劉洋，趙燃，黎妮，曹艷花，張超，白飛榮，

張欣1，袁隆平1，王偉平1,3*，程池2*

1(雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南雜交水稻研究中心)，湖南 長(zhǎng)沙，410125) 2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 3(南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙，410128)

?

超級(jí)雜交水稻種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性

劉洋2，趙燃2，黎妮1，曹艷花2，張超3，白飛榮1，

張欣1，袁隆平1，王偉平1,3*，程池2*

1(雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南雜交水稻研究中心)，湖南 長(zhǎng)沙，410125) 2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 3(南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙，410128)

通過(guò)采用構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)的非培養(yǎng)方法，對(duì)超級(jí)雜交水稻品種“深兩優(yōu)5814”及“Y兩優(yōu)900”種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)表明，“深兩優(yōu)5814”種子內(nèi)生細(xì)菌含13個(gè)OUT，第一優(yōu)勢(shì)菌屬為Pantoea，豐度為89.44%，第二優(yōu)勢(shì)菌和第三優(yōu)勢(shì)菌分別為Flavobacterium及Methylobacterium；“Y兩優(yōu)900”種子內(nèi)生細(xì)菌含13個(gè)OUT，第一優(yōu)勢(shì)菌屬為Pantoea，豐度為76.11%，第二優(yōu)勢(shì)菌和第三優(yōu)勢(shì)菌分別為Pseudomonas及Xanthomonas。由研究可見(jiàn)，泛菌屬細(xì)菌為水稻種子中的優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)，水稻種子基因型對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌的豐度及多樣性具有一定的影響。

超級(jí)雜交水稻；種子內(nèi)生細(xì)菌；非培養(yǎng)方法；群落多樣性

水稻作為我國(guó)廣泛種植的主要糧食作物，其年產(chǎn)量的保證對(duì)我國(guó)糧食安全具有重要作用。研究超級(jí)雜交水稻“深兩優(yōu)5814”及“Y兩優(yōu)900”兩品種水稻種子的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，可以為保障種子的健康活力，為種子生產(chǎn)與貯藏過(guò)程中的微生物控制與強(qiáng)化提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)促進(jìn)我國(guó)水稻種業(yè)發(fā)展具有重要的理論依據(jù)與實(shí)踐意義。

能夠定殖在健康的植物組織內(nèi)，并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物稱之為植物內(nèi)生菌[1]，它們能夠通過(guò)多種方式影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，例如通過(guò)生物防治抑制病原菌的生長(zhǎng)，通過(guò)內(nèi)生固氮等作用促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[2]。植物種子是植物的延續(xù)器官，同時(shí)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料中十分重要的一種[3]，種子也是多種有益細(xì)菌的傳遞載體，許多植物病原菌也會(huì)在種子內(nèi)部定殖。大量實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，在植物種子的表面及其內(nèi)部均有多種微生物存在，微生物群落十分豐富[4]，在種子萌發(fā)的過(guò)程中，土壤中的微生物和存在于植物內(nèi)部的細(xì)菌及真菌會(huì)起到促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[5-6]，其中不乏一些能夠與植物協(xié)同互作的微生物，它們對(duì)提高土壤肥力和土壤酶的活性有顯著作用，從而促進(jìn)植物的健康生長(zhǎng)[7]。ADAMS等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在棉花種子萌發(fā)和發(fā)育成幼苗的過(guò)程中，定殖其內(nèi)部的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯差異，這是由棉花品種不同，其在遺傳親緣關(guān)系、外部形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征方面的差異所造成的；NEAL等[10]研究基因型不同的小麥品種之間根際微生物群落結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)一條染色體出現(xiàn)變異的小麥品種與未發(fā)生變異的小麥中根際微生物多樣性不同，據(jù)此他提出了根際微生物類群的變化是由植物基因型決定的這一觀點(diǎn)。目前，關(guān)于植物基因型與之聯(lián)合的細(xì)菌的影響的相關(guān)研究尚集中于根和根際[8-13]，與種子聯(lián)合的微生物的相關(guān)研究還相對(duì)較少[14]，且其中有關(guān)超級(jí)雜交水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的研究還鮮有報(bào)道，對(duì)于不同基因型雜交水稻種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究，可為深入探討植物基因型與其內(nèi)部定殖的細(xì)菌群落之前的相關(guān)性提供理論依據(jù)和參考。因此本文以我國(guó)自主培育的超級(jí)雜交水稻品種“深兩優(yōu)5814”及“Y兩優(yōu)900”種子為研究材料，利用構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)的非培養(yǎng)方法，研究雜交水稻種子內(nèi)生細(xì)菌區(qū)系和優(yōu)勢(shì)種群信息，并揭示其種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與及其多樣性，為指導(dǎo)超級(jí)雜交水稻種子生產(chǎn)與貯藏過(guò)程中的微生物控制與強(qiáng)化，提高產(chǎn)量以及保障種子的健康與活力提出科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1水稻種子的采集

