游靜，張德全，潘興嬌，張華，周濃,*，俞姣姣，王雅正

1(重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶，404000) 2(大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理，671000)

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高效液相色譜法同時測定太白貝母與暗紫貝母中9種核苷類成分的含量

游靜1，張德全2，潘興嬌2，張華1，周濃1,2*，俞姣姣1，王雅正1

1(重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶，404000) 2(大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理，671000)

建立太白貝母和暗紫貝母中9種核苷類成分(尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷)的高效液相色譜法(HPLC)分析方法，并對核苷類的含量進(jìn)行比較。采用VenusilMPC18(2)(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，甲醇-水為流動相，梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長260nm為分析條件。在設(shè)定的試驗條件下，9種核苷在30min內(nèi)實現(xiàn)了良好的分析，待測核苷成分在各自線性范圍內(nèi)，峰面積積分值與進(jìn)樣量質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系(r= 0. 999 0～0. 999 9)，平均回收率為96.68 %～101.35 %(RSD<3%)。結(jié)果表明：不同品種及同一品種不同商品名稱的太白貝母和暗紫貝母中均含有9種核苷類成分，但含量上均存在差異，其中尿苷、鳥苷和腺苷含量較高，而尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸苷、2′-脫氧腺苷含量較低。松貝中核苷類成分的含量略低于青貝。太白貝母中胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷及其總含量整體上呈現(xiàn)出隨著生長年限(花生大貝、花生小貝>大尖、中尖、小尖>松尖)增加而含量降低趨勢，但尿嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤含量呈現(xiàn)出隨著生長年限增加而增加的趨勢。從整體上看，太白貝母中核苷類成分的含量高于暗紫貝母，具有化學(xué)等同性，2種基源的川貝母作為同一藥材使用是可行的。

太白貝母；暗紫貝母；高效液相色譜法；核苷；商品規(guī)格；同時測定

川貝母為百合科植物太白貝母(Fritillaria taipaiensisP.Y.Li)、暗紫貝母(Fritillaria unibracteataHsiaoetK.C.Hsia)等貝母屬植物的干燥鱗莖，為馳名中外的藥材，有著悠久的應(yīng)用歷史，為潤肺止咳的要藥，療效顯著[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，以川貝母為原料生產(chǎn)的中成藥多達(dá)200種以上[3]，同時，常用于清咽潤喉和糖尿病類的保健食品配方中[4]。因此，川貝母在疾病治療或日常食療中扮演著日益重要的角色，與人民健康密切相關(guān)。

據(jù)文獻(xiàn)記載，太白貝母與暗紫貝母中主要含生物堿、皂苷、核苷、多糖等[2]，其中水溶性成分主要是核苷類成分[5-6]。研究表明，暗紫貝母等祛痰有效成分主要集中在其水提物中[7]，而川貝母的傳統(tǒng)用藥方法主要是水煎劑[5-6]，因此，對川貝母水溶性成分的研究具有重要意義。目前，針對太白貝母和暗紫貝母中核苷類含量的檢測報道較多[5-6, 8-9]，但太白貝母和暗紫貝母核苷類含量的檢測與比較文獻(xiàn)很少。

本試驗采用高效液相色譜法分別測定太白貝母和暗紫貝母的核苷類含量，并對它們的核苷類化合物進(jìn)行了含量分析及種類差異的相關(guān)性研究。

1　材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津集團(tuán)；DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；SB-5200DTN型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機，湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；CP225D型分析天平，德國Sartorius公司。

1.2材料與試劑

太白貝母于2011年7月采自重慶市巫溪縣蘭英鄉(xiāng)太白貝母種植基地，經(jīng)重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院周濃副教授鑒定為百合科植物太白貝母F. taipaiensis的干燥鱗莖，根據(jù)不同生長年限而藥材形狀和大小分為6個商品名稱，分別稱作松尖、小尖、中尖、大尖、花生小貝和花生大貝。暗紫貝母于2011年6月采自四川省松潘縣，經(jīng)重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院周濃副教授鑒定為百合科植物暗紫貝母F. unibracteata的干燥鱗莖，根據(jù)形態(tài)特征不同分為松貝、青貝(見表4)，留樣憑證存放于重慶三峽學(xué)院生物與食品基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心。

尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：100469-200401、140631-201205、110887-200202、886-200001、101215-201401、110879-200202)，胞苷、鳥苷、2′-脫氧腺苷對照品(南京都萊生物技術(shù)有限公司，純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計算大于98%)。甲醇色譜純?yōu)槊绹鳩isher公司，水為娃哈哈牌純凈水。

1.3色譜條件

色譜柱為VenusilMPC18(2)柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為A相為甲醇，B相為水，梯度洗脫(0min→10min→15min→20min→30min，1%A→5%A→15%A→20%A→30%A)；檢測波長為260nm；體積流量為1.0mL/min；進(jìn)樣量為20μL；柱溫為35 ℃。

1.4對照品溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥至恒重的尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷對照品適量，加純凈水溶解并制成質(zhì)量濃度分別為107.8、105.7、102.8、105.9、107.0、317.4、105.2、882.0、106.1μg/mL的對照品貯備液。

1.5供試品溶液的制備

精密稱取樣品粉末(過3號篩)1.0g，置50mL具塞錐形瓶中，精密加蒸餾水10mL，混勻，室溫下超聲提取 60min(超聲功率300W，工作頻率40kHz)，取出，放至室溫，搖勻，倒入離心管中，4 000r/min離心10min，過濾，濾渣重復(fù)操作1次，合并濾液，以蒸餾水定容至25mL量瓶中，用前4 000r/min離心15min后0. 45μm微孔濾膜過濾，即得試品溶液。

1.6線性關(guān)系考察

分別精密吸取1.4項下各對照品貯備溶液適量，以純凈水溶解并稀釋制成6個不同質(zhì)量濃度的系列對照品混合溶液。分別在1.3項下方法進(jìn)行測定，以各對照品的峰面積積分值(y)與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.7精密度實驗

取同一對照品混合溶液，按1.3項下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各核苷的色譜峰面積，通過計算RSD以考察儀器的精密度。

1.8重復(fù)性實驗

取太白貝母(S8)和暗紫貝母(S1)樣品粉末各6份，每份1.0g，精密稱定，按1.5項下方法制備供試品溶液，按1.3項下方法進(jìn)行測定，記錄各核苷的色譜峰面積，通過計算RSD以考察本方法的重復(fù)性。

1.9穩(wěn)定性實驗

取同一太白貝母(S8)和暗紫貝母(S1)供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12h按1.3項下方法進(jìn)行測定，記錄各核苷的色譜峰面積，通過計算RSD以考察本樣品的穩(wěn)定性。

1.10加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的太白貝母(S8)和暗紫貝母(S1)樣品粉末約0.50g，各6 份，分別精密加入各核苷對照品貯備溶液適量，按1.5項下方法制備供試品溶液，驗證本方法的準(zhǔn)確性，計算加樣回收率。

1.11樣品含量測定

按1.5項下方法制備8批供試品溶液，按1.3項下方法進(jìn)行測定，測定其9種核苷類成分的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品的HPLC色譜測定結(jié)果

太白貝母、暗紫貝母樣品及9種混合對照品分離的HPLC色譜圖(圖1)。結(jié)果顯示，在1.3項下色譜條件下25min左右樣品中核苷和堿基可被全部洗脫，9種核苷和堿基能在30min有效分離，且峰形良好，雜質(zhì)干擾少，因此該流動相是可行的。同時，太白貝母和暗紫貝母的HPLC圖整體上具有一定的相似性，進(jìn)一步說明不同川貝母品種在該流動相下存在各核苷類成分量比關(guān)系的不同，但還存在自身的特征峰。

1-尿嘧啶；2- 胞苷；3- 鳥嘌呤；4- 尿苷；5- 腺嘌呤；6- 鳥苷；7- 胸苷；8- 腺苷；9- 2′-脫氧腺苷圖1　混合對照品(A)、太白貝母(B)、暗紫貝母(C)HPLC色譜圖Fig.1　The Chromatograms of Standand (A), Fritillaria taipaiensis(B)and Fritillaria unibracteata(C)

