姜露，葉麟，楊雪，黎杉珊，申光輝，張志清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安， 625014)

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不同前處理對植物酯酶抑制法檢測蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的影響

姜露，葉麟，楊雪，黎杉珊，申光輝，張志清*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安， 625014)

利用酶抑制法可以快速檢測蔬菜中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，這兩類農(nóng)藥能抑制酯酶的活性，并影響酯酶對底物的催化能力。根據(jù)這一原理，采用麥麩酯酶作為酶源對酶抑制法快速檢測農(nóng)殘前處理方法中農(nóng)殘?zhí)崛∫?、提取方法、提取時間及樣品提取液的處理方式進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：用5%丙酮-磷酸鹽緩沖液作為提取液，然后超聲提取5min后，將樣品提取液再用0.45μm有機(jī)濾膜過濾后蔬菜中農(nóng)藥殘留提取量可達(dá)到最高；且樣品加標(biāo)回收率為83.61%～102.81%，變異系數(shù)為1.20% ～7.23%。因此，該前處理方法可滿足于麥麩酯酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留的需要。

麥麩酯酶；酶抑制法；有機(jī)磷農(nóng)藥；氨基甲酸酯類農(nóng)藥；蔬菜；前處理方法

農(nóng)藥是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，它的使用能有效保障或提高農(nóng)作物的收成。但是農(nóng)產(chǎn)品種植中，因缺乏科學(xué)使用農(nóng)藥的知識及片面追求高產(chǎn)量，隨意并超量使用違禁農(nóng)藥，進(jìn)而導(dǎo)致食品中的農(nóng)殘超標(biāo)問題比較突出[1]。攝取的殘留農(nóng)藥經(jīng)過長期累積會對人體造成嚴(yán)重?fù)p害，可能誘發(fā)基因突變，致使癌變、畸形的比例和可能性大大提高[2]。因此，加強(qiáng)農(nóng)藥殘留的檢測力度，杜絕農(nóng)殘嚴(yán)重超標(biāo)的食品流入市場變得尤為重要。

酶抑制法是快速檢測農(nóng)藥殘留研究較多且較為成熟的一種方法，該法與傳統(tǒng)的儀器檢測法相比具有檢測成本低、耗時短、設(shè)備和試劑簡單等優(yōu)點。我國已經(jīng)將其列入國標(biāo)，可對農(nóng)產(chǎn)品中的有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測[3]。檢測用酶主要有來自動物及昆蟲的膽堿酯酶和從植物中提取的植物酯酶[4-6]。其中，植物酯酶屬于羧酸酯水解酶類，廣泛存在于小麥、玉米、大豆等谷物中，與膽堿酯酶相比具有原料易得、成本很低、保存期長等優(yōu)點[7-8]。在農(nóng)藥殘留檢測過程中，無論是傳統(tǒng)儀器檢測法還是快速檢測都需要對樣品進(jìn)行前處理。農(nóng)藥殘留分析前處理是農(nóng)殘分析檢測的關(guān)鍵步驟，它直接關(guān)系著整個分析過程的準(zhǔn)確性與精密度[9]。有統(tǒng)計表明，大部分傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測過程中，需要通過有機(jī)溶劑提取、濃縮、凈化等前處理步驟，約占整個分析時間的70%左右[10]，在此操作過程中產(chǎn)生的誤差也占整個分析誤差的絕大多數(shù)且無法對廉價的蔬菜進(jìn)行隨時隨地的快速檢測。

目前，對酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留的研究主要是以酶源的篩選及分離純化為主[12-13]，很少有對其前處理方法進(jìn)行報道，且研究表明國標(biāo)中的直接浸提法對農(nóng)殘的提取率并不高[14]。因此，本研究根據(jù)酶抑制法快速檢測有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的原理，采用麥麩中提取的植物酯酶作為檢測酶源，對快速檢測方法中前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，并通過對幾種有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行樣品回收率實驗驗證麥麩酯酶快速檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