試驗(yàn)樣品為湖南雜交水稻研究中心提供的超級(jí)雜交水稻品種“深兩優(yōu)5814”和“Y兩優(yōu)900”種子，樣品于2015年5月采自國(guó)家雜交水稻工程技術(shù)研究中心海南制種試驗(yàn)基地，樣品于4 ℃保存。

1.2樣品表面滅菌

先用無(wú)菌蒸餾水清洗水稻種子，將種子晾干后，依次用70%乙醇浸泡3 min，2.5%有效Cl-的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，70%乙醇浸泡30 s，接著用無(wú)菌蒸餾水淋洗種子5～7次，在無(wú)菌條件下放于濾紙上晾干[16]；同時(shí)取120 μL最后一次的淋洗水涂布于LB固體平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，檢測(cè)水稻種子表面滅菌效果。

1.3樣品總DNA提取

采用CTAB法[15]提取水稻種子樣品基因組DNA，并將提取獲得的DNA溶于30 μL無(wú)菌雙蒸水中，-20 ℃保存。將總DNA稀釋至50 ng作為PCR模板，進(jìn)行下一步細(xì)菌16S rDNA 的PCR擴(kuò)增。

1.4樣品種子內(nèi)生細(xì)菌的PCR擴(kuò)增

以稀釋后的水稻種子總DNA為模板，上游引物799f(5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’)，下游引物1492r(5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3’)[15]。PCR反應(yīng)體系(50 μL)如下：50 ng模板DNA，1×Taqreaction buffer，dNTP 20 μmol，1.5單位Taq酶(Ferments)，引物各20 pmol。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物約為750 bp。

1.516S rDNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建

將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物點(diǎn)于瓊脂糖凝膠(2.0%膠濃度)電泳中，條帶應(yīng)位于700～800 bp之間，在紫外燈下切取條帶，并用試劑盒進(jìn)行膠回收，具體方法參照TIAN gel Midi Purification Kit(Tiangen，China)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作?；厥蘸髮⒌玫降?50 bp左右的DNA片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，具體方法參照pGEM-T Easy(Transgen，China)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.6克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)

用C值(coverage value)和aRarefactWin軟件對(duì)克隆文庫(kù)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。C值(計(jì)算公式為Cx=1-n1/N，其中N代表克隆文庫(kù)的庫(kù)容大小，n1代表在16S rDNA克隆文庫(kù)中僅出現(xiàn)過(guò)一次的OTU的個(gè)數(shù))理論上代表所構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)中所含有的微生物種類(OTU)占樣品中全部微生物種類的比例[16-17]，C值越大，克隆文庫(kù)的代表性越強(qiáng)，從而能夠反映出所構(gòu)建的克隆文庫(kù)內(nèi)樣品內(nèi)生菌的代表程度。稀釋曲線(rarefaction curve)是利用aRarefact Win軟件對(duì)克隆文庫(kù)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)的方法，用已知的各種OTU的相對(duì)比例來(lái)推算抽取n個(gè)克隆時(shí)出現(xiàn)OUT數(shù)量的期望值，繼而根據(jù)一組n值與其相對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)量的期望值所作出的曲線，當(dāng)曲線達(dá)到平臺(tái)期或趨于平緩時(shí)則可以認(rèn)為庫(kù)容已經(jīng)足夠。

