王建豐，徐云澤，黃翼然，張　進(jìn)

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，上?！?00127)

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·基礎(chǔ)研究·

大麻素受體1對腎癌細(xì)胞786-O增殖及遷移能力的影響

王建豐，徐云澤，黃翼然，張進(jìn)

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，上海200127)

目的探索大麻素受體1(CB1)在腎癌組織中表達(dá)及對腎癌細(xì)胞系786-O相關(guān)生物學(xué)功能的影響。方法采用免疫組化實(shí)驗方法檢測腎癌組織標(biāo)本中CB1表達(dá)情況；應(yīng)用CB1拮抗劑AM251處理786-O腎癌細(xì)胞株，觀察細(xì)胞的增殖及遷移能力的改變。 結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示相對于癌旁組織，腎癌組織中CB1表達(dá)量較高；通過CB1拮抗劑AM251處理后，786-O腎癌細(xì)胞增值能力明顯下降：25μmol/L組48h和72h抑制率分別為 28.09±2.99和32.83±1.53；50μmol/L組48h和72h抑制率分別為78.59±5.69和88.02±5.34，其IC50在48h和72h分別為(38.20±4.75)μmol/L和(35.30±4.80)μmol/L；經(jīng)過CB1拮抗劑AM251處理后遷移能力發(fā)生顯著下降：與對照組細(xì)胞遷移數(shù)目(184.33±11.06)相比，20μmol/LAM251處理組(114±9.64，P=0.001 7)、30μmol/LAM251處理組(41.67±3.51，P=0.001 5)隨著藥物濃度的升高遷移細(xì)胞呈明顯減少趨勢。結(jié)論CB1可能參與腎癌發(fā)生發(fā)展，為尋找潛在的新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

癌；腎癌；786-O；大麻素受體1；AM251

大麻素受體(cannabinoidreceptor)早在二十世紀(jì)九十年代初就已被人們發(fā)現(xiàn)[1]，早期對大麻素的研究主要集中于精神和神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域。近年來，不斷有研究報道大麻素在抗腫瘤方面也具有顯著功效。在胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等相關(guān)研究中，大麻素具有不同程度的抗腫瘤作用[2-3]，但是在腎癌方面罕有研究報道。本研究旨在探討大麻素受體1(CB1)在腎癌中表達(dá)及對腎癌細(xì)胞細(xì)胞系786-O的相關(guān)腫瘤學(xué)生物功能的影響，初步研究其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　實(shí)驗方法

1.1腎癌組織免疫組化

1.1.1標(biāo)本的收集75例標(biāo)本選自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科2014年7月至2015年3月間進(jìn)行腎癌根治患者的手術(shù)標(biāo)本，男50例，女25例，年齡29～82歲，平均年齡為58歲；腎癌的臨床分期采用AJCC第七版腎癌分期，其中T1期33例、T2期24例、T3期17例、T4期1例；術(shù)后病理均為透明細(xì)胞癌，分級采用Fuhrman分級方法，并在此基礎(chǔ)上分成高分化、低分化兩類，高分化(Ⅰ、Ⅱ、Ⅰ～Ⅱ)39例, 低分化(Ⅱ～Ⅲ,Ⅲ)36例。所有患者術(shù)前均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且無其他腫瘤史，術(shù)前均未進(jìn)行化療及靶向治療。

1.1.2免疫組化及結(jié)果鑒定首先將收集的患者組織制作成組織芯片，免疫組化染色采用CP法，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行染色。通過脫蠟、敷一抗(采用兔抗人CB1多克隆抗體(英國Abcam公司)1∶300稀釋)、敷生物素二抗及DAB顯色(武漢博士德生物公司)，最后用NikonEclipseE1000采圖攝像系統(tǒng)進(jìn)行照相。陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有比較鮮明的棕黃色染色，以PBS代替一抗進(jìn)行染色作為陰性對照。本研究中采用兩個指標(biāo)來共同判斷該指標(biāo)的表達(dá)情況，即表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)陽性率，同時也采用第三個結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性率的指標(biāo)，即染色綜合指數(shù)來判斷該指標(biāo)的總體表達(dá)情況；染色強(qiáng)度：1、1.5、2、2.5、3代表染色由淺到深的5個等級。陽性率：癌或上皮細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)所占同類細(xì)胞數(shù)的百分比。染色綜合指數(shù)：染色強(qiáng)度×陽性率。

