吳斯宇，黃健妮，崔 進(jìn)，馮賽祥，歐陽國文，向程威，郭 旸，廖 明，焦培榮

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣州510642）

·研究論文·

雞β干擾素的原核表達(dá)及抗病毒活性檢測(cè)

吳斯宇，黃健妮，崔 進(jìn)，馮賽祥，歐陽國文，向程威，郭 旸，廖 明，焦培榮

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣州510642）

根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對(duì)GenBank中發(fā)表的雞β干擾素基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化與人工合成，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-ChIFN-β，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性和鎳柱親和純化后，SDS-PAGE、Western blot分析表明pET-28b-ChIFN-β表達(dá)正確，并且表達(dá)量較高。重組雞β干擾素蛋白在DF-1細(xì)胞上能明顯抑制水皰性口炎病毒繁殖，抗病毒活性達(dá)2.73×106UI/mg。本研究結(jié)果為雞β干擾素在臨床防治禽類病毒性疾病的探索奠定了基礎(chǔ)。

雞β干擾素； 原核表達(dá)； 抗病毒活性

干擾素（interferon，IFN）是一類重要的細(xì)胞因子，是由生物體細(xì)胞受到病毒或其他誘生劑的作用而產(chǎn)生的分泌性蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。與哺乳動(dòng)物相似，雞的干擾素也有α、β、γ三種類型。Sekellick等［1］1994年首次成功克隆和表達(dá)出了雞干擾素基因。1995年Digby等［2］克隆出雞γ干擾素基因。Sikc等［3］隨后克隆出雞β干擾素（chicken interferon-β，ChIFN-β）基因。近年來很多國內(nèi)學(xué)者也開展了雞干擾素的抗病毒研究。陳紅英等［4］克隆出了羅曼雞α干擾素基因，并通過原核表達(dá)獲得了具有抗病毒活性的干擾素。戴華等［5］通過原核表達(dá)獲得了能夠抑制H5N1禽流感病毒的雞α干擾素。王黎霞等［6］克隆出了海藍(lán)灰蛋雞的γ干擾素基因并成功進(jìn)行了原核表達(dá)。何靜等［7］將雞α干擾素基因與白細(xì)胞介素18基因融合表達(dá)獲得了具有抗病毒活性的融合蛋白。目前國內(nèi)大部分的研究主要集中在重組雞α干擾素的表達(dá)和活性分析，但關(guān)于雞β干擾素的研究相對(duì)較少［8］。禽流感、新城疫等禽類病毒性疾病在我國時(shí)有發(fā)生，其病原變異快，增加了藥物預(yù)防和疫苗免疫的難度，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此迫切需要研制廣譜抗病毒生物制劑來防治禽類病毒性疾病。研究表明雞β干擾素具有良好的抗病毒生物活性，可以作為一種廣譜的抗病毒生物制劑。

本研究根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對(duì)GenBank中發(fā)表的雞β干擾素基因序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，人工合成該雞β干擾素基因，成功構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后該蛋白以包涵體的形式表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示雞干擾素成功表達(dá)，細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)顯示其抗病毒效價(jià)達(dá)2.73×106UI/ mg。

1　材料與方法

1.1菌種與病毒 E.coli/DH5α、BL21（DE3）、水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2質(zhì)粒及相關(guān)酶 pET-28b為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制酶EcoR I、Nde I及T4 DNA連接酶等購置于寶生物工程（大連）有限公司；DNA片段快速回收試劑盒購于天根生化科技有限公司。

1.3雞β干擾素基因的獲得及密碼子的優(yōu)化 參照NCBI中已發(fā)表的雞β干擾素基因序列（AHB60 416.1），根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對(duì)去除信號(hào)肽序列的干擾素基因進(jìn)行密碼子的優(yōu)化，優(yōu)化后的序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

根據(jù)密碼子優(yōu)化后的雞β干擾素基因，利用primer primier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。ChIFN-β- NdeI - UP（上游引物）：5'-AGCCATATGATGTGTAATCACCT GCGTCA -3'；ChIFN-β- EcoRI -DOWN（下游引物）：5'-AAGGAATTCTTATTGGGTATTCAGACG TT -3'

1.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以合成的雞β干擾素基因?yàn)槟０?，采用含Nde I酶切位點(diǎn)的ChIFN-β-F，含EcoR I酶切位點(diǎn)的ChIFN-β-R為引物，用PCR擴(kuò)增雞β干擾素基因。pET-28b載體、PCR產(chǎn)物經(jīng)Nde I、EcoR I雙酶切回收，連接，獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過卡那霉素抗性篩選、PCR及Nde I、EcoR I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，鑒定正確的重組質(zhì)粒送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.5重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和鑒定 將測(cè)序正確的雞β干擾素重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，PCR檢測(cè)確認(rèn)插入片段是否為目的基因。

