李浩川，陳 瓊，楊繼偉，曲彥志，張 慧，張朝林，李 彥，賈 璽，劉宗華

(1.河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州 450002；2.靈寶市農(nóng)業(yè)局，河南 靈寶 472500)

基于雙單倍體群體的玉米株高和穗位高QTL分析

李浩川1，陳 瓊1，楊繼偉1，曲彥志1，張 慧1，張朝林1，李 彥1，賈 璽2，劉宗華1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州 450002；2.靈寶市農(nóng)業(yè)局，河南 靈寶 472500)

為了進一步探明玉米株高和穗位高的遺傳基礎(chǔ)，利用鄭單958為基礎(chǔ)材料構(gòu)建的包含161個雙單倍體(Doubled haploid, DH)的群體，分別在長葛、淇縣進行田間試驗，采用復(fù)合區(qū)間作圖法對植株性狀進行數(shù)量性狀位點(Quantitative trait locus, QTL)分析。分別檢測到7，11和6個株高、穗位高以及穗位系數(shù)(穗位高/株高)QTLs，貢獻率變幅分別為6.77%～21.31%，5.09%～17.12%和6.89%～17.78%，其中qph-3-3, qph-2-10, qeh-5-9以及qeh/qph-3-1為主效QTLs；株高和穗位高有4對共同標記區(qū)間的QTLs，穗位系數(shù)與穗位高有3對共同標記區(qū)間的QTLs，一定程度上揭示了株高和穗位高的遺傳相關(guān)性；株高和穗位高的廣義遺傳力高達88.52%和93.78%，表明株高和穗位高遺傳穩(wěn)定性強，受環(huán)境影響較小，是早代選擇的重要株型指標。

玉米；雙單倍體；株高；穗位高；數(shù)量性狀位點

倒伏是制約玉米產(chǎn)量的重要因素之一，全球每年因倒伏使玉米產(chǎn)量損失5%～20%[1]。黃淮海夏玉米區(qū)在抽雄前后易受季風氣候影響，因風災(zāi)導(dǎo)致產(chǎn)量損失嚴重[2]。近年來，隨著機收面積的擴大和機械化程度的提高，對玉米品種抗倒伏性要求越來越高。國內(nèi)外許多學者先后開展了玉米倒伏問題的相關(guān)研究。ALBRECHT等[3]研究認為，莖稈抗倒伏能力隨著莖稈變粗、莖皮加厚而提高，隨著節(jié)間延長、植株增高而下降；莖粗對植株的抗倒伏能力影響最大，基部節(jié)間短而粗的則抗倒伏能力強。王永學等[4]利用相關(guān)和通徑分析研究表明，倒伏率與莖稈強度、莖粗呈負相關(guān)，與株高、穗位高、節(jié)間長、葉夾角呈正相關(guān)，入土的次生根數(shù)對倒伏率影響最大。付志遠等[5]的研究結(jié)果表明,增加穗上節(jié)間數(shù)、適當降低穗位高，可以提高玉米植株的抗倒伏性，認為穗位系數(shù)即穗位高與株高的比值可以作為衡量植株抗倒伏性狀的一個重要指標。大量研究表明，倒伏性與種植的密度、莖稈拉力、莖稈抗穿刺力、莖粗、株高、穗位高等都具有極顯著相關(guān)性[6-9]，尤其株高和穗位高通常被認為是影響抗倒伏性的最重要的因素。盡管RADU等[8]利用雙列雜交試驗對玉米抗倒伏性狀進行遺傳分析，認為抗倒伏遺傳變異占表型變異的79%，但在表型變異中，加性效應(yīng)僅占1.6%，上位效應(yīng)占55%。然而，株高和穗位高是典型數(shù)量性狀，有關(guān)其分子遺傳機制迄今仍不十分清楚。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，眾多學者分別利用不同分離群體，檢測到許多有關(guān)玉米株高和穗位高的QTL[9-11]。如李清超等[9]利用11個RIL群體，基于單環(huán)境、聯(lián)合環(huán)境的QTL分析，檢測到21個株高主效QTL和15個穗位高主效QTL；鄭克志等[10]對利用T 319與9406為親本構(gòu)建的242個RIL群體進行分析，檢測到6個株高QTL和2個穗位高QTL。然而，這些研究由于各自所用材料和群體不同，結(jié)果不盡一致。雙單倍體(Doubled haploid, DH)系的應(yīng)用不僅能加速育種進程，縮短育種周期，而且DH系不存在基因的顯性效應(yīng)，可對數(shù)量性狀基因的加性和上位性效應(yīng)進行更加準確的研究，同時DH系可以在多個環(huán)境或季節(jié)進行重復(fù)試驗，是研究基因型與環(huán)境互作的理想材料。為了進一步明確株高、穗位高的分子機制，本研究以DH群體為研究材料，結(jié)合簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeat, SSR)分子標記技術(shù)對玉米株高、穗位高以及穗位高/株高進行QTL分析，以期為抗倒伏品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