麥麩酯酶，實驗室自制；卷心菜(Brassica oleraceavar.capitata)、小白菜(Brassica rapaL.ChinensisGroup)，雅安市市售。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑

有機(jī)磷類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：敵敵畏(液體1.00mg/mL)、甲基對硫磷(液體1.00mg/mL)、樂果(液體1.00mg/mL)，成都杰銳科技有限公司；氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：丁硫克百威(液體1.00mg/mL)、西維因(固體純度≥99.8%)、葉蟬散(固體純度≥99.8%),成都杰銳科技有限公司；α-乙酸萘酯，上海源葉生物科技有限公司；固蘭B鹽，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；HCl，四川西隴化工有限公司；α-萘酚、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O、無水乙醇，成都市科龍化工試劑廠，所用試劑均為分析純。

1.2.2儀器

CP225D型電子天平，德國Sartorius股份公司；HS6150D型超聲波清洗儀，恒奧科技有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UV-3100型紫外分光光度儀計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；TS-I平衡脫色搖床，上海亞榮生化儀器廠；Milli-Q型超純水純化系統(tǒng)，美國密理博公司。

1.3研究方法

1.3.1麥麩酯酶的制備

從麥麩中提取麥麩酯酶參考楊雪等[15]的方法，并將其稀釋5倍待用。

1.3.2蔬菜的預(yù)處理

取卷心菜及小白菜的可食部分，用自來水、蒸餾水分別洗滌3次，放在干燥處并用濾紙片擦干備用。

1.3.3蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留的提取方法

用濃度為0.5mg/L的西維因農(nóng)藥噴灑于1g卷心菜上，4 ℃下放置12h。將菜葉剪成1cm2的碎片，放入提取液使其淹沒菜葉提取一定時間后，定容到10mL，然后取上清液作為樣品提取液待用。

1.3.4樣品提取液對酶活抑制率的測定方法

酶活抑制率的測定參考楊雪等[15]的方法，并稍作修改，于試管中加入4.25mL的樣品提取液，再加入0.25mL麥麩酯酶，混勻后在35℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min。取出試管加入0.25mL濃度為(8×10-4)mol/L的α-乙酸萘酯溶液，40 ℃恒溫水浴5min后加入0.25mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.2%SDS，再加入0.25mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%固蘭B鹽搖勻，最后加入0.25mL體積分?jǐn)?shù)20%HCl溶液搖勻后讀取吸光度值A(chǔ)1，作為實驗組。用提取液替代樣品提取液做為對照組A0，以未加α-乙酸萘酯溶液組做空白對照，其他操作與樣品提取液測定方法相同，通過測得的吸光度值計算酶活抑制率。

酶活抑制率公式：

式中：A0，對照組的吸光度值；A1，實驗組的吸光度值。

1.3.5農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線

6種農(nóng)藥先用丙酮分別配制成10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后用磷酸鹽緩沖液(pH7.2，0.2mol/L)將敵敵畏、葉蟬散稀釋成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00mg/L系列濃度；西維因稀釋成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00mg/L系列濃度；樂果、甲基對硫磷稀釋成1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00mg/L系列濃度；丁硫克百威稀釋成0.10、0.16、0.25、0.50、0.72、1.00mg/L系列濃度，然后按照1.3.4方法將樣品提取液替換成不同濃度的農(nóng)藥進(jìn)行測定。并計算不同濃度農(nóng)藥對麥麩酯酶酶活的抑制率，然后以農(nóng)藥濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6蔬菜中農(nóng)藥殘留提取液的選擇

分別配制不同體積分?jǐn)?shù)的丙酮磷酸鹽緩沖液(0%、5%、10%、20%)，按照1.3.3的實驗方法將不同濃度的丙酮磷酸鹽緩沖液替代樣品提取液測定麥麩酯酶酶活吸光度值，考察不同濃度的丙酮對酯酶酶活的影響，從而確定丙酮的最佳濃度。并將該濃度下的丙酮緩沖液、pH7.2的磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaCl作為蔬菜中農(nóng)殘的提取液，從中選擇最適宜的提取液。

