徐兵兵，倪 穗

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

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野生黃精的多糖含量測(cè)定及提取工藝研究

徐兵兵，倪 穗*

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)測(cè)定了寧波四明山區(qū)野生黃精的多糖含量，并對(duì)水煎煮法提取黃精多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)獲得了提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)黃精多糖得率的影響；在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化黃精多糖提取工藝。研究結(jié)果表明，寧波野生黃精多糖的含量為25.09%；各因素對(duì)黃精多糖得率的影響不同，液料比對(duì)黃精多糖得率的影響最大，其次是提取溫度和提取時(shí)間。黃精多糖最佳提取工藝為：提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為2 h，液料比為20∶1，在該條件下，黃精多糖得率為27.43%。為黃精多糖的開(kāi)發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

野生黃精；多糖；含量測(cè)定；提取工藝

黃精(PolygonatumsibiricumRed.)別名老虎姜、雞頭參，為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)的多年生草本植物，是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥，屬于藥食同源性中草藥[]。黃精的根狀莖黃白色，味稍甜，肥厚而橫走，直徑達(dá)3 cm，由數(shù)個(gè)或多個(gè)形如雞頭的部分連接而成為大頭小尾狀，節(jié)明顯，節(jié)部生少數(shù)根。其根莖供藥用，《中華人民共和國(guó)藥典》(2000年版，一部)收載的黃精來(lái)源于百合科黃精屬的黃精、多花黃精(P.cyrtonemaHua.)和滇黃精(P.kingianumColl．et Hemsl.)的干燥根莖[2]。傳統(tǒng)醫(yī)藥認(rèn)為，黃精性平、味甘，具有補(bǔ)腎益精、滋陰潤(rùn)燥之功效，用于滋補(bǔ)強(qiáng)身和治療腎虛精虧、肺虛燥咳以及脾胃虛弱之證，是中醫(yī)常用藥物之一[3]。

黃精在我國(guó)分布廣，主要分布在我國(guó)的西南、東北、內(nèi)蒙古以及安徽、浙江等地。但黃精的適應(yīng)性較差，生境選擇性強(qiáng)，喜生于土壤肥沃、表層水分充足、蔭蔽、上層透光性充足的林緣、灌叢和草叢或林下開(kāi)闊地帶[4]。黃精根莖的化學(xué)成分主要有黃精多糖、甾體皂苷、維生素和多種對(duì)人體有用的氨基酸等。其中多糖是黃精根莖中的主要成分，含量最高，但由于生存環(huán)境的差異，各地產(chǎn)的黃精其多糖含量有所不同，如泰山生黃精為 12.56%，安徽生黃精為 9.92%，泰山熟黃精為7.36%，浙江生黃精為8.54%[5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明黃精多糖具有抗衰老作用、抗腫瘤作用、增強(qiáng)免疫力、降血糖、降血脂及抗氧化損傷等作用[6-8]。

由于黃精多糖具有多種生物活性，且無(wú)明顯毒副作用，使得黃精成為天然的藥物和保健食品。隨著對(duì)黃精應(yīng)用研究的不斷深入，黃精多糖的用途大大拓寬，除藥用而外，還可加工成食品、飲料、保健品、護(hù)膚品等。近年來(lái)，各地黃精的多糖含量測(cè)定及提取方法研究?jī)H見(jiàn)零星報(bào)道，鮮有對(duì)寧波地產(chǎn)的野生黃精進(jìn)行研究。本文采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)[9]測(cè)定了寧波四明山區(qū)野生黃精的多糖含量，并對(duì)水煎煮法提取黃精多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為寧波的野生黃精開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黃精塊根采挖于浙江寧波的四明山區(qū)。塊根清洗后于60 ℃烘干，粉碎過(guò)40目篩，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

苯酚、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、乙醇、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、鹽酸、葡萄糖等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；L600臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)、AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.3研究方法

1.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制

準(zhǔn)確稱取100 mg的無(wú)水葡萄糖置于100 mL的容量瓶中，溶解并稀釋至刻度,混勻,得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2DNS顯色劑的配制

甲液：溶解2.3 g苯酚于5 mL、10% NaOH溶液中并稀釋到23 mL，在此溶液中加入2.3 g Na2SO3;乙液：稱取85 g酒石酸鉀鈉加入100 mL 10%的NaOH中，再加入293 mL、1%的3,5-二硝基水楊酸溶液。將甲乙溶液相混合，即得黃色溶液，貯于棕色試劑瓶，室溫下陰暗處放置7～10 d后使用[10]。