本研究以優(yōu)良玉米雜交種鄭單958為母本，以農(nóng)大高誘5號為父本，進行雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，通過化學加倍和繁殖形成了161個DH系，以DH系構(gòu)成的群體及親本自交系鄭58和昌7-2為試驗材料。2014年夏在長葛和淇縣種植，田間采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，單行區(qū)，2次重復(fù)，小區(qū)行長4 m，行距0.65 m，株距0.22 m，種植密度為67 500株·hm-2。前茬為小麥，土壤肥力均勻，田間管理同大田。

1.2DNA的提取和SSR標記的分析

親本及DH群體的DNA提取采用吳向遠等[13]改良的SLS方法。SSR引物選自Maize GDB數(shù)據(jù)庫，由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系：每11 μL的體系中含ddH2O 6 μL,10×buffer 1.5 μL,dNTP 0.3 μL，Tap酶0.2 μL，引物2 μL，DNA 1 μL。

利用SSR標記構(gòu)建連鎖圖譜，從823個標記中篩選出親本間帶型差異明顯的107個多態(tài)性標記，覆蓋玉米基因組全長的2 497 cM，標記間平均距離23 cM。運用Mapmaker/QTL 1.2軟件對株高、穗位以及穗位系數(shù)(穗位高/株高)進行QTLs定位分析，判斷QTL存在的閾值LOD≥2.5，QTL命名參照McCOUCH等[14]1997年提出的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1鄭單958的親本及其DH系群體的株高和穗位高變異分析

從表1看出，父本自交系昌7-2的株高和穗位高明顯高于母本自交系鄭58，其雜交種鄭單958的株高和穗位高表現(xiàn)明顯的超親優(yōu)勢；DH群體中各家系的株高和穗位高變異廣泛，但均值仍然偏高親或超高親。從DH群體的峰度和偏度來看，除株高的峰度值大于1外，其偏度和穗位高的峰度和偏度絕對值均小于1，表明該群體趨于正態(tài)分布。

表1 鄭單958 DH群體及親本的株高和穗位高變異分析 Table 1 Varation of plant height and ear height performance for parents and their DH population from Zhengdan 958 cm

2.2鄭單958DH群體株高與穗位高的相關(guān)性及其方差分析

相關(guān)分析表明，來自于鄭單958 DH群體的株高與穗位高在長葛和淇縣均達到了極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.81和0.79。

聯(lián)合方差分析結(jié)果(表2)表明， 試點和DH家系各自之間在株高、穗位高方面均存在極顯著差異，但試點與DH家系互作差異不顯著，表明各家系之間遺傳變異豐富，但家系與地點效應(yīng)獨立。株高和穗位高的廣義遺傳力分別高達88.52%和93.78%，表明株高和穗位高遺傳穩(wěn)定性性強，受環(huán)境影響較小。

表2 鄭單958 DH群體的株高和穗位高方差分析Table 2 Variance analysis of plant height and ear height for the DH population from Zhengdan 958

注：*，** 分別代表差異達0.05和0.01顯著水平。

Note:*，** indicates significance at 0.05 and 0.01 level，respectively.