1.3.7不同提取方法及提取時間的確定

實驗采用振蕩法和超聲波法對蔬菜中的農(nóng)藥殘留分別進(jìn)行提取，振蕩法提取時提取時間為5、10、15、20、25、30min，而超聲波法提取時間分別為1、3、5、7、9、12min,將上清液靜置5～10min后取上清液按照1.3.4的方法測定，考察不同提取方法及不同提取時間對農(nóng)藥回收率的影響。

1.3.8樣品提取液不同處理方法的比較

樣品提取液在測定前的不同處理方式也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，本實驗以卷心菜和小白菜為例，在最佳的提取方法基礎(chǔ)上分別對這2種蔬菜的樣品提取液進(jìn)行直接測定、活性炭吸附后過濾、0.45μm有機(jī)濾膜過濾3種不同的處理方法，取上清液按照1.3.4的方法測定，考察不同處理方法對農(nóng)藥回收率的影響。

1.3.9農(nóng)藥加標(biāo)回收率的測定

將各農(nóng)藥配制成濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后分別取0.25、0.5、1.0mL的敵敵畏、葉蟬散、西維因、丁硫克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液和1.0、1.5、2.0mL的樂果、甲基對硫磷的標(biāo)準(zhǔn)工作液噴灑于1g卷心菜葉上，放置過夜，按照上述確定的最佳提取方法提取并測定酶活抑制率作為實驗組。并將同一批次購買未噴灑農(nóng)藥的卷心菜同樣加入提取液進(jìn)行提取，測定酶活抑制率作為空白值，然后根據(jù)農(nóng)藥濃度與抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算加標(biāo)回收率。

2　結(jié)果與分析

2.1農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由表1可知，6種農(nóng)藥在系列濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)性均在0.98以上。

表1　農(nóng)藥濃度與麥麩酯酶抑制關(guān)系

注：y:抑制率，%；x: 農(nóng)藥濃度對數(shù)(lgc)(c為農(nóng)藥質(zhì)量濃度，mg/L)。

2.1應(yīng)用于酯酶抑制法檢測農(nóng)殘的蔬菜中農(nóng)殘?zhí)崛∫旱拇_定

2.1.1丙酮含量對麥麩酯酶酶活性的影響

用pH7.2的磷酸鹽緩沖液將丙酮稀釋成不同體積濃度，然后測定丙酮對麥麩酯酶酶活的影響，并用吸光度值來表示，吸光度值越高說明麥麩酯酶酶活性越大。由圖1可知，當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液中丙酮含量為5%時，麥麩酯酶酶活性變化不大，差異不顯著(P>0.05)。但是隨著丙酮含量的增加，麥麩酯酶酶活迅速減小(P<0.05)，說明當(dāng)丙酮含量過高時會抑制麥麩酯酶的活性,原因可能是一方面極性有機(jī)溶劑如丙酮可溶解大量的水并剝?nèi)ッ副３只钚缘谋匦杷?，從而使酶失去活性；另一方面可能是由于丙酮可通過破壞酶蛋白活性構(gòu)型的氫鍵、疏水作用等而使酶變性失活。因此，在提取蔬菜中的農(nóng)藥殘留時提取液中丙酮的體積分?jǐn)?shù)不得超過5%。

圖1　不同含量丙酮對麥麩酯酶酶活吸光度值的影響Fig.1　Effect of different concentrations on the activity of wheat bran esterase