1.6重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的表達(dá)菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)至OD值為0.6時(shí)，以終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。8000×g離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE以及Western blot分析。

1.7表達(dá)產(chǎn)物的提取與純化

1.7.1包涵體的提取與處理 取1 L誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌E.coli/pET-28b-ChIFN-β，以8000×g離心收集菌體，按1:5的比例加入菌體超聲緩沖液（0.05 mol/ L Tris、0.0005 mol/L EDTA、0.05 mol/L NaCl，pH7.0）重懸菌體，冰浴條件下，充分超聲破碎，然后于4℃、12 000×g 離心15 min，收集沉淀（沉淀即為粗制包涵體）。離心收集的包涵體用洗滌緩沖液1（0.05 mol/L Tris-HCl、0.5% TritonX-100、0.5 mol/L NaCl，pH8.0）充分懸浮，磁力攪拌30 min后，4℃、12 000×g離心20 min。然后依次用洗滌緩沖液2（0.05 mol/L Tris-HCl、2 mol/L Uera、1%巰基乙醇、0.002 mol/L EDTA、0.15 mol/L Nacl、pH8.0）、洗滌緩沖液3（0.05 mol/L Tris- HCl、4 mol/L Uera、0.005 mol/L DTT、0.5 mol/L NaCl，pH8.0）對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌。

1.7.2包涵體變性 使用含8 mol/L尿素的變性液（0.05mol/L Tris-HCl、8 mol/L Uera、0.005 mol/L DTT，pH8.0）按1:5的包涵體變性液比例將洗滌后的包涵體溶解于變性液中。室溫磁力攪拌6 h，然后以4℃、12 000×g離心20 min，收集變性液上清，4℃保存。

1.7.3變性液復(fù)性 采取梯度稀釋法進(jìn)行蛋白復(fù)性，把收集的變性液上清按1:20加至預(yù)冷的復(fù)性液中（0.015 mol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、0.3 mol/ L L-Arg、0.001 mol/L GSSG、0.005 mol/L GSH、10%甘油，pH7.0）。復(fù)性時(shí)采用滴管懸滴法，逐滴向復(fù)性液中加入變性液，同時(shí)磁力攪拌5 min，而后轉(zhuǎn)入4℃冰箱，靜置復(fù)性24 h。

1.7.4鎳柱親和純化 復(fù)性完成后，復(fù)性液經(jīng)透析以除去L-Arg（會(huì)影響蛋白鎳柱結(jié)合），參照QIAGEN公司鎳柱純化說明書純化含有His Tag的目的蛋白。

1.7.5SDS-PAGE、Western blot檢測(cè) 將SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC），用His標(biāo)簽抗體（1:2000稀釋）作為一抗，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠（1:10 000稀釋）作為二抗，Western blot檢測(cè)目的蛋白。

1.8重組ChIFN-β抗病毒活性測(cè)定 采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定重組雞干擾素的活性。將DF-1細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層。96孔板的12列分為3組，第1組（第1列）為陽性病毒對(duì)照組，第2組為干擾素試驗(yàn)組（第2～11列），第3組為正常細(xì)胞對(duì)照組（第12列）。首先干擾素試驗(yàn)組每列分別加入4倍系列稀釋（41～410）的重組干擾素（每孔100 μL），第1、第3組只作換液處理。培養(yǎng)12 h后，第1、2組每列分別加入1000TCID50的VSV（TCID50為7.32），第3組只作換液處理。培養(yǎng)至24 h后開始觀察細(xì)胞病變，待陽性病毒對(duì)照組出現(xiàn)明顯病變時(shí)（一般為48～60 h）記錄結(jié)果［5］。以能抑制50%細(xì)胞發(fā)生病變的最高稀釋度的倒數(shù)作為抗VSV的病毒活性單位，采用Reed-Muench法計(jì)算重組雞β干擾素蛋白抗VSV的病毒活性單位。

2　結(jié)果

2.1重組雞β干擾素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 重組陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoR I、Nde I雙酶切鑒定，雙酶切后片段在500 bp與750 bp間，與目的片段534 bp相符。陽性質(zhì)粒送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與優(yōu)化的雞β干擾素的序列比對(duì)分析，表明重組雞β干擾素原核表達(dá)質(zhì)粒得到成功構(gòu)建。

2.2重組雞β干擾素的誘導(dǎo)表達(dá)分析 重組菌E.coli/ pET-28b-ChIFN-β經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)的蛋白通過SDS-PAGE 、Western blot分析，證實(shí)目的蛋白表達(dá)成功，且主要以包涵體的形式表達(dá)，所得重組蛋白的分子質(zhì)量約21 kDa，與預(yù)測(cè)的目的蛋白大小相符，說明重組雞β干擾素表達(dá)正確。

圖1　重組蛋白SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)Fig. 1 SDS-PAGE and Western blot analysis of the expressed protein