1.2腎癌細(xì)胞株功能實(shí)驗

1.2.1AM251對腎癌細(xì)胞株增值活性的影響首先將腎癌細(xì)胞786-O培養(yǎng)處于對數(shù)生長期，然后加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2×104/mL，以每孔90μL體積種于96孔板中，待12h后細(xì)胞完全貼壁后加CB1拮抗劑AM251。藥物母液濃度為10mmol/L，以首濃度50μmol/L，2倍梯度稀釋藥物8個梯度配置藥物，用排槍每孔加入10μL的不同濃度的藥物，每個濃度設(shè)置6個副孔，對照孔加入等量的生理鹽水，混勻后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。24、48、72h后用磺酰羅丹明B(SulforhodamineB，SRB)比色法染色：首先每孔加100μL4 ℃預(yù)冷10%TCA于4 ℃冰箱固定1h，然后用去離子水洗板5遍，室溫晾干后加SRB染液染色30min，然后用1%冰醋酸沖洗96孔板并室溫晾干，最后每孔加100μL非緩沖Tris-base堿液用酶標(biāo)儀以560nm波長，用空白孔調(diào)零，檢測96孔板吸光度(A)值，同樣實(shí)驗步驟重復(fù)3次。最后計算細(xì)胞抑制率并繪制抑制率曲線。

1.2.2AM251對腎癌細(xì)胞株786-O遷移能的影響取處于對數(shù)生長期的腎癌細(xì)胞用無血清的1640混成5×105/mL的細(xì)胞懸液，分別取適量的細(xì)胞懸液加入AM251藥物，配成不同濃度藥物下的細(xì)胞懸液，并等量接種于transwell小室(直徑6.5mm，孔徑8.0μm)，每孔100μL細(xì)胞懸液，下室加600μL含血清的1640培養(yǎng)基，分別配成與上室同樣的藥物濃度，最后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后經(jīng)90%乙醇固定、0.1%結(jié)晶紫染色、擦拭風(fēng)干后于倒置顯微鏡下觀察拍照，每次取400倍3個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并拍照，分別統(tǒng)計實(shí)驗組和對照組的遷移細(xì)胞數(shù)目。同樣的實(shí)驗步驟進(jìn)行3次。

2　結(jié)　果

2.1腎癌組織免疫組化免疫組化結(jié)果顯示，CB1受體在腎癌組織及癌旁組織均有表達(dá)(圖1)，并且腫瘤組織表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05,表1)。經(jīng)過統(tǒng)計分析，腫瘤組織中CB1的表達(dá)與性別、腫瘤分期等無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

圖1　CB1在癌和癌旁中的免疫組化染色

P<0.05。

2.2AM251對腎癌細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞增殖實(shí)驗結(jié)果顯示CB1受體抑制劑AM251可以顯著抑制腎癌細(xì)胞株786-O的增殖活力(圖2)。重復(fù)實(shí)驗3次。結(jié)果顯示12.5μmol/L組、25μmol/L組、50μmol/L組在不同時間其抑制率有明顯差異(P<0.05),藥物作用72h后抑制率趨于穩(wěn)定(表2)，48h、72h時間段的IC50分別為(38.20±4.75)μmol/L和(35.30±4.80)μmol/L。

表2不同濃度AM251在不同時間段對786-O的抑制率

時間分組6.25(μmol/L)12.5(μmol/L)25(μmol/L)50(μmol/L)24h7.11±6.248.17±4.9215.16±3.1040.92±1.5948h5.11±2.908.83±3.0028.09±2.9978.59±5.6972h3.21±1.717.08±1.3432.83±1.5388.02±5.34

圖2AM251作用于786-O48、72h的濃度梯度抑制曲線

2.3AM251對腎癌細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞遷移實(shí)驗結(jié)果顯示，CB1拮抗劑AM251能夠明顯抑制腎癌細(xì)胞786-O的遷移能力(圖3A)。實(shí)驗組中，20μmol/L組(114±9.64，P=0.001 7)及30μmol/L組(41.67±3.51，P=0.0015)與對照組(184.33±11.06)相比，遷移細(xì)胞數(shù)目明顯減少，相對遷移率明顯隨著濃度升高而降低(圖3B)。

圖3　AM251對腎癌細(xì)胞株786-O遷移能力的改變

A：不同藥物濃度作用后顯微鏡所見(×400)；B：遷移能力(以加藥組遷移細(xì)胞數(shù)目/未加藥組遷移細(xì)胞數(shù)目來表示，Ctrl組為未加藥組，其余為不同濃度加藥組)。