1.7測(cè)序及相關(guān)分析

隨機(jī)挑取160個(gè)克隆，并采用ABI 3730型DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序(ABI，USA)。將測(cè)序結(jié)果在EzTaxon server 2.1數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)[18]，收索與其同源性較高的近緣物種16S rDNA序列，并確定此序列與已知序列的同源關(guān)系，經(jīng)比對(duì)序列相似性達(dá)到98.65% 以上的歸為同一個(gè)OTU。

2　結(jié)果與分析

2.1種子內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA 的擴(kuò)增及其序列測(cè)定

用CTAB法提取樣品的總DNA，包括種子和內(nèi)生細(xì)菌的基因組DNA，為了從DNA模板中擴(kuò)增得到特異的內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA，采用799f和1492r這一對(duì)引物[15]，電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物為2條帶，一條在1 000～1 500 bp，條帶較暗，為水稻線粒體18S rDNA；在700～800 bp檢測(cè)出較亮的條帶，是包含有水稻種子內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的目的條帶，將該片段經(jīng)回收純化后，用于構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)。每個(gè)文庫(kù)隨機(jī)挑取200個(gè)克隆進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，經(jīng)PCR驗(yàn)證后，除去假陽(yáng)性菌株并進(jìn)行序列測(cè)定，之后將得到的序列信息提交到GenBank，登錄號(hào)為KT012520-KT012548。

2.2克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)

“深兩優(yōu)5814”與“Y兩優(yōu)900”種子內(nèi)生細(xì)菌的OUT數(shù)目均為13，這兩個(gè)文庫(kù)的C值分別為96.67%及98.33%。16S rDNA克隆文庫(kù)的稀釋曲線見(jiàn)圖1。C值和稀釋曲線均表明構(gòu)建的兩個(gè)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫(kù)的庫(kù)容已經(jīng)足夠，即該克隆文庫(kù)已經(jīng)可以基本代表“深兩優(yōu)5814”與“Y兩優(yōu)900”種子內(nèi)生細(xì)菌群落的微生物多樣性。

2.3種子內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

“深兩優(yōu)5814”種子內(nèi)生細(xì)菌群落分屬Proteobacteria類群(179 clone，99.44%)及Actinobacteria(1 clone，0.56%)，其中Proteobacteria包含13個(gè)OUT，Actinobacteria包含1個(gè)OUT。該群落優(yōu)勢(shì)屬(豐度)為Pantoea(89.44%)、Flavobacterium(3.30%)及Methylobacterium(3.30%)(表1、表3)。水稻“Y兩優(yōu)900”種子內(nèi)生細(xì)菌群落分屬Proteobacteria類群(179 clone，99.44%)及Actinobacteria(1 clone，0.56%)，其中Proteobacteria包含13個(gè)OUT，Actinobacteria包含1個(gè)OUT。該群落優(yōu)勢(shì)屬(豐度)為Pantoea(76.11%)、Pseudomonas(7.22%)及Xanthomonas(6.11%)(表2、表3)。

“深兩優(yōu)5814”與“Y兩優(yōu)900”種子內(nèi)生第一優(yōu)勢(shì)菌屬相同，均為Pantoea，且豐度相當(dāng)(89.44%、76.11%)，優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象十分明顯；且兩品種種子內(nèi)生細(xì)菌所含OUT數(shù)目相同，均為14個(gè)OUT。同時(shí)，“深兩優(yōu)5814”與“Y兩優(yōu)900”種子內(nèi)生細(xì)菌也存在明顯的群落差異，5814種子第二優(yōu)勢(shì)菌和第三優(yōu)勢(shì)菌分別為Flavobacterium及Methylobacterium， 而900種子第二優(yōu)勢(shì)菌和第三優(yōu)勢(shì)菌分別為Pseudomonas及Xanthomonas，呈現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性。

