王忠合，王軍，胡慧娟

(韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品科技學(xué)院，廣東 潮州，521041)

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模式類黑精及其分級產(chǎn)物清除自由基能力、抗氧化性及還原力分析

王忠合，王軍*，胡慧娟

(韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品科技學(xué)院，廣東 潮州，521041)

以甘氨酸和葡萄糖為底物制備模式類黑精，采用膜法制備分級產(chǎn)物，分析模式類黑精及其分級產(chǎn)物的自由基清除能力、抗氧化性及還原力。結(jié)果表明：水溶性類黑精及其分級產(chǎn)物具有較好的清除羥自由基、超氧陰離子和DPPH自由基的能力；雞卵黃脂質(zhì)過氧化模型分析表明模式類黑精及其分級產(chǎn)物的抗脂質(zhì)過氧化性差異較大，模式類黑精和高分子質(zhì)量的類黑精抗氧化效果較理想；采用鐵氰化鉀法和二氯酚定酚法測定模式類黑精及分級產(chǎn)物的還原力表明，高分子質(zhì)量的類黑精還原力最大。

類黑精；清除自由基；抗氧化；還原力

類黑精(melanoidins)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、聚合度不等的高分子聚合物的混合體，屬于美拉德反應(yīng)后期形成的一類棕褐色物質(zhì)[1- 2]，廣泛分布于熱加工食品中，如面包、蜂蜜、豆豉、咖啡、醋等食品中[3-6]。許多研究表明，類黑精不僅影響食品的色澤、風(fēng)味等感官特性，還可抑制食品的氧化變質(zhì)及礦物質(zhì)的吸收代謝，同時，類黑精可被腸道微生物降解，與膳食纖維類似，可改變腸道菌群、促進雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌的生長繁殖、產(chǎn)生短鏈脂肪酸，具有較好的益生特性[7]，因此，食品中類黑精與人類健康的關(guān)系非常密切。另外，類黑精有結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)等生理活性，對食品風(fēng)味品質(zhì)保持和延長商品貨架期也有重要意義[8-9]。

類黑精是美拉德反應(yīng)后期階段低分子質(zhì)量的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)環(huán)化、脫水、縮合等過程形成的，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加之目前的分析檢測方法有限，因此無法得知其具體結(jié)構(gòu)。類黑精的制備普遍采用氨基酸、蛋白質(zhì)等氨基化合物與羰基化合物長時間加熱后分離純化得到，其分子質(zhì)量差異較大，模擬法制備的類黑精可溶于水、等電點為pH 2.5、帶有負(fù)電荷[2,7]，而食品中的類黑精常以非共價鍵的形式結(jié)合其他組分，結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，現(xiàn)有的分離手段和檢測技術(shù)尚無法完全確定其結(jié)構(gòu)。本文采用模式美拉德反應(yīng)體系制備類黑精，并采用透析法制備分級產(chǎn)物，以深入探索類黑精及分級產(chǎn)物的抗氧化性、清除自由基能力和還原力等性質(zhì)。

1　實驗材料與儀器

1.1材料與試劑

新鮮雞蛋，購于當(dāng)?shù)厥袌觯?,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)，美國Sigma公司，優(yōu)級純；2-硫代巴比妥酸(2-TBA)，上海晶純，生化試劑;L-甘氨酸,上海伯奧生物科技有限公司，分析純;無水葡萄糖,廣州化學(xué)試劑廠，分析純;FeSO4、抗壞血酸、2, 6-二氯酚靛酚、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、K3Fe(CN)6、水楊酸、三氯乙酸、H2O2、FeCl3、Na2HPO4、Na2HPO4、無水乙醇等均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1901型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；Flowmen-0015螺旋平板膜設(shè)備，廈門福美科技有限公司；Parr 4597高壓反應(yīng)釜，美國Parr儀器公司；Scientz-18N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技有限公司；2-16P型高速離心機，美國Sigma公司；ZHWY-2102C恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器有限公司；85-3恒溫磁力攪拌器，常州華普達教學(xué)儀器有限公司等。

1.3實驗方法

1.3.1模式類黑精及其分級產(chǎn)物的制備

模式類黑精的制備：取9.00 g葡萄糖和3.75 g甘氨酸溶于加入20 mL蒸餾水中，冷凍干燥，置于預(yù)熱至125 ℃的真空干燥箱中加熱2 h。反應(yīng)后取出，放入干燥器中冷卻至室溫，粉碎，取5 g粉末加入200 mL蒸餾水于4 ℃攪拌12 h充分溶解，再用4號濾紙過濾，濾渣各用20 mL水洗滌2次，收集濾液合并，定容至250 mL得到水溶性類黑精M。