2.3鄭單958DH群體株高和穗位高的QTL分析

2.3.1 鄭單958 DH群體株高的QTL分析 從表3看出，長葛和淇縣分別定位到2個和7個株高QTL，分別位于第1，2，3，5，7和8染色體上(圖1)，其中位于第1染色體上的qph-1-3和位于第2染色體上的qph-2-10在長葛和淇縣均被檢測到，2點共檢測到7個株高QTL，這些QTL貢獻率變幅為6.77%～21.31%，大于10%的有3個，其中qph-3-3的貢獻率最高為21.31%。值得注意的是，由于qph-2-10是2個地點同時被檢測到且貢獻率均大于15%的QTL，據(jù)此推斷該QTL可能是控制株高的主效QTL。在檢測到的7個株高QTL中，除第3染色體上的qph-3-3以及第7染色體上的qph-7-10效應(yīng)來自父本昌7-2之外，其他5個株高QTL效應(yīng)均來自母本鄭58。結(jié)合QTL的貢獻率，不難看出，增加淇縣點株高基因位點主要來自昌7-2的qph-3-3。

2.3.2 鄭單958 DH群體穗位高的QTL分析 在長葛和淇縣分別檢測到5個和7個與穗位高QTL，分別位于第1，2，3，4，5和8染色體上，只有qeh-1-3是兩地同時被檢測到的唯一共同的QTL。盡管方差分析結(jié)果(表2)顯示地點與家系之間互為不顯著，但該QTL在兩地的貢獻率相差較大，分別為12.45%和7.54%，表明該QTL的表達受環(huán)境條件影響仍較大，存在明顯的基因型與環(huán)境的互作效應(yīng)；2個地點共檢測到11個穗位高QTL，貢獻率變幅為5.09%～17.12%，qeh-5-9位點的貢獻率最高為17.12%。

2.3.3 鄭單958 DH群體穗位系數(shù)的QTL分析 穗位系數(shù)是反映株型協(xié)調(diào)與否以及抗倒伏性的重要指標之一。本研究中長葛和淇縣兩點分別檢測到3個和4個與穗位系數(shù)有關(guān)的QTL，分別位于第2，3和8染色體上， qeh/qph-3-1是兩地同時被檢測到的唯一共同的QTL，該QTL在兩地的貢獻率分別為14.67%和17.78%，是控制穗位系數(shù)的主效QTL。兩地共檢測到6個穗位系數(shù)QTL，貢獻率變幅為6.89%～17.78%，這6個QTL均由來自母本鄭58的基因起作用。值得注意的是，6個穗位系數(shù)QTL中的4個位于第2染色體上，其累加貢獻率達38.25%，表明第2染色體上富集的相關(guān)QTL對決定株型具有重要作用。同時看出，位于第2染色體上與穗位系數(shù)有關(guān)qeh/qph-2-8，qeh/qph-2-15以及第3染色體上的qeh/qph-3-1分別與穗位高對應(yīng)QTL相一致，而位于第2染色體上的qeh/qph-2-7和qeh/qph-2-14以及第8染色體上的qeh/qph-8-1又分別是長葛、淇縣新檢測到的特異表達的QTL。顯然，控制穗位高和穗位系數(shù)的QTL不盡一致，其性狀表現(xiàn)既有內(nèi)在聯(lián)系，又有個別性差異。

表3 鄭單958 DH群體植株性狀的QTL定位Table 3 Identification of QTLs for plant traits in DH population from Zhengdan 958

注：PVE/%為可解釋的表型變異；a表示2個地點都被檢測到的QTL。

Note: PVE/% means explainable phenotypic variation;a represents QTL detected in two locations.