圖1　雜交水稻種子內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)的稀釋曲線Fig.1　Rarefaction curve of the endophytic bacterial 16S rDNA clone library of rice seed

類群OUT數(shù)目屬代表菌株克隆數(shù)目克隆百分比/%NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相似度最高的菌種相似度/%登錄號(hào)proteobacteria14PantoeaF9414981.87PantoeaagglomeransDSM3439(AJ233423)99.72KT012535F8842.20PantoeabrenneriLMG5343(AJ233423)99.59KT012537F2631.65PantoeaconspicuaLMG24534(EU216737)100KT012539F7231.65Pantoeastewartiisubsp.stewartiiLMG2715(Z96080)99.59KT012540F310.56PantoeaananatisLMG2665(JMJJ01000010)99.59KT012544F8110.56PantoeadeleyiLMG24200(EF688011)100KT012548FlavobacteriumF9763.30FlavobacteriumacidificumLMG8364(JX986956)99.72KT012536MethylobacteriumF3852.75MethylobacteriumfujisawaenseDSM5686(AB175634)99.72KT012538F910.56MethylobacteriumtarhaniaeN4211(JQ864432)98.07KT012543StenotrophomonasF13621.10StenotrophomonasmaltophiliaMTCC434(JALV0100003)99.59KT012541XanthomonasF13021.10XanthomonassacchariLMG471(Y10766)99.73KT012542PseudomonasF3910.56PseudomonashibiscicolaATCC19867(AB021405)99.86KT012545AureimonasF8410.56Aureimonasureilytica5715S-12(DQ883810)98.98KT012547Actinobacteria1MicrobacteriumF11510.56MicrobacteriumfoliorumDSM12966(AJ249780)99.86KT012546

3　討論

植物種子是植物的延續(xù)器官，同時(shí)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料中十分重要的一種[3]，種子是多種有益細(xì)菌的傳遞載體，許多植物病原菌也會(huì)在種子內(nèi)部定殖，在種子表面及其內(nèi)部均蘊(yùn)藏著豐富的微生物群落資源[4]。目前對(duì)根際微生物已有較廣泛及較深入的研究，但與種子相關(guān)微生物還處于初步研究階段[14]，而有關(guān)雜交水稻種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究還鮮有報(bào)道。本研究以我國(guó)新培育的超級(jí)雜交水稻品種“深兩優(yōu)5814”及“Y兩優(yōu)900”種子為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)的非培養(yǎng)方法，對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究，旨在探究具有遺傳相關(guān)性的不同雜交水稻品種對(duì)其種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

表2　“Y兩優(yōu)900”內(nèi)生細(xì)菌多樣性統(tǒng)計(jì)