分級產(chǎn)物的制備：取50 mL水溶性類黑精M，用截留量分子質(zhì)量為10 kDa的超濾膜分級得到截留物和透過液，真空濃縮后，冷凍干燥得到低分子質(zhì)量的類黑精和高分子量的類黑精，各取1 g左右定容至50 mL，分別得到低分子質(zhì)量類黑精LWM和高分子量類黑精HWM。

1.3.2模式類黑精的圖譜掃描及定量分析

分別于200～800 nm下掃描模式類黑精及其分級產(chǎn)物的圖譜，并利用類黑精在470 nm處的消光系數(shù)相當(dāng)于(0.64±0.03) L/mmol的特性計算其含量。

1.3.3羥自由基清除能力測定

按照文獻中Fenton反應(yīng)的方法[10]測定，在試管中依次加入0.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，0.5 mL不同濃度的樣液，0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，3.5 mL蒸餾水，最后加入5 mL 88 mmol/L H2O2溶液啟動Fenton反應(yīng)，搖勻后于510 nm處測定吸光度A1；取0.5 mL蒸餾水代替9 mmol/L FeSO4溶液所測得的吸光度為A2；取0.5 mL蒸餾水代替樣液所測得的吸光度為A3。按式(1)計算羥自由基的清除率P：

(1)

1.3.4超氧陰離子清除能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法[11]測定樣品對超氧陰離子的清除作用，取9 mL pH 8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液分別與1 mL不同濃度的樣液混合，于25 ℃恒溫15 min，取混合液3 mL在比色皿中加入45 mmol/L的鄰苯三酚(用0.01 mmol/L HCl配制)溶液0.1 mL，搖勻，反應(yīng)3 min，在波長420 nm處測定吸光度。按照式(2)計算超氧陰離子清除率P：

(2)

其中：A1為9 mL磷酸鹽緩沖溶液+1 mL樣品+0.1 mL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液；A2為9 mL磷酸鹽緩沖溶液+1 mL樣品+0.1 mL 0.01 mmol/L的鹽酸；A3為9 mL磷酸鹽緩沖溶液+1 mL蒸餾水+0.1 mL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液。

1.3.5清除DPPH自由基能力測定

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個苯環(huán)，1個氮原子上有1個孤對電子，呈紫色，在517 nm有強吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)是成化學(xué)劑量關(guān)系的，因此常用于檢測自由基的清除情況，從而評價試驗樣品的抗氧化能力[12]。取不同濃度的樣品溶液2 mL，與2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液(溶于乙醇)混合，暗處靜置30 min，在517 nm處測定吸光度As，用蒸餾水代替樣品測定吸光度Ab，用乙醇代替DPPH溶液測定吸光度Ac。按照式(3)計算樣品對DPPH自由基的清除率P：

(3)

1.3.6抗脂質(zhì)過氧化能力的測定

采用依賴雞卵黃脂蛋白的脂質(zhì)過氧化模型測定樣品抗氧化能力[13]，將新鮮卵黃用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)按1∶1(g:mL)配成懸液，再稀釋25倍，磁力攪拌30 min。向試管中加入卵黃懸液0.4 mL；然后分別依次加入不同稀釋濃度的樣品0.2 mL(對照管加入相同體積的PBS溶液)、25 mmol/L的FeSO4溶液0.4 mL，并用0.1 mol/L的PBS溶液補至4.0 mL，置于37 ℃水浴中，振蕩50 min。取出后加入20%的三氯乙酸溶液1 mL，靜置10 min后以3 000 r/min離心15 min，取上清液4 mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%硫代巴比妥酸溶液2 mL，塞緊管口，于100 ℃水浴中反應(yīng)15 min，空白管以PBS溶液取代上清液，其余操作相同。最后在532 nm處測定樣品的吸光度，平行測定3次，取平均值，并根據(jù)式(4)計算樣品抗脂質(zhì)過氧化能力P：

(4)

式中，A0和A1分別為對照組和樣品組的吸光度。

1.3.7還原力分析

鐵氰化鉀法：參考BENJAKUL等人[14]的方法測定。取不同濃度的樣品液1 mL，再加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、1 mL 1%K3Fe(CN)6溶液混合，在50 ℃水浴中暗處反應(yīng)20 min，之后加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，750×g 25 ℃離心10 min，取1 mL上清液加1 mL去離子水和200 μL 0.1% FeCl3溶液，于700 nm處測定吸光度。還原能力用吸光度的增加值來表示。