3　討　論

腎癌，全稱腎細(xì)胞癌(renalcellcarcinoma)，是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，為常見的泌尿系腫瘤。據(jù)最新的國外統(tǒng)計資料顯示，腎及腎盂腫瘤發(fā)生率占所有新發(fā)腫瘤的3%～5%，每年的死亡人數(shù)高達(dá)14 080人[4]。對于早期的腎臟腫瘤，絕大多數(shù)可通過手術(shù)等方式治愈，但是一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。事實(shí)上，約有30%的RCC患者初次就診就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而且轉(zhuǎn)移性RCC放化療效果不佳，治療有效率低于20%[5]。目前，晚期腎癌的治療主要以靶向治療為主，美國及歐洲共同批準(zhǔn)的有sorafenib、sunitinib、bevacizumad、pazopanib等7種靶向藥物，能顯著提高晚期腎癌患者的預(yù)后[6]。但是，在臨床的應(yīng)用中，靶向藥物在使用一段時間后基本上都會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，因此，尋找和研究新的分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)仍然是該領(lǐng)域的重要課題。

大麻素受體(CB)是一種G蛋白耦聯(lián)受體，主要介導(dǎo)Δ-9四氫大麻素(Δ-9-tetrahydrocannabinol，THC)對精神系統(tǒng)的作用[7]。1990年人們首次發(fā)現(xiàn)大麻素受體，包括大麻素受體1(CB1)和大麻素受體2(CB2)[8]，研究發(fā)現(xiàn)，CB1受體主要分布在中樞和外周，可能參與食欲及脂肪代謝的調(diào)節(jié)；CB2受體主要分布于外周，與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等有關(guān)。CB1受體及內(nèi)源性四氫大麻素分子(endocannabinoids)例如N-arachidonoylethanolamide(AEA)及2-arachidonoylglycerol(2-AG)在人類的精神神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域已被廣泛研究[9]，近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性和合成大麻素具有明顯的抗腫瘤作用，已有報道在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、肺癌等大麻素受體明顯表達(dá)，且具有不同程度的抗腫瘤作用[10-13]。但是，不同腫瘤組織中大麻素受體的表達(dá)量與腫瘤的惡性程度及預(yù)后之間的關(guān)系不一致，有的甚至出現(xiàn)相反的結(jié)論[14-15]。2009年CHUNG等[14]對399例前列腺癌腫瘤組織標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)：大麻素CB1受體表達(dá)水平Gleason評分可作為評估前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素；高表達(dá)CB1受體與腫瘤惡性程度高及預(yù)后差密切相關(guān)。但在肝癌中，CB1受體高表達(dá)預(yù)后好[15]。所以，大麻素對不同腫瘤作用仍然需要各個領(lǐng)域的進(jìn)一步探索。大麻素在腎癌方面的研究罕有報道，僅有的研究也只是闡述CB1受體在腎癌的不同病理類型組織中表達(dá)量的差異，沒有進(jìn)一步的實(shí)驗證明大麻素對腎癌具體是否有抗腫瘤作用。 據(jù)此，我們將繼續(xù)研究大麻素受體的表達(dá)與腎癌之間的關(guān)系，探索大麻素受體1在腎癌的發(fā)生發(fā)展中作用。