2.1.2蔬菜中農(nóng)藥殘留提取液的確定

經(jīng)上述實驗篩選出的磷酸鹽緩沖液和體積分?jǐn)?shù)5%的丙酮磷酸鹽緩沖液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaCl鹽溶液作為蔬菜中農(nóng)藥殘留的提取液，從而選出最佳的農(nóng)殘?zhí)崛∫骸Ｓ蓤D2可知，含有5%丙酮的磷酸鹽緩沖液提取后的樣品提取液農(nóng)藥殘留回收率最大，而使用5%NaCl溶液和磷酸鹽緩沖液提取后的樣品提取液回收率差異不顯著( P>0.05),而且這2種樣品提取液的回收率均顯著(P<0.05)低于含有丙酮的緩沖液。原因可能是由于農(nóng)藥多屬于有機(jī)化合物，不易溶于水，而溶于丙酮、石油醚等有機(jī)溶劑。所以用含有丙酮的緩沖液提取樣品中的農(nóng)藥效果比磷酸鹽緩沖液和氯化鈉鹽溶液要好。因此，選擇5%的丙酮磷酸鹽緩沖液作為蔬菜中農(nóng)藥殘留提取液。

圖2　不同提取液對回收率的影響Fig.2　Effect of different extracting solution on the recovery of pesticide

2.2樣品提取時間的選擇

2.2.1振蕩法提取時間的確定

提取方法是指用溶劑將待測樣品中農(nóng)藥溶解、分離出來的操作步驟。利用上述實驗確定的提取液采用振蕩的方法進(jìn)行提取，比較不同的提取時間回收率的影響。由圖3可知，振蕩時間在5～25min時回收率逐漸升高，當(dāng)提取時間大于25min后隨著提取時間的延長回收率基本趨于平穩(wěn)，差異不顯著(P>0.05)。說明振蕩時間太短時，蔬菜上的農(nóng)藥不能完全被提取出來。所以，采用振蕩法提取農(nóng)藥時將25min作為最佳的提取時間。

圖3　振蕩提取時間對回收率的影響Fig.3　Influence of oscillation extraction time on the recovery

2.2.2超聲波法提取時間的確定

采用了超聲波法提取蔬菜中的農(nóng)藥殘留，并對2種提取方法進(jìn)行對比。結(jié)果如圖4可知，當(dāng)提取時間在1～5min時回收率迅速升高(P<0.05)，隨著時間的延長回收率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。這是因為隨著提取時間的延長蔬菜中的農(nóng)藥被完全提出，但是提取時間過長會使提取液溫度升高、細(xì)胞破碎導(dǎo)致提取液里有效充分發(fā)生變化，色素類物質(zhì)開始溶出，影響檢測結(jié)果。所以，采用超聲波法提取農(nóng)藥殘留時最佳的提取時間是5min。

圖4　超聲波提取時間對回收率的影響Fig.4　Influence of ultrasonic extraction time on the recovery

由圖3和圖4可以看出，2種提取方法的酶活抑制率都隨著提取時間的延長增加。但超聲波法在最佳提取時間下的農(nóng)殘回收率顯著(P<0.05)高于振蕩法，說明超聲波法要優(yōu)于振蕩法，這是由于振蕩提取只能提取出菜葉表面的農(nóng)藥殘留，而不能將葉片內(nèi)部殘留的農(nóng)藥提取出來。而且超聲所用的提取時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于振蕩提取法，所以選擇超聲波法提取蔬菜中的農(nóng)藥殘留，最佳提取時間為5min。

2.3樣品提取液處理方式的確定

將超聲波提取5min后的卷心菜和小白菜樣品提取液分別進(jìn)行直接測定、活性炭吸附后過濾、 0.45μm有機(jī)濾膜過濾3種不同的處理方法進(jìn)行處理。結(jié)果由表2可知，從卷心菜中提取的樣品提取液經(jīng)直接測定和0.45μm濾膜過濾后回收率差異顯著(P>0.05)，但是均顯著大于活性炭吸附后的回收率。說明從卷心菜上提取的樣品提取液過0.45μm有機(jī)濾膜與直接測定對測定結(jié)果沒有影響。這主要是因為卷心菜顏色淺，質(zhì)地較硬，樣品提取液無色透明不渾濁，所以在檢測時對透光率影響小。而從小白菜中提取的樣品提取液經(jīng)過3種處理方式后測定的結(jié)果差異均顯著(P<0.05)，其中過0.45μm有機(jī)濾膜后的回收率明顯要高于其他兩種處理方式。這可能是因為小白菜顏色為翠綠色，質(zhì)地軟，細(xì)胞破碎程度大，因此經(jīng)超聲波提取的樣品提取液顏色深且渾濁，而有機(jī)濾膜可過濾掉大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、附著有色素的粗纖維等，不影響小分子的物質(zhì)(農(nóng)藥)通過，提取液變澄清透明。無論在卷心菜還是小白菜中利用活性炭吸附后的回收率均低于濾膜過濾的，原因一方面可能是活性炭在吸附雜質(zhì)時也吸附了部分農(nóng)藥，另一方面是由于其吸附效果不如濾膜，因此測得的結(jié)果偏低。所以，在檢測顏色較淺的蔬菜時對樣品提取液可直接測定，而那些顏色較深的蔬菜樣提取液需采用0.45μm有機(jī)濾膜過濾掉樣品提取液中的雜質(zhì)。