2,6-二氯酚定酚法：采用類似于測定Vc的方法[15]分析樣品的還原性，準(zhǔn)確吸取1 mL樣液于惰性氣體中用微量滴定管以1 mmol/L的2,6-二氯酚靛酚標(biāo)準(zhǔn)液滴定至淡紅色，并保持15 s不褪色即為終點，2,6-二氯酚靛酚標(biāo)準(zhǔn)液的濃度以定量的滴定測得，樣品還原力的實驗結(jié)果以等量值μmol/g表示。

1.4實驗數(shù)據(jù)處理

實驗平行測定2次以上，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD表示，用SPSS 17.0進行一維方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著性采用Duncan(鄧肯)檢驗，檢驗水平P<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1模式類黑精及分級產(chǎn)物的紫外可見圖譜分析

模式類黑精M及分級產(chǎn)物L(fēng)WM(<10 kDa)、HWM(>10 kDa)的分級組分在200～800 nm的圖譜如圖1所示。

圖1　模式類黑精及其分級產(chǎn)物的掃描圖譜Fig.1　Absorption spectra of melanoidins and fractions

由圖1可知，類黑精及其分級組分在波長400～800 nm的可見光區(qū)域都是隨著波長的增大而逐漸降低，而在200～400 nm的紫外區(qū)域類黑精及其低分子量的分級產(chǎn)物均有最大吸收峰，分別在295 nm和284 nm處有最大吸收峰，這主要是一些美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的特征吸收峰，在低分子質(zhì)量的分級產(chǎn)物中其吸光度增大，而在高分子質(zhì)量的分級產(chǎn)物中其吸光度非常小，這表明一些小分子組分可通過超濾處理而除去，與文獻[16]中報道的結(jié)果一致。高分子質(zhì)量的分級組分在405、420或470 nm處的吸光度較大，而其他低分子質(zhì)量的分級組分吸收情況較小，因此測定類黑精含量時常選用此波長范圍[17]。由模式類黑精及其分級組分在470 nm處的吸光度可計算各出模式類黑精樣品M、低分子質(zhì)量的分級產(chǎn)物L(fēng)WM和高分子質(zhì)量的分級產(chǎn)物HWM中類黑精的含量分別為；0.053 8、0.012 5、0.155 8 mmol/L。

2.2模式類黑精及分級產(chǎn)物對羥自由基清除能力

模式類黑精及其分級組分清除羥自由基能力的實驗結(jié)果如圖2所示從圖2中可知，模式類黑精及其分級組分對羥自由基清除能力隨著樣品濃度的升高而增大，由清除作用的回歸方程可知模式類黑精、LWM及HWM分級組分清除羥自由基的IC50值分別為1.21、0.39、2.48 mg/mL，其中低分子質(zhì)量的類黑精LWM對羥自由基清除作用最明顯，這與其中含有的小分子類化合物如5-羥甲基糠醛等有關(guān)。

圖2　模式類黑精及其分級產(chǎn)物對羥自由基清除能力Fig.2　Hydroxyl radical-scavenging ability of modelmelanoidins and fractions

2.3模式類黑精及分級產(chǎn)物清除超氧陰離子能力

模式類黑精及分級產(chǎn)物對超氧陰離子清除能力的測定結(jié)果如圖3所示。從圖3中可知，類黑精M、LWM、HWM清除超氧陰離子的能力隨著樣品濃度的增加而增大，其IC50值分別為455.02、200.44、1 350.76 mg/mL，樣品清除超氧陰離子能力的大小為：LWM>類黑精M>HWM，這表明類黑精及其分級產(chǎn)物具有一定的清除超氧陰離子的能力。

圖3　模式類黑精對超氧陰離子的清除能力Fig.3　Superoxide anion scavenging ability of model melanoidins and fractions

2.4模式類黑精及分級產(chǎn)物對DPPH自由基清除能力

類黑精樣品及其分級產(chǎn)物清除DPPH自由基能力實驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，類黑精M、LWM、HWM對DPPH自由基具有較顯著的清除作用，且隨著樣品濃度的增加而增大，其IC50值分別為0.21、0.17、0.11 mg/mL。類黑精及其分級產(chǎn)物均具有較好的清除DPPH自由基的能力，這可能是因為在美拉德反應(yīng)過程中形成的中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物色素類物質(zhì)均可作為氫的供體而與DPPH自由基反應(yīng)，與其他文獻報道的結(jié)果一致[18]，因而模式類黑精及其分級組分均可有效地清除DPPH自由基。