2.2線性關(guān)系考察的結(jié)果

9種核苷類成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程見表1，相關(guān)系數(shù)r均大于0. 999 0，說明峰面積與核苷含量之間具有顯著的線性相關(guān)性。

2.3精密度試驗

尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷RSD分別為0.43 %、0.53 %、0.76 %、0.79 %、1.91 %、0.92 %、1.15 %、1.27 %、1.64 %，說明檢測儀器檢測時精密度良好。

表1　9種核苷成分的線性關(guān)系和范圍

2.4重復(fù)性試驗

太白貝母(S8)中尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷的含量分別為22.599 1、10.599 8、15.397 9、123.011 5、10.247 4、94.558 2、7.307 2、143.146 1、10.753 3μg/g，RSD分別為2.54 %、1.25 %、1.45 %、1.81 %、1.02 %、2.63 %、1.85 %、2.73 %、1.79 %；暗紫貝母(S1)中尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷的含量分別為8.752 9、20.659 8、3.304 6、71.527 1、6.208 6、62.144 0、25.651 1、84.612 7、30.367 0μg/g，RSD分別為1.68 %、2.01 %、2.12 %、1.69 %、0.92 %、1.94 %、2.65 %、1.57 %、2.78 %，表明本方法的重復(fù)性較好。

2.5穩(wěn)定性試驗

太白貝母(S8)中尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷色譜峰面積的RSD分別為2.57 %、2.24 %、0.39 %、2.01 %、2.20 %、0.99 %、2.82 %、2.68 %、2.48 %；暗紫貝母(S1)中尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷色譜峰面積RSD分別為2.81 %、1.89 %、1.28 %、1.06 %、2.93 %、0.62 %、1.98 %、2.10 %、2.54 %，說明樣品溶液至少在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6加樣回收率實驗

太白貝母(S8)中9種核苷的平均回收率在97.16 %～101.35 %，RSD1.01 %～2.77 %，符合分析要求，結(jié)果見表2。暗紫貝母(S1)中9種核苷的平均回收率在96.68 %～100.73 %，RSD1.44 %～2.56 %，符合分析要求，結(jié)果見表3。表明上述實驗方法的準(zhǔn)確度較高，能應(yīng)用于川貝母中核苷和堿基類活性成分的檢測與分析。

表2　加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

續(xù)表2

化合物本底值/μg加標(biāo)量/μg測定值/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%鳥嘌呤7.70207.196014.763198.1397.161.017.69907.196014.589195.757.70057.196014.694197.1961.518163.5400125.9380101.3861.530463.5400122.889196.57尿苷61.542763.5400124.437898.9998.942.1561.530463.5400122.798696.4261.505863.5400125.7431101.1061.518163.5400124.541899.195.12475.350010.362497.905.12575.350010.6377103.035.12685.350010.5546101.46腺嘌呤5.12575.350010.292596.5899.442.395.12375.350010.398698.605.12475.350010.425599.0847.288647.610095.3161100.8847.298047.610096.8379104.05鳥苷47.307547.610096.6858103.71101.192.6047.298047.610093.928997.9447.279147.610094.072698.2947.288647.610095.9698102.253.65434.20807.814898.873.65514.20807.748197.27胸苷3.65584.20807.697196.0497.882.073.65514.20807.806498.653.65364.20807.9017100.953.65434.20807.672195.4871.587470.5600142.3372100.2771.601770.5600145.4248104.62腺苷71.616070.5600142.089699.88101.352.1371.601770.5600143.3776101.7271.573170.5600141.243898.7471.587470.5600144.1815102.885.37775.305010.432395.285.37885.305010.465095.882'-脫氧5.37995.305010.545697.3897.251.48腺苷5.37885.305010.623198.865.37675.305010.546497.455.37775.305010.611598.66