3 結(jié)論與討論

3.1有關(guān)玉米株高和穗位高QTL的一致性

目前，隨著玉米機收面積的擴大和機收水平的提高，對玉米品種抗倒伏能力的要求越來越高， 大量研究表明，株高和穗位高與子粒產(chǎn)量呈正相關(guān)[14-16]。本研究的結(jié)果也顯示，株高、穗位高表現(xiàn)出明顯的正向雜種優(yōu)勢。然而，植株過高勢必增加倒伏的風險，因此，深入分析株高、穗位高的遺傳基礎(chǔ)，協(xié)調(diào)好株高、穗位高與抗倒伏特性以及單株優(yōu)勢與群體產(chǎn)量之間的關(guān)系，是選育適應(yīng)機收新品種中必須值得關(guān)注的重要課題。 國內(nèi)外很多學者對株高和穗位高已有大量研究報道，并定位了許多相關(guān)的QTL，但不同學者因所用的群體和標記的密度不同，結(jié)果不盡一致。MILENA等[16]利用熱帶種質(zhì)組配的F2∶3群體分別檢測出6個株高和9個穗位高QTL；鄭克志等[10]利用玉米自交系T 319與9406構(gòu)建的RIL群體，檢測到6個株高QTL，分布在第1，2，3，5，7，10染色體上，檢測到2個穗位高的主效QTL，位于第1和第10染色體上。本研究利用鄭單958誘導(dǎo)產(chǎn)生的DH群體，在第1，2，3，4，5，7，8染色體上共檢測到7個株高和11個穗位高QTL，在株高QTL中貢獻率最高的是位于bin 3.05-3.06的qph-3-3，貢獻率高達21.31%，是淇縣點特異表達的主效QTL，與MILENA等[16]、李清超等[9]、鄭克志等[10]在bin 3.05-3.06發(fā)現(xiàn)的株高主效QTL一致或基本接近；位于bin 2.07的qph-2-10是長葛、淇縣同時被檢測到的QTL，貢獻率分別達15.74%和17.55%，推測是一個控制株高的另一個主效QTL，與鄭克志等[10]的結(jié)果基本一致。證明這些主效QTL是真實存在的。

圖1 長葛和淇縣檢測到的玉米鄭單958 DH群體QTL在染色體上的位置Fig.1 Position of QTLs for plant height and ear height detected in Qixian and Changge

本研究發(fā)現(xiàn),控制玉米穗位高QTL的主效位點為bin 1.02處的qeh-1-3，bin 2.07的qeh-2-10和bin 4.07-4.08的qeh-4-8，與李清超等[9]研究發(fā)現(xiàn)的bin 1.01-1.02處富集穗位高QTL,在bin 1.02發(fā)現(xiàn)的穗位高QTL高度一致。同時,也檢測到一些前人沒有檢測到位點，可作進一步發(fā)掘新的相關(guān)QTL的參考依據(jù)。

本研究檢測到的株高和穗位高QTL中有4對即qph1-3與qeh1-3，qph2-10與qeh2-10，qph5-8與qeh5-8以及qph8-4與qeh8-4依次分別位于相同標記區(qū)間bnlg1429-bnlg1007，umc1637-umc1560，bnlg118-bnlg1118和umc1384-umc1069，尤其前兩對QTL是兩地同時被檢測到的共同QTL，貢獻率也比較高。如果這些成對被檢測到的QTL是分別位于第1，2，5和第8染色體上的一因多效或連鎖基因，則可一定程度上揭示株高和穗位高存在相關(guān)性的遺傳原因，因而可進一步通過精細定位加以驗證，為基因的克隆和聚合育種奠定基礎(chǔ)。

3.2DH系群體的分離與表現(xiàn)

本研究中,利用的DH系是通過孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)加倍后產(chǎn)生的，利用生物誘導(dǎo)孤雌生殖所產(chǎn)生的單倍體及其DH系的分離情況已有報道，如CHANG[17]和LASHEMES等[18]研究表明，由孤雌生殖誘導(dǎo)系途徑產(chǎn)生的DH群體中，等位基因的分離均符合1∶1的遺傳分離比例。文科等[19]利用孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)高抗青枯病的1145和高感青枯病的Y 331的F1代而產(chǎn)生的單倍體進行分離的分析，通過卡方測驗孤雌生殖單倍體的雙親的配子的比例數(shù)符合孟德爾1∶1的隨機分離比例。對來源于雜交種1145×Y 331的92個DH和130個重組自交系群體(Recombination inbred lines, RIL)的株高、穗位等農(nóng)藝性狀比較分析表明，所有性狀的平均值t測驗結(jié)果表明二者差異不顯著，2個群體主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)基本一致，DH群體表現(xiàn)出系內(nèi)整齊性更高；可能的原因是由于該單倍體是利用玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)產(chǎn)生的，誘導(dǎo)系的作用并不影響F1代配子的重組交換及獨立分離，只是促使單倍性胚的產(chǎn)生。此外，DH群體創(chuàng)建只需一年兩代即可，大大縮減了構(gòu)建穩(wěn)定作圖群體的時間，創(chuàng)建的DH群體可穩(wěn)定繁殖，與早代的F2，F(xiàn)2:3等分離群體相比可消除單株間競爭的影響，減小環(huán)境的試驗誤差。

[1] FLINTGARCIA S A, JAMPATONG C, DARRAH L L, et al. Quantitative trait locus analysis of stalk strength in four maize populations[J]. Crop Science, 2003, 43:13-22.