1.3.3DNS法測(cè)定黃精多糖含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：依次精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL濃度為1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別置50 mL容量瓶中，利用蒸餾水補(bǔ)水至2 mL，再精密加入1.5 mL DNS試劑，混勻，于沸水浴中煮沸5 min，取出立即冷卻，加水至刻度，搖勻。測(cè)定其在500 nm下吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液的制備及多糖含量的測(cè)定：分別取0.5 g烘干黃精粉末兩份于錐形瓶中(樣品液1、樣品液2)，樣品液1加入10 mL濃度為6 mol·L-1的鹽酸與15 mL的蒸餾水搖勻，樣品液2加入25 mL的蒸餾水搖勻，水浴加熱30 min。冷卻后，樣品液1加1滴酚酞指示劑，用10% 氫氧化鈉溶液中和至微紅色，過(guò)濾后，濾液定容至100 mL備用。樣品液2直接過(guò)濾，濾液定容至100 mL備用。平行移取樣品液1、2各3份，每份2 mL，按照上述方法測(cè)定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖含量。多糖含量計(jì)算公式：

式中：m1為樣品液1轉(zhuǎn)換為葡萄糖的質(zhì)量(mg)，m2為樣品液2轉(zhuǎn)換為葡萄糖的質(zhì)量(mg)，M為黃精粉末質(zhì)量，n為稀釋倍數(shù)，0.9為葡萄糖對(duì)多糖的校正系數(shù)。

1.3.4黃精多糖的提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1黃精多糖提取[11]

精確稱取黃精粉末5.0 g加入到燒杯中，按照一定的液料比為向燒杯中加入蒸餾水，將燒杯放置在一定溫度的恒溫水浴鍋中提取一定時(shí)間，提取結(jié)束后趁熱抽濾，得到濾液，將濾液合并并濃縮至20 mL，緩慢加入乙醇，并迅速攪拌至含醇量達(dá)80%，離心10 min，過(guò)濾后取沉淀，干燥后得到黃精粗糖，精確稱重記錄多糖得率。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

1.3.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

影響多糖得率的因素主要是提取時(shí)間、浸提比、提取次數(shù)、溫度、pH 值、溶劑和攪拌等[12]。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察提取溫度、提取時(shí)間、液料比多黃精多糖得率的影響[13]。提取溫度對(duì)黃精多糖得率的影響：精確稱取黃精粉末5.0 g，在提取時(shí)間為2 h，液料比為20∶1的條件下，考察不同提取溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)對(duì)黃精多糖進(jìn)行提取；提取時(shí)間對(duì)黃精多糖得率的影響：精確稱取黃精粉末5.0 g，在液料比為20∶1，提取溫度為80℃的條件下，考察不同提取時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)對(duì)黃精多糖進(jìn)行提??；液料比對(duì)黃精多糖得率的影響：精確稱取黃精粉末5.0 g，在提取時(shí)間為2 h，提取溫度為80 ℃的條件下，考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)對(duì)黃精多糖得率的影響。

1.3.4.3正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、提取時(shí)間、液料比作為變量，以黃精多糖得率為考察指標(biāo)，按照L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的黃精多糖提取工藝因素水平表如表1所示。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1野生黃精的多糖含量

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，擬合得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.478 4x-0.021 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，葡萄糖在500 nm處，0.2～1.4 mg范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所得的黃精多糖含量為25.09%。

2.2黃精多糖的提取工藝優(yōu)化

2.2.1提取溫度對(duì)黃精多糖得率的影響

在液料比為20∶1、提取時(shí)間為2 h的條件下，不同的提取溫度對(duì)黃精多糖提取的影響見(jiàn)圖2。

圖2　溫度對(duì)黃精多糖得率的影響

從圖2可見(jiàn)，隨著提取溫度上升，黃精多糖得率逐漸升高，這是因?yàn)槎嗵堑娜芙舛入S著溫度的升高而增大，在提取溫度為50～90 ℃范圍內(nèi)，黃精多糖的溶解性對(duì)溫度具有較高的敏感性，表現(xiàn)出明顯的增幅變化。但當(dāng)提取溫度大于90 ℃時(shí)，多糖得率反而隨溫度的升高反而緩慢降低，所以提取溫度應(yīng)選擇90 ℃為宜。

2.2.2提取時(shí)間對(duì)黃精多糖得率的影響

在液料比為20∶1，提取溫度為80 ℃的條件下，不同的提取時(shí)間對(duì)黃精多糖提取的影響見(jiàn)圖3。

圖3　時(shí)間對(duì)黃精多糖得率的影響

如圖3所示，提取時(shí)間在1～2 h范圍內(nèi)，多糖得率迅速上升，2 h時(shí)多糖得率達(dá)到最大值；而提取時(shí)間大于2 h多糖得率隨提取時(shí)間的增大反而下降，在4～6 h多糖得率基本保持不變，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇2 h為最佳提取時(shí)間。