表2　樣品提取液處理方式對農(nóng)藥回收率的影響　%

2.4樣品回收率實驗

加標(biāo)回收率是衡量農(nóng)藥殘留量分析方法準(zhǔn)確度和可靠性的指標(biāo)。為了驗證麥麩酯酶檢測蔬菜中6種農(nóng)藥殘留方法的可行性，將每種農(nóng)藥由小到大配制成3種不同的濃度進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗。結(jié)果表明該單標(biāo)樣品回收率在83.61%～102.81%之間，回收率測定值的變異系數(shù)小于7.23%(表3)。說明按照上述試驗方法處理后測得的回收率均比較高，即該方法檢測蔬菜殘留的農(nóng)藥效果較好。

表3　卷心菜中6種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率

3　結(jié)論

本研究依據(jù)酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留的方法以麥麩酯酶為檢測用酶，在農(nóng)殘檢測的最佳條件下通過對麥麩酯酶酶活抑制率的測定，對蔬菜中的農(nóng)藥殘留提取的前處理進(jìn)行優(yōu)化，得到了一組最優(yōu)前處理方法。即用體積分?jǐn)?shù)5%丙酮磷酸鹽緩沖液作為提取液，然后超聲波法提取5min后，將樣品提取液再用0.45μm有機(jī)濾膜過濾。并用該方法檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留的加標(biāo)回收率和變異系數(shù)，按照本方法處理后測得的回收率比較高且變異系數(shù)均在10%以內(nèi)，也進(jìn)一步證明了該方法的準(zhǔn)確性。通過本實驗前處理方法的優(yōu)化，即可以節(jié)省前處理用時，又不失檢測的精確性與穩(wěn)定性。

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Effectofdifferentpre-treatmentmethodsondetectionresultsoforganophosphateandcarbamatepesticideresiduesinvegetablesbyplantesteraseinhibitionmethod

JIANGLu,YELin,YANGXue,LIShan-shan,SHENGGuang-hui,ZHANGZhi-qing*

(CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014，China)

Theactivityofesterasecanbeinhibitedbyorganophosphateandcarbamatepesticideresidues.Theabilityoftheesterasetocatalyzethesubstratecanalsobereduced.Usingthisprinciple,theoptimizationsofpesticideresidueextractionsolution,extractingmethods,extractiontimeandthetreatmentofsamplesolutionwereseparatelydonebyusingwheatbranenzymeinhibitionmethod.Theresultsshowedthattheoptimalwaytoextractpesticidesresiduesinvegetableswas5%acetone/PBSextracting5minbyultrasonic,thenfilteredwith0.45μmorganicfilm.Withtheabovepre-treatmentmethods,theresponseraterangedfrom83.61%to102.81%,withcoefficientofvariationattherangedfrom1.2%to7.23%.Therefore,thispre-treatmentcanmeettheneedofrapiddetectionofpesticideresidues.

plantesterase;enzymeinhibition;organophosphoruspesticide;carbamatepesticide;vegetables;pre-treatmentmethod

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601037

碩士研究生(張志清教授為通訊作者，E-mail:zqzhang)。

2015-07-02，改回日期：2015-09-01