表3　加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

續(xù)表3

化合物本底值/μg加標(biāo)量/μg測定值/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%胞苷10.334010.570020.388295.1298.152.5610.346410.570021.1521102.2310.340210.570020.779198.7610.332010.570020.600897.151.65262.05603.608795.141.65232.05603.676098.43鳥嘌呤1.65302.05603.668198.0197.161.681.65492.05603.633896.251.65402.05603.625195.871.65262.05603.693499.2635.770731.770067.299299.2435.763631.770066.637797.18尿苷35.777931.770067.6782100.4197.621.9335.820831.770066.758497.3835.799331.770066.187395.6535.770731.770066.219195.843.10493.21006.292199.293.10433.21006.189196.10腺嘌呤3.10553.21006.268398.5396.801.743.10933.21006.187795.903.10743.21006.185195.883.10493.21006.158395.1231.078231.740061.758196.6631.072031.740061.367895.45鳥苷31.084431.740062.595999.2896.921.4431.121731.740062.106397.6231.103131.740061.487895.7331.078231.740061.799396.7912.828110.520023.255599.1212.825610.520023.184698.47胸苷12.830710.520022.932096.0298.341.4612.846110.520023.300999.3812.838410.520023.073397.2912.828110.520023.323999.7742.314844.100087.3718102.1742.306444.100086.203599.54腺苷42.323344.100087.8566103.25100.732.2042.374044.100085.296597.3342.348744.100086.364999.8142.314844.100087.4115102.2615.186515.915030.818298.2215.183515.915030.361695.372'-脫氧15.189615.915030.991699.2996.681.77腺苷15.207815.915030.427395.6315.198715.915030.555196.4915.186515.915030.320195.09

2.7樣品的含量測定

按標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，分別計算太白貝母和暗紫貝母藥材中9種核苷類成分的含量，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，太白貝母和暗紫貝母中核苷類成分比較相似，均含有尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷，尿苷、鳥苷、腺苷為其主要成分，其含量較高，這與太白貝母[5]、暗紫貝母[6]的水溶性成分的研究結(jié)果一致。不同商品規(guī)格太白貝母和暗紫貝母樣品中核苷類成分的含量具有明顯差異，太白貝母栽培品核苷含量相對高于暗紫貝母，這與曹新偉等[9]對川貝母中核苷含量比較的結(jié)果相一致，與沈力等[10]對其兩者祛痰藥效學(xué)研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步顯示太白貝母栽培品作為擴(kuò)大川貝母藥材資源具有較大的核苷類含量優(yōu)勢。因此，從水溶性活性成分角度來看，2010年版《中國藥典》已將太白貝母列為川貝母項下具有一定的科學(xué)依據(jù)。

由表4還可知，太白貝母中胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷及其總含量水平整體上呈現(xiàn)出隨著生長年限(花生大貝、花生小貝>大尖、中尖、小尖>松尖)增加而減小的趨勢，與彭銳[8]、王懷玉[11]等人的研究結(jié)果基本一致，說明太白貝母的最適生長與其次生代謝物質(zhì)合成對生態(tài)環(huán)境條件的要求有一定的矛盾，導(dǎo)致核苷類含量和產(chǎn)量不能同步增長，表明人工栽培技術(shù)在提高太白貝母品質(zhì)方面尚未成熟。但尿嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤含量水平整體上呈現(xiàn)出隨著生長年限增加而增加的趨勢，說明生長年限對太白貝母不同核苷類成分的影響不一致，應(yīng)根據(jù)臨床需要確定合理采收年限。同時，松貝中9種核苷及其總含量略低于青貝，提示著松貝作為川貝母藥材中的止咳佳品，其發(fā)揮藥效特色的不僅是核苷類成分。

表4　太白貝母和暗紫貝母中9種核苷類成分的含量(n=3)μg/g

3　結(jié)論

(1)本實驗采用HPLC法同時檢測太白貝母與暗紫貝母中尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷的含量測定方法，并首次測定川貝母中2′-脫氧腺苷的含量，所建立的方法準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可用于精確測定川貝母中核苷類成分的含量，適用于川貝母藥材、飲片及其成方制劑生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制指標(biāo)，均能起到一定的指導(dǎo)作用。

(2)鑒于核苷類成分顯著的生物活性及其在川貝母藥材中含量豐富，同時尿苷、鳥苷、腺苷含量較高，提示尿苷、鳥苷、腺苷可作為川貝母質(zhì)量評價的指標(biāo)，因此在對川貝母生物堿進(jìn)行含量測定的同時建立對尿苷、鳥苷、腺苷的定量檢測方法能使川貝母的內(nèi)在質(zhì)量控制更加全面、更加合理。