表3　超級(jí)雜交水稻種子內(nèi)生優(yōu)勢(shì)菌屬及其豐度分析匯總

雜交水稻品種“深兩優(yōu)5814”及“Y兩優(yōu)900”在遺傳上具有相關(guān)性，二者具有共同的母本和不同的父本，屬同母異父。本研究發(fā)現(xiàn)，兩品種種子內(nèi)生細(xì)菌的第一優(yōu)勢(shì)菌種類相同，均為泛菌屬細(xì)菌，它們?cè)诳寺∥膸?kù)中所占比例也保持一致，這與水稻種子的兩個(gè)品種在遺傳親緣關(guān)系上較近有密不可分的關(guān)系，成團(tuán)泛菌的優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象十分明顯說(shuō)明該菌是水稻種子中的優(yōu)勢(shì)菌群，水稻種子中有著適宜成團(tuán)泛菌生長(zhǎng)的環(huán)境條件；同時(shí)，二者內(nèi)生細(xì)菌的第二優(yōu)勢(shì)菌及第三優(yōu)勢(shì)菌均不相同，兩品種雜交水稻的父本不同，在基因型上會(huì)顯現(xiàn)出一定的差異，這直接導(dǎo)致了它們?cè)趦?nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上有所不同。研究表明不同基因型的植物在內(nèi)生細(xì)菌群落方面具有顯著的差異性。Adams和Kloepper對(duì)不同棉花(Gossypiumspp.)栽培品種內(nèi)生菌的研究發(fā)現(xiàn)，在棉花種子萌發(fā)和發(fā)育成幼苗的過(guò)程中，定殖其內(nèi)部的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯差異，這是由棉花品種不同，其在遺傳親緣關(guān)系、外部形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征方面的差異所造成的[8]。Picard和Bosco也發(fā)現(xiàn)，玉米雜交子代與其親本相比，在其能夠吸引更多種類的假單胞菌微生物，這與子代玉米能夠表達(dá)更豐富的多種蛋白質(zhì)有關(guān)[19]。

從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也可以看出，成團(tuán)泛菌屬在兩品種水稻種子內(nèi)生菌克隆文庫(kù)中出現(xiàn)的豐度均較高，達(dá)到了80%以上，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人對(duì)不同雜交組合的水稻種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究結(jié)果相一致[20]，這也可以說(shuō)明泛菌屬細(xì)菌能夠廣泛在水稻植物中定植。泛菌屬細(xì)菌屬于腸桿菌科，革蘭氏陰性菌，周生鞭毛，在自然界中分布廣泛，從土壤、水中、植物表面、種子內(nèi)部及動(dòng)物和人的血液、尿液中均能分離得到，多數(shù)為與植物相聯(lián)合的細(xì)菌，有的泛菌對(duì)植物能夠起到促生作用，有的則對(duì)人及植物具有一定的致病性[21]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，“深兩優(yōu)5814”及“Y兩優(yōu)900”兩品種雜交水稻中第一優(yōu)勢(shì)菌均為成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)，相似度達(dá)到了99.72%，且豐度很高，占整個(gè)克隆文庫(kù)的80%左右。Yang等人曾在水稻“越富”的生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)其內(nèi)生菌多樣性進(jìn)行跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)菌為成團(tuán)泛菌[22]，同時(shí)證明從其中分離得到的成團(tuán)泛菌YS19能聚集形成稱為“symplasmata”的結(jié)構(gòu)[23]；除此之外，也有研究表明成團(tuán)泛菌可以通過(guò)其他途徑對(duì)植物生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，例如具有固氮作用，能夠分泌iP、ZR、HDZR等細(xì)胞分裂素和IAA、ABA、GA4等其它激素類物質(zhì)；在水稻籽粒乳熟期前噴施YS19成團(tuán)泛菌能夠調(diào)控并促進(jìn)水稻光合作用的產(chǎn)物在源、庫(kù)中的分配[24]。

本研究利用非培養(yǎng)方法對(duì)超級(jí)雜交水稻“深兩優(yōu)5814”及“Y兩優(yōu)900”兩品種種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究，對(duì)于進(jìn)一步研究植物內(nèi)生細(xì)菌與其基因型相關(guān)性機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究對(duì)深入挖掘植物與其共生的內(nèi)生細(xì)菌之間的互作關(guān)系提供了參考依據(jù)。從雜交水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的角度為切入點(diǎn)，對(duì)促進(jìn)我國(guó)種業(yè)發(fā)展具有重要的理論與實(shí)踐意義，但還需要不斷對(duì)更多的雜交水稻品種及其親本進(jìn)行更全面的研究。