2.2.3液料比對(duì)黃精多糖得率的影響

在提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為2 h的條件下，不同液料比對(duì)黃精多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

從圖4可見(jiàn)，隨著液料比的增加，多糖得率逐漸升高。原因可能是液料比上升，溶劑體積增大，多糖易擴(kuò)散于溶劑中，當(dāng)液料比為15∶1時(shí)，多糖得率最高，隨后多糖得率有所下降。因此，黃精多糖提取適宜的液料比為15∶1。

圖4　液料比對(duì)黃精多糖得率的影響

2.2.4正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇液料比、提取溫度、提取時(shí)間作為變量，以黃精多糖得率為考察指標(biāo)，按照L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的黃精多糖提取工藝因素水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)黃精多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

據(jù)表2，因素組合為A1B3C3時(shí)多糖得率最大。對(duì)于A因素有k1>k3>k2，表明提取溫度為80℃時(shí)提取率最高；對(duì)于B因素有k2>k3>k1，表明提取時(shí)間為2 h時(shí)最好；對(duì)于C因素有k3>k2>k1，表明液料比為20∶1時(shí)提取率最高。

綜上所述，3個(gè)因素的最優(yōu)組合是A1B2C3，即提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為2 h、液料比為20∶1。根據(jù)極差分析，影響多糖得率主次因素排序是：C>A>B，即液料比>提取溫度>提取時(shí)間。根據(jù)方差分析[14]，液料比對(duì)多糖得率有顯著影響，屬于主要影響因素，提取溫度與提取時(shí)間對(duì)多糖得率無(wú)顯著影響，屬于次要因素。

2.2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)水平和直觀分析的最優(yōu)水平不一致，因此進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，在正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)水平條件下對(duì)黃精多糖進(jìn)行提取，所得的黃精多糖得率為27.43%，結(jié)果高于直觀分析的多糖得率，表明此優(yōu)化工藝可行[15]。

3　結(jié)論與討論

采用DNS法對(duì)寧波四明山區(qū)野生黃精中的多糖含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：寧波野生黃精多糖含量為25.01%。傳統(tǒng)的多糖含量的比色測(cè)定方法主要是苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法[16]。這兩種方法只能測(cè)定樣品中的總糖含量，樣品中存在單糖影響實(shí)驗(yàn)效果，若不能完全除去單糖，容易使得測(cè)得的數(shù)據(jù)偏大，且操作繁雜，DNS法測(cè)多糖含量時(shí)，只需同時(shí)測(cè)定總糖與單糖的含量，兩者之差則為準(zhǔn)確的多糖含量。該法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、雜質(zhì)干擾較小[17]。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)黃精多糖得率的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)得到水煎煮法提取黃精多糖的最優(yōu)工藝條件：液料比20∶1，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為2 h，在該條件下，黃精多糖得率為27.43%。水煎煮法提取黃精多糖的過(guò)程中，液料比是影響多糖提取的主要因素。在提取過(guò)程中用80%乙醇醇沉用以除去單糖，低聚糖，苷類及生物堿等成分，避免雜質(zhì)成分影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)真實(shí)準(zhǔn)確。提取后的黃精多糖生物活性尚待進(jìn)一步研究。

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Content Determination and Extraction Process of Polysaccharides from WildPolygonatumsibiricum

Xu Bingbing, Ni Sui*

(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this article, DNS method was adopted to determine the content ofPolygonatumsibiricumpolysaccharides and the process of water extracting was optimized. This effects of liquid-material ratio, extraction temperature and extraction time ofPolygonatumsibiricumpolysaccharides yield were investigated by the single factor experiment, and the parameter of extracting was determined by four-factor and three levels orthogonal experiment. The result indicates that the content of Ningbo wildPolygonatumsibiricumpolysaccharide is 25.09%; the various factors have different influences on the extraction, and the liquid-material ratio has the greatest impact, followed by extraction temperature and extraction time. Results show that the optimum process parameters are liquid-material ratio 20∶1,extraction temperature 80℃, and extraction time 2 h. In this condition,Polygonatumsibiricumpolysaccharides yield is 27.43%. This research provides a scientific basis for the further development and utilization ofPolygonatumsibiricumpolysaccharides.

wildPolygonatumsibiricumRed.; polysaccharides; determination of content;extraction process

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.04.005

2016-01-28

寧波市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014C10059)；慈溪市農(nóng)業(yè)與社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(CN2014004)。

徐兵兵(1994—)，男，本科生，研究方向：植物生物技術(shù)。E-mail: 1286624023@qq. com

倪穗，女，教授，研究方向：植物生物技術(shù)。E-mail: nisui@ nbu.edu. cn

R284.2

A

1006-9690(2016)04-0019-04