圖4　模式類黑精及分級產(chǎn)物對DPPH自由基清除能力Fig.4　DPPH radical-scavengingability of model melanoidins and fractions

2.5模式類黑精及分級產(chǎn)物抗脂質(zhì)過氧化能力

模式類黑精及分級產(chǎn)物抗脂質(zhì)過氧化能力的實驗結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，模式類黑精M、LWM、HWM在采用依賴雞卵黃的脂質(zhì)過氧化模型中的抗脂質(zhì)過氧化效果較好，其中，類黑精M及其LWM的抑制脂質(zhì)過氧化的效率隨著樣品濃度的增加而逐漸增大，與文獻[19]中報道的結(jié)果一致，主要受美拉德反應(yīng)初級階段的反應(yīng)產(chǎn)物影響。而高分子質(zhì)量的分級組分的抑制脂質(zhì)過氧化的效率隨著樣品濃度的增加而急劇增大，這可能是由于高分子質(zhì)量的類黑精具有較強的絡(luò)合亞鐵離子的能力從而可以顯著降低其催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[20]。

圖5　模式類黑精及其分級產(chǎn)物的抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.5　Anti-lipid peroxidation ability of model melanoidins and fractions

2.6模式類黑精及分級產(chǎn)物的還原力分析

2.6.1鐵氰化鉀法測還原力

鐵氰化鉀法測定類黑精及其分級組分的總還原力的實驗結(jié)果如圖6所示。類黑精M、LWM、HWM的吸光度隨著樣品濃度的增加而逐漸增大，這表明其還原能力逐漸增強，并且其大小趨勢為HWM>M>LWM，這說明高分子質(zhì)量的模式類黑精分級產(chǎn)物的還原力較大，可能與高分子質(zhì)量的類黑精具有較強的絡(luò)合亞鐵離子的能力有關(guān)[20]。

圖6　鐵氰化鉀法測定類黑精及其分級組分的還原力Fig.6　Reducing power of melanoidins and fractions assessing by potassium ferricyanide

2.6.2二氯酚定酚法測還原力

采用2,6-二氯酚定酚法測定類黑精及其分級組分還原力的實驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，類黑精M及其分級組分均具有一定的還原性，大小依次為HWM>LWM>M，與鐵氰化鉀法測定的總還原力結(jié)果一致。

表1　二氯酚靛酚法測定還原力實驗結(jié)果

注：數(shù)據(jù)標(biāo)注不同的小寫字母表示差異顯著，P<0.05。

3　結(jié)論

模式類黑精及其分級產(chǎn)物均有一定的清除超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基的能力，其中低分子質(zhì)量的類黑精LWM對超氧陰離子和羥自由基的清除作用最明顯，這與其中含有的小分子類化合物有關(guān)。

采用雞卵黃脂質(zhì)過氧化模型分析表明，高分子質(zhì)量的分級組分HWM的抑制脂質(zhì)過氧化的效果相對較大，可能與其螯合亞鐵離子的能力有關(guān)。

采用鐵氰化鉀法和二氯酚靛酚法測定類黑精及其分級組分的還原力，其中高分子質(zhì)量的分級組分HWM的還原性最大。

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Analysis of free radical-scavenging and reducing ability of melanoidins and its fractions

WANG Zhong-he, WANG Jun*, HU Hui-juan

(School of Life Science and Food Technology,Hanshan Normal University, Chaozhou 521041,China)

In this paper, standard melanoidins derived from glycine-glucose model system were prepared using Maillard reaction and ultrafiltration methods, and radical-scavenging ability, antioxidant ability and reducing capacity of standard melanoidins and its fractions were also investigated. Results showed that water-soluble melanoidins and fractions possessed stronger radical-scavenging ability, including hydroxyl radical, superoxide anion and DPPH radical. However, only water-soluble melanoidins showed better antioxidant properties in yolk lipid peroxidation model. Finally, high molecular weight fraction (HMW) has the best reducing capacity by potassium ferricyanide and 2, 6-dichloroindophenol evaluation methods.

melanoidins; radical-scavenging ability; antioxidant properties; reducing capacity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601017

博士,講師(王軍博士為通訊作者，E-mail：wangjun19811210@163.com)。

廣東省自然科學(xué)基金項目(S2013040015478); 廣東省高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2013LYM0056); 韓山師范學(xué)院青年計劃項目(LQ201202); 韓山師范學(xué)院博士啟動項目(QD20130516); 韓山師范學(xué)院一般項目(LY201306); 潮州市科技計劃項目(2013X05&2013X06&2014N02)資助

2015-07-13，改回日期：2015-09-02