4　結(jié)論

本文對(duì)超級(jí)雜交水稻“深兩優(yōu)5814”及“Y兩優(yōu)900”兩品種種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，作為同母異父的兩品種種子，二者內(nèi)生細(xì)菌的第一優(yōu)勢(shì)菌種類相同，均為泛菌屬細(xì)菌，它們?cè)诳寺∥膸?kù)中所占比例也保持一致，這與水稻種子的兩個(gè)品種在遺傳親緣關(guān)系上較近有密不可分的關(guān)系；成團(tuán)泛菌的優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象十分明顯，說(shuō)明該菌是水稻種子中的優(yōu)勢(shì)菌群，水稻種子中有著適宜成團(tuán)泛菌生長(zhǎng)的環(huán)境條件；同時(shí)，二者內(nèi)生細(xì)菌的第二優(yōu)勢(shì)菌及第三優(yōu)勢(shì)菌均不相同，兩品種雜交水稻在基因型上顯現(xiàn)出的差異直接導(dǎo)致了它們?cè)趦?nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上的不同。由本研究可見(jiàn)，泛菌屬細(xì)菌為水稻種子中的優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)，水稻種子基因型對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌的豐度及多樣性具有一定的影響。

[1]KLOEPPER J W,BEAUCHAMP C J.A review of issues related to measuring colonization of plant roots by bacteria[J].Canadian Journal of Microbiology,1992,38(12):1 219-1 232.

[2]馮永君,宋未.植物內(nèi)生細(xì)菌[J].自然雜志,2001,23(5):249-252.

[3]管康林.種子生理生態(tài)學(xué)[M].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2009:1-7.

[4]NELSON E B.Microbial dynamics and interactions in the spermosphere[J].Annual Review of Phytopathology,2004, 42: 271-309.

[5]BACILIO-JIMéNE M,AGUILAR-FLORES S,del Valle M V,et al.Endophytic bacteria in rice seeds inhibit early colonization of roots byAzospirillumbrasilense[J].Soil Biology and Biochemistry,2001,33(2):167-172.

[6]COTTYN B,REGALADO E,LANOOT B,et al.Bacterial populations associated with rice seed in the tropical environment[J]. Phytopathology,2001,91(3):282-292.

[7]BAREA J M, POZO M J, AZCON R,et al. Microbial co-operation in the rhizosphere[J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(417): 1 761-1 778.

[8]ADAMS P D,KLOEPPER J W.Effect of host genotype on indigenous bacterial endophytes of cotton (GossypiumhirsutumL.)[J].Plant and Soil,2002,240(1):181-189.

[9]SIMON H M,SMITH K P,DODSWORTH J A,et al.Influence of tomato genotype on growth of inoculated and indigenous bacteria in the spermosphere[J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(2):514-520.

[10]NEAL J L,LARSON R I,ATKINSON T G.Changes in rhizosphere populations of selected physiological groups of bacteria related to substitution of specific pairs of chromosomes in spring wheat[J].Plant and Soil,1973,39(1):209-212.

[11]MICHIELS K,VANDERLEYDEN J,VAN Gool A. Azospirillum-plant root associations:a review[J]. Biology and Fertility Soils,1989,8(4):356-368.

[12]MAVINGUI P,LAGUERRE G,BERGE O,et al.Genetic and phenotypic diversity ofBacilluspolymyxain soil and in the wheat rhizosphere[J].Applied and Environmental Microbiology, 1992,58(6):1 894-1 903.

[13]SONG W,YANG H L,SUN X L,et al.The rice endophytic diazotroph and PGPR//Malik K A, Mirza M S,Ladha J K.Nitrogen Fixation with Non-Legumes[M].Kluwer Dordrecht: Academic Publishers,1998:41-48.

[14]CANKAR K, KRAIGHER H, RAVNIKAR M,et al. Bcterial endophytes from seeds of Norway spruce (PiceaabiesL. Karst) [J].FEMS Microbiology Letters, 2005, 244: 341-345.

[15]SUN L,QIU F B,Zhang X X,et al.Endophytic bacterial diversity in rice (OryzasativaL.) roots estimated by 16S rDNA sequence analysis[J].Microbiology Ecology,2008,55(3): 415-424.