[2] 李樹巖, 王宇翔, 胡程達, 等. 抽雄期前后大風倒伏對夏玉米生長及產(chǎn)量的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學報，2015, 26(8):2405-2413.

[3] ALBRECHT K A, MARTIN M J , RUSSEL W A，et al. Chemical and in vitro digestible dry matter composition of maize stalks after selection for stalk strength and stalk-rot resistance[J]. Crop Science, 1986，26:1051- 1055.

[4] 王永學，張戰(zhàn)輝，劉宗華. 玉米抗到伏性狀的配合力效應(yīng)及通徑分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報，2011, 45(1):1-6.

[5] 付志遠，邵可可，丁冬，等. 穗上節(jié)間數(shù)與玉米抗倒伏能力的相關(guān)性分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報，2011，45(2):149-154.

[6] 豐光，劉志芳，李妍妍，等. 玉米莖稈耐穿刺強度的倒伏遺傳研究[J]. 作物學報，2009, 35(11): 2133-2138.

[7] 勾玲，黃建軍，孫銳，等. 玉米不同耐密植品種莖稈穿刺強度的變化特征[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2010, 26(11):156-162.

[8] RADU A, PARASCHIVU U. Use of genetic estimates in breeding maize for resistance to stem breakage[J]. Lucrari Stiintifice(Romania),1944,7:70-80.

[9] 李清超，李永祥，楊釗釗，等. 基于多重相關(guān)RIL群體的玉米株高和穗位高QTL定位[J]. 作物學報，2013, 39(9):1521-1529.

[10] 鄭克志，李元，瞿會，等. 玉米株高和穗位高的QTL 定位[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43(5):61-63．

[11] 鄭德波，楊小紅，李建生，等. 基于SNP標記的玉米株高及穗位高QTL定位[J]. 作物學報，2013, 39(3):549-556.

[12] KNAPP S J, STROUP W W, ROSS W M. Exact confidence intervals for heritability on a progeny mean basis[J].Crop Sci,1985, 25:1305-1320.

[13] 吳向遠, 丁冬, 宋桂良，等. 玉米基因組DNA快速提取方法[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報，2012，46(1):7-10.

[14] MCCOUCH S R, CHO Y G, YANO M, et al. Report on QTL nomenclature[J]. Rice Genet Newslett, 1997, 14:11-13.

[15] 楊偉光，蘇穎，張建華，等．玉米株高和穗位遺傳模型測驗[J]．吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2000,22(4)：28-13；44．

[16] MILENA L, SOUZA C, BENTO D, et al. Mapping QTL for grain yield and plant traits in a tropical maize population[J]. Mol Breed, 2006, 17:227-239.

[17] CHANG M. Stock 6 induce double haploidy is random[J]. Maize Genet, 1992, 67: 98-99.

[18] LASHERMES P， BECKERT M. Genetic control of maternal haploid in maize(ZeamaysL.)selection of haploid inducing lines[J]. Theor Appl Genet，1988, 76: 405-410.

[19] 文科，黎亮，劉玉強，等. 高效生物誘導(dǎo)玉米單倍體機器加倍方法研究初探[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報，2006，11(5):17-20.

(責任編輯：常思敏)

QTLanalysisofplantandearheightbyusingDHpopulationinmaize

LI Haochuan1, CHEN Qiong1, YANG Jiwei1, QU Yanzhi1, ZHANG Hui1, ZHANG Chaolin1, LI Yan1, JIA Xi2,LIU Zonghua1

(1.College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Agricultural Bureau of Lingbao City,Lingbao 472500, China)

corn; doubled haploid; plant height; ear height; quantitative trait locus

S 513

：A

2015-12-15

國家自然科學基金項目(U1204316)；國家“863”計劃項目(2012AA100300)

李浩川(1978-)，男，河南舞鋼人，副教授，博士，主要從事玉米遺傳育種研究。

劉宗華(1960-), 男，河南三門峽人，教授，博士生導(dǎo)師。

1000-2340(2016)02-0161-06