2.3重組雞β干擾素的復(fù)性、純化結(jié)果 包涵體經(jīng)過尿素變性、復(fù)性、透析、鎳柱純化后，進(jìn)行SDSPAGE分析，結(jié)果顯示純化的目的蛋白的分子量約21 kDa，與預(yù)期相符。

圖3　純化重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the expressed protein purifi ed by nickel affi nity chromatography

2.4重組雞β干擾素的抗病毒活性測(cè)定結(jié)果 細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示重組雞β干擾素蛋白具有抑制VSV繁殖的抗病毒活性（圖4），采用Reed-Muench法計(jì)算得重組雞β干擾素蛋白抗VSV活性為2.73×106UI/mg。

圖4　重組雞β干擾素蛋白抗病毒活性Fig. 4 Antiviral activities of recombinant ChIFN-β protein in DF-1 cell lines

3　討論

干擾素是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中重要的一員，其介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)是天然免疫系統(tǒng)第一道防線。病毒入侵時(shí)，機(jī)體細(xì)胞可以通過細(xì)胞內(nèi)外的模式識(shí)別受體對(duì)病毒進(jìn)行識(shí)別，然后激活與干擾素相關(guān)的天然免疫信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素基因的表達(dá)。表達(dá)的干擾素又可以與其他細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗病毒信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而有效抵抗病毒的入侵［9-13］。自干擾素被發(fā)現(xiàn)以來，人類對(duì)干擾素的應(yīng)用進(jìn)行了多年深入的研究。人類干擾素的應(yīng)用研發(fā)歷史可以分為三個(gè)階段，第一階段是天然原型干擾素，主要采用病毒誘導(dǎo)離體的人白細(xì)胞和人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系合成干擾素，然后分離純化干擾素。其缺點(diǎn)是白細(xì)胞來源少；誘導(dǎo)出來的干擾素是各個(gè)亞型的混合物，療效一般；有病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。第二階段是重組干擾素。20世紀(jì)80年代起研究人員已探索出干擾素的克隆以及基因改造的技術(shù)，因此主要采用基因工程和重組技術(shù)大量制備人類干擾素，同時(shí)提高了制品的純度和效價(jià)，但重組干擾素在體內(nèi)的半衰期短，易被清除。第三階段是長(zhǎng)效干擾素的研制。在第二階段的基礎(chǔ)上，采用PEG化修飾、白蛋白融合技術(shù)制備，改善了藥代動(dòng)力學(xué)過程，提高了療效［14］。目前人類干擾素已經(jīng)大規(guī)模臨床應(yīng)用于治療多種病毒性疾病，如乙型肝炎等，并取得了很好的療效。

與人類干擾素生物學(xué)功能類似，重組雞干擾素是通過對(duì)自身免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來達(dá)到抗病毒的目的。與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物、疫苗等獸用抗病毒生物制品相比，它不會(huì)使病原產(chǎn)生耐藥性突變和藥物殘留，因此近年來重組雞干擾素的研究也越來越受到重視。目前的研究大多集中在雞α干擾素的克隆表達(dá)以及抗病毒試驗(yàn)，還不具備大規(guī)模應(yīng)用的條件。對(duì)于雞β干擾素原核表達(dá)以及抗病毒活性研究也較少。

本研究通過原核表達(dá)的方式表達(dá)并純化出了重組雞β干擾素蛋白，采用細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)其抑制VSV繁殖的抗病毒活性，活性單位達(dá)到2.73×106UI/mg。這一結(jié)果為重組雞β干擾素生物功能的研究及相關(guān)生物制品的研制奠定了基礎(chǔ)。

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND ANTIVIRAL EFFECT OF CHICKEN INTERFERON- β

WU Si-yu， HUANG Jian-ni， CUI Jin， FENG Sai-xiang， OUYANG Guo-wen， XIANG Cheng-wei，GUO Yang， LIAO Ming， JIAO Pei-rong

（National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control， College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Chicken interferon-β （ChIFN-β） gene sequence from GenBank was optimized and synthesized based on the codon preference of E.coli. The ChIFN-β gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28b. Analysis of SDS-PAGE and Western blot indicated that pET-28b-ChIFN-β was correctly and highly expressed in E. coli induced with IPTG. The expressed protein was purifi ed via nickel affi nity chromatography after being denatured and re-natured. The purifi ed recombinant ChIFN-β protein was able to inhibit vesicular stomatitis virus replication at 2.73×106UI/mg on DF-1 cells. The results of the present study would be benefi t to the research of chicken interferon β regarding prevention and treatment of avian viral diseases.

Chicken interferon-β； prokaryotic expression； antiviral effect

S852.42

A

1674-6422（2016）04-0059-05

2016-04-15

科技部國際合作項(xiàng)目（2013DFA31940）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013J4500030、201300000037）

吳斯宇，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

焦培榮，E-mail：prjiao@scau.edu.cn；廖明，E-mail：mliao@scau.edu.cn