[16]GOOD I J.The population frequencies of species and the estimation of population parameters[J].Biometrika,1953,40(3/4):237-264.

[17]MULLINS T D,BRITSCHGI T B,KREST R L,et al.Genetic comparisons reveal the same unknown bacterial lineages in atlantic and pacific bacterioplankton communities[J].Limnology and Oceanography,1995,40(1):148-158.

[18]CHUN J,LEE J H,JUNG Y,et al.EzTaxon: a web-based tool for the identication of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2007, 57:2 259-2 261.

[19]PICARD C,BOSCO M.Heterozygosis drives maize hybrids to select elite 2,4-diacethylphloroglucinol-producingPseudomonasstrains among resident soil populations[J].FEMS Microbiology Ecology,2006,58:193-204.

[20]鄒媛媛,劉琳,劉洋,等.不同水稻品種種子固有細(xì)菌群落的多樣性[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2012, 36(8):880-890.

[21]VIDEIRA S S,de ARAUJO J L S,RODRIGUES Lda S,et al.Occurrence and diversity of nitrogen- fixingSphingomonasbacteria associated with rice plants grown in Brazil[J].FEMS Microbiology Letters,2009,293:11-19.

[22]YANG H L,SUN X L,SONG W,et al.Screening, identification and distribution of endophytic associative diazotrophs isolated from rice plants[J].Acta Botanica Sinica,1999,41:927-931.

[23]FENG Y J,SHEN D L,DONG X Z,et al.Invitrosymplasmata formation in the rice diazotrophic endophytePantoeaagglomeransYS19[J]. Plant and Soil,2003,255:435-444.

[24]沈德龍,馮永君,宋未.內(nèi)生成團(tuán)泛菌YS19對(duì)水稻乳熟期光合產(chǎn)物在旗葉、穗分配中的影響[J].自然科學(xué)進(jìn)展,2002,12:863-865.

Diversity of endophytic bacterial communities in seeds of super hybrid rice (OryzasativaL.)

LIU Yang2,ZHAO Ran2,LI Ni1,CAO Yan-hua2,ZHANG Chao3,BAI Fei-rong2,ZHANG Xin2,YUAN Long-ping1,WANG Wei-ping1,3*,CHENG Chi2*

1(National Key Laboratory of Hybrid Rice (Hunan Hybrid Rice Research Center),Changsha 410125,China) 2(China Center of Industrial Culture Collection, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China) 3(Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128,China)

The community diversities of endophytic bacteria in seeds of two types of super hybrid rice (“Shenliangyou 5814” and “Y Liangyou 900”) were studied through culture-independent method of the 16S rDNA clone library technique. Experimental result showed that the endophytic bacterial communities in “5814” included 13 OTUs, and the abundance of the first dominant bacteriumPantoeawas 89.44%, the second and third dominant bacterium wasFlavobacteriuandMethylobacterium. The endophytic bacterial communities in “900” included 13 OTUs, and the abundance of the first dominant bacteriumPantoeawas 76.11%, the second and third dominant bacterium wasPseudomonasandXanthomonas. From this study, we found thatPantoeawas the dominant genera in hybrid rice seeds, and the endophytic bacterial community structure had certain relevance to the seeds of hybrid rice which had been genetically related.

super hybrid rice; seed endophytic bacteria; bacterial diversity; culture-independent method

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601006

博士，高級(jí)工程師(王偉平，程池教授級(jí)高級(jí)工程師為通訊作者，E-mail: wangweiping01@126.com；cheng100027@163.com)。

雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題基金(2014KF06)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)-強(qiáng)優(yōu)勢(shì)水稻雜交種的創(chuàng)制與應(yīng)用(2011AA10A101)；北京市科技新星計(jì)劃項(xiàng)目(Z141105001814095)

2015-09-11，改回日期：2015-10-08