本研究關(guān)注的重點(diǎn)是大麻素受體1在腎癌中表達(dá)情況及其對腎癌細(xì)胞株786-O增殖及遷移能力的影響。2010年西班牙學(xué)者LARRINAGA等[16]研究大麻素受體(CB1及CB2受體)在腎癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示：20例透明細(xì)胞癌中，CB1受體蛋白表達(dá)下調(diào)；CB2受體蛋白無表達(dá)。我們采用免疫組化的方法檢測75例腎癌組織標(biāo)本中CB1表達(dá)情況，結(jié)果顯示CB1受體在腎癌組織標(biāo)本中有較高的表達(dá)量，顯然我們的研究結(jié)果與前期西班牙學(xué)者報道是具有差異的。我們猜測可能與以下因素有關(guān)。首先，是否與腫瘤樣本的選擇有關(guān)：我們選取的腎癌腫瘤組織包括了透明細(xì)胞癌的低、中、高病理分級標(biāo)本，而西班牙學(xué)者文章中無腫瘤的分期分級相關(guān)數(shù)據(jù)；其次，CB1受體表達(dá)是否存在人種的差異，類似的情況在乳腺癌中也有報道。由于乳腺癌，尤其是三陰性乳腺癌(雌激素受體、孕激素受體、HER均不表達(dá))的病理亞型及預(yù)后在不同種族之間存在明顯差異。WILLIAMS等[17]研究表明：與美國人乳腺癌(三陰性乳腺癌)患者相比，越南人乳腺癌(三陰性)組織中EGFR和P-cadherin表達(dá)明顯下降，其表達(dá)存在明顯的差異。同樣，我們所收集的組織標(biāo)本均來自中國人的腎癌組織，而西班牙學(xué)者的文章中未注明標(biāo)本的來源。這些問題需要進(jìn)一步研究。此外，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步利用CB1受體拮抗劑AM251作用于腎癌細(xì)胞株786-O，發(fā)現(xiàn)AM251能不同程度的抑制腎癌細(xì)胞的增值活力和遷移能力，這進(jìn)一步說明了CB1受體可能參與腎癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。MCKALLIP等[18]研究用大麻素(Δ-9-tetrahydrocannabinol，THC)作用于乳腺癌小鼠模型，結(jié)果顯示大麻素能夠顯著增加小鼠肺中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，從而說明大麻素具有促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。CARPI等[19]研究者報道了AM251對皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375的抗腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AM251能顯著的抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生，進(jìn)一步的Westernblot說明AM251能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin，上調(diào)促凋亡蛋白BAX；而且發(fā)現(xiàn)其也可以造成A375的G2/M期阻滯。同樣，我們的研究也證明了CB1受體拮抗劑AM251能夠抑制腎癌細(xì)胞786-O的增殖和遷移，而有關(guān)CB1在腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。

綜上所述，本研究通過大麻素受體拮抗劑AM251作用于腎癌細(xì)胞株786-O，揭示了大麻素受體1在腎癌增殖、遷移等發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找新的腎癌抗腫瘤靶點(diǎn)提供新的認(rèn)知。當(dāng)然，本研究只是淺顯的探討了大麻素受體1在腎癌細(xì)胞株786-O中的作用，其具體的作用機(jī)制及體內(nèi)的作用效果仍需要進(jìn)一步研究和探索。

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(編輯王瑋)

Effects of cannabinoid receptor 1 on the proliferation and migration of 786-O cell of renal carcinoma

WANG Jian-feng, XU Yun-ze, HUANG Yi-ran, ZHANG Jin

(DepartmentofUrology,RenjiHospital,MedicalSchoolofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China)

ObjectiveToexplorertheexpressionofcannabinoidreceptor1 (CB1)onrenalcarcinomaanditseffectsonrenalcarcinomacellline786-O.MethodsTheCB1expressioninrenalcarcinomawasdetectedwithimmunohistochemicalmethod.The786-OcelllinewastreatedwithCB1antagonistAM251.Thechangesofcellproliferationandmigrationwereobserved.ResultsImmunohistochemicalresultsshowedthatCB1washighlyexpressedinrenalcarcinoma.AftertreatmentofCB1antagonistsAM251,theproliferationof786-Ocelllinewasinhibited.Theinhibitionrateof25μmol/Lgroupat48hand72hwas28.09±2.99and32.83±1.53,thatofthe50μmol/Lgroupat48hand72hwas78.59±5.69and88.02±5.34,respectively.TheIC50at48hand72hwas(38.20±4.75)μmol/Land(35.30±4.80)μmol/L.AftertreatmentofCB1antagonistsAM251,thecellmigrationabilitysignificantlydeclined.Comparedwiththecontrolgroup(184.33±11.06),the20μmol/Lgroup(114±9.64, P=0.001 7)and30μmol/Lgroup(41.67±3.51, P=0.001 5)hadgreatlydecreasednumberofmigrationcells.Withtheincreaseofdrugconcentration，thenumberofmigrationcellswasfewer.ConclusionCB1mayparticipateinthedevelopmentofrenalcarcinoma.Thismayprovidesomeinformationforthedevelopmentofpotentialnewtherapeutictargets.

cancer；renalcellcarcinoma；786-O；cannabinoidreceptor1；AM251

2016-01-27

2016-03-28

上海市衛(wèi)生系統(tǒng)先進(jìn)適宜技術(shù)推廣項目(No.2013SY024);上海市自然科學(xué)基金(No.13ZR1425100)

張進(jìn)，副教授，碩士生導(dǎo)師.

E-mail：med-zhangjin@vip.sina.com

王建豐(1991-)，男(漢族)，碩士在讀.研究方向：腎癌的臨床與基礎(chǔ)研究.E-mail:wjf_0509@sina.com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.08.014