1和ADE06645.1)完成密碼子優(yōu)化(http://www.jcat.de/)，并委托上海Sangon公司完成Fragment(hGH)的合成。利用引物hGH-F/ hGH-R，經(jīng)PCR法擴增hGH基因片段(熱循環(huán)30次，擴增條件98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s)。按常規(guī)的分子生物學方法[3]，經(jīng)BamHI和NheI雙酶切，定向克隆至pUC-OmpA，構(gòu)建重組分泌型原核表達載體pUC-OmpA-hGH。

1.2.3SDS-PAGE電泳檢測重組分泌型原核表達質(zhì)粒pUC-OmpA-hGH轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑單菌落于LB(Amp+)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜；按1∶100擴種培養(yǎng)于LB(Amp++20%葡萄糖)培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜；再按1∶25擴種培養(yǎng)，菌液OD600值達0.6左右時加入IPTG誘導，30 ℃表達3 h后收獲菌體。按滲透壓休克法制備周質(zhì)蛋白：加入20 mL Tris-HCl(pH 8.0)、1 mmol EDTA、20%蔗糖(pH 8.0)重懸菌體，冰水浴10 min，12 000 g離心收集沉淀；進一步加入5 mmol MgSO48 mL，冰水浴10 min，12 000 g離心10 min，分別收集沉淀(對照)和上清(周質(zhì)蛋白)，加入等量2×上樣緩沖液混合后沸水煮5 min，進行12%的SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4Western印跡分析誘導表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，封閉后按常規(guī)方法進行檢測[3]。

2　結(jié)果

2.1分泌型表達載體pUC-OmpA的構(gòu)建

以pUC18-lpp為基礎載體，構(gòu)建了含有核糖體結(jié)合元件(RBS)、信號肽(OmpA)、多克隆位點(MCS)的分泌型表達載體pUC-OmpA(圖1)，測序結(jié)果與預期一致。

圖1pUC-OmpA表達載體的克隆表達區(qū)

2.2SDS-PAGE分析

1pUC-OmpA-hGH/JM109經(jīng)IPTG誘導后，大腸桿菌胞內(nèi)和周質(zhì)空間均檢測到hGH(22 kD)表達產(chǎn)物，大小與預期一致；電泳結(jié)果用BandScan軟件進行掃描分析，周質(zhì)空間分泌性表達的hGH約占菌體hGH總蛋白的43%(圖2)。

圖2SDS-PAGE分析

注：M：蛋白質(zhì)標準；1：pUC-OmpA-hGH/JM109誘導后總蛋白；2：pUC-OmpA-hGH/JM109誘導后周質(zhì)分泌蛋白；3：pUC-OmpA-hGH/JM109誘導后胞內(nèi)表達蛋白

2.3Western印跡分析

在PVDF膜上呈現(xiàn)出特異性的反應條帶，分子量大小為22 kD，與預期結(jié)果一致(圖3)。

圖3Western印跡分析

注：1：pUC-OmpA-hGH/JM109誘導后周質(zhì)分泌蛋白；2：pUC-OmpA-hGH/JM109誘導后胞內(nèi)表達蛋白

3　討論

大腸桿菌是常用的基因工程菌之一，但其胞內(nèi)表達易形成包涵體沉淀，導致胞內(nèi)表達型大腸桿菌工程菌多肽產(chǎn)物活性不高、工藝流程復雜且不穩(wěn)定。與胞內(nèi)表達相比，在大腸桿菌周質(zhì)空間中表達多肽類藥物具有多方面的優(yōu)點，如周質(zhì)空間內(nèi)含有一系列的酶，有利于多肽的正確折疊，可提高活性多肽的產(chǎn)量；周質(zhì)空間的蛋白酶活性比胞內(nèi)低，有利于多肽穩(wěn)定地存在于周質(zhì)空間；此外，周質(zhì)空間蛋白質(zhì)種類少，有利于多肽的濃縮和純化[4-5]。但是，大腸桿菌自身的周質(zhì)分泌系統(tǒng)不夠完善，分泌能力比真核生物低，因此獲得重組蛋白的周質(zhì)高效分泌性表達面臨諸多困難，主要表現(xiàn)為多肽跨膜輸出能力不強，周質(zhì)分泌量很難達到實驗或工業(yè)生產(chǎn)的需求。為解決上述問題，以往人們將研究的重點放在宿主菌的改造、共表達和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，近年，研究工作主要側(cè)重在應用信號肽和表達系統(tǒng)本身的調(diào)控元件來構(gòu)建高效通用的周質(zhì)分泌表達載體[6-8]。

本研究在課題組前期構(gòu)建的具有大腸桿菌強啟動子lpp的表達載體pUC18-lpp基礎上，利用大腸桿菌細胞內(nèi)固有的天然信號肽OmpA，構(gòu)建了具有l(wèi)pp強啟動子、RBS核糖體結(jié)合元件、OmpA信號肽編碼序列的新型分泌型原核表達載體pUC-OmpA，并通過分子克隆獲得含有密碼子優(yōu)化的生長激素編碼序列的pUC-OmpA-hGH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株并驗證了hGH的周質(zhì)分泌性表達特質(zhì)。SDS-PAGE、Western印跡分析結(jié)果顯示，pUC-OmpA是1種較為高效的周質(zhì)分泌型原核表達載體，基于該表達系統(tǒng)，hGH可以實現(xiàn)43%的周質(zhì)分泌效率，為探索多肽類藥物的周質(zhì)分泌性表達創(chuàng)造了條件。

課題組下一步將基于pUC-OmpA周質(zhì)分泌型原核表達載體，開展其他多肽類藥物的原核表達研究，并優(yōu)化誘導表達和純化工藝條件，以求取得更高、更穩(wěn)定的外源基因周質(zhì)分泌性表達效率。

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Construction and Application of A Secretory Prokaryotic Expression Vector Based on OmpA Signal Peptide

JiangYuliang1,LanPing1,LiYan1,YuYun2,MaoMingxing1,YangYaqiong2,YangPing2△.

1.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo construct a secretory prokaryotic expression vector of the periplasmic space of Escherichia coli and to verify its expression effect. MethodsThe secretory expression vector pUC-OmpA was constructed by inserting the synthetic nucleic acid fragments which contain the ribosomal binding element (RBS), signal peptide (OmpA) and multiple clone sites (MCS) on the basis of the expression vector pUC18-lpp. The gene encoding hGH was synthesized according to the preferential codons of Escherichia coli and was cloned into pUC-OmpA to construct pUC-OmpA-hGH. Subsequently, the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli JM109 and the expression effect in the periplasmic space was analyzed. ResultsThe results of SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the molecular weight of the recombinant hGH was about 22 kD, which was consistent with the expected result. The results of BandScan software analysis showed that the secretory expression of hGH in the peripheral space was about 43% of total hGH protein. ConclusionThe secretory expression vector pUC-OmpA can be constructed on the basis of OmpA signal peptide, which can facilitate the prokaryotic expression of bioactive proteins.

Prokaryotic expression; Periplasmic space secretion; Signal peptide

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.004

四川省科技廳應用基礎研究項目(No：2015JY0205)；國家級大學生創(chuàng)新實驗計劃項目(No：201313705003)；成都醫(yī)學院大學生創(chuàng)新實驗計劃項目(No：CXJS201309)

楊平，E-mail：920192655@qq.com

R34

A

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.1836.026.html