(3)通過對同一產(chǎn)地不同商品規(guī)格太白貝母與暗紫貝母中核苷類提取物在本試驗條件下的定性和定量綜合分析評價表明，從水溶性活性成分的角度來看，8批川貝母樣品整體活性成分組成相似、藥效亦相近，且太白貝母栽培品中核苷類含量均高于暗紫貝母野生品。因此，從核苷類活性成分來講，現(xiàn)已將太白貝母作為川貝母新的基源植物，具有一定的科學(xué)依據(jù)和良好的開發(fā)前景，川貝母資源匱乏問題有望能得到一定程度的緩解。

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Simultaneousdeterminationofninenucleosidescontentsusinghigh

performanceliquidchromatographyinFritillaria taipaiensisP.Y.LiandFritillaria unibracteataHsiaoetK.C.Hsia

YOUJing1,ZHANGDe-quan2,PANXing-jiao2,ZHANGHua2,ZHOUNong1,2*,YUJiao-jiao1,WANGYa-zheng1

1(CollegeofLifeScienceandEngineering,ChongqingThreeGorgesUniversity,Chongqing404000,China) 2(CollegeofPharmacyandChemistry,DaliUniversity,Dali671000,China)

Anewhighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodforanalyzingninenucleosides(uracil,cytosine,guanine,uridine,adenine,guanosine,thymidine,adenosine,and2'-deoxyadenosine)wasestablishandthecontentsofnucleosideswerecomparedbetweenFritillaria taipaiensisP.Y.LiandFritillaria unibracteatHsiaoetK.C.Hsia.TheVenusilMPC18(2)chromatographiccolumn(4.6mm× 250mm, 5μm)wasused.HPLC-grademethanolandwaterwereusedasmobilephaseAandmobilephaseB,respectively.Theelutionconditionisgradientelutionataflowrateof1.0mL/minusingUVdetectorat260nm.Thetemperatureofcolumnwasmaintainedat35℃.Theresultsshowedthattheseparationeffectofninenucleosideswasgoodwithin30minusingthenewHPLCmethod.Thepeakareavaluesandconcentrationofninenucleosidestestedallshowedagoodlinearrelationship(r=0. 999 0～0. 999 9)withintheirlinearranges.Therecoveryratewas96.68 % ～ 101.35 % (RSD<3%).TheanalysisofnucleosidesinF. taipaiensisandF. unibracteatashowedthattheninenucleosideswasincludedindifferentvarietiesanddifferentcommercialnamesofthesamespecies.However,thecontentsvaried.Thecontentwasthehigherinuridine,guanosineandadenosine,butlowerinuracil,cytosine,guanine,adenine,thymidineand2'-deoxyadenosine.ThecontentofnucleosidesinSongbeiwasslightlylowerthanthatofQingbei.Thecontentofcytidine,uridine,guanosine,thymidine,adenosine, 2'-deoxyadenosineandthetotalnucleosidescontentdecreasedwiththegrowthyear,theorderofthecontentisHuashengdabei,Huashengxiaobei>thatofDajian,Zhongjian,Xiaojian>Songjian.However,thecontentofuracil,guanineandadenineshowedtheincreasingtendencywiththegrowthyear.Overall,thecontentofnucleosidesinF. taipaiensiswashigherthanthatofF. unibracteata.Theyhadtheequivalenceinchemicalcomponet.ItwasfeasiblethatthetwoFritillaria cirrhosawereusedassamemedicalherbs.

Fritillaria taipaiensisP.Y.Li; Fritillaria unibracteataHsiaoetK.C.Hsia;highperformanceliquidchromatography;nucleosides;commercialspecifications;simultaneousdetermination

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601032

學(xué)士(周濃為通訊作者，E-mail：erhaizn@126.com)。

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目(No.CSTC2013jcyjA10120)；國家自然科學(xué)基金項目(No.31200180)資助

2015-05-05，改回日期